Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi
22 Mayıs 2020
Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.
Hücre bazlı tahlil, uzun protein saflaştırmalarına veya özel ekipmana ihtiyaç duymadan trans adezyon etkileşimlerinin gözlemlenmesine ve miktarının belirlenmesine izin verir. Burada test edilen protein etkileşimleri nörobiyoloji ile ilgili olsa da, bu yöntem protein yapışmasının hücreler arası olarak meydana geldiği herhangi bir araştırma alanına uygulanabilir. HEK-293T hücrelerinin transfekte edilmesinden 48 saat sonra, hücreleri agregasyon için altı oyuklu plakadan hasat edin.
İlk olarak, her bir kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri nazikçe ayırmak için, her oyuğa bir mililitre 10 milimolar EDTA ekleyin, ardından plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Beş dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe vurun ve her bir kuyuyu ayrı bir 15 mililitrelik konik tüpe koyun.
Tüpleri oda sıcaklığında 500 x g'da beş dakika santrifüjleyin. Hücreler peletlenirken, mikrosantrifüj tüplerinin üst kısımlarını deney koşullarıyla etiketleyerek altı inkübasyon tüpü hazırlayın. GFP ve mCherry'nin her permütasyonu kullanılmalıdır.
Süpernatanı 15 mililitrelik konik tüplerden çıkarın ve hücreleri 500 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak, her bir konik tüpteki hücreleri sayın. Daha sonra, toplam 500 mikrolitre hacminde bire bir karışım için her koşuldan 200.000 hücreyi uygun inkübasyon tüpüne alın.
Bir sonraki bölümde açıklanan temel agregasyonu değerlendirdikten sonra, inkübasyon tüplerini oda sıcaklığında yavaş bir tüp döndürücüye yerleştirin. Agregasyonu değerlendirmek için, başlangıçta ve 60 dakika sonra tekrar, inkübasyon tüpünden 40 mikrolitreyi yüklü bir mikroskop lamına pipetleyin. Temel edinim, hücrelerin mikrosantrifüj tüpüne eklenmesinden sonra mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.
Slaytı hem yeşil hem de kırmızı kanallarda floresan altında görüntüleyin. Her slayt için, tek bir odak düzleminde üç farklı görüş alanının görüntülerini yakalayın. HEK-293T hücreleri, ilgilenilen bir protein, ilgilenilen mutasyona uğramış bir protein veya ilgilenilen bir ligand ile transfekte edildi ve bir floresan proteini ile birlikte transfekte edildi.
İlgilenilen proteini ifade eden hücre popülasyonları, ilgilenilen ligandı ifade eden hücre popülasyonları ile karıştırıldı ve 60 dakika sonra agregasyon için değerlendirildi. Yeşil ve kırmızı kanallarda yakalanan görüntü katmanlarında, toplama sarı punkta olarak görünür. Hücrelerin herhangi bir sinaptik ligand eksprese etmediği koşullar minimal agregasyon gösterdi.
Ayrıca, iki popülasyondan sadece biri sinaptik ligandları eksprese ettiğinde minimal agregasyon sergilendi. İki hücre popülasyonu uyumsuz adezyon molekülleri eksprese ettiğinde herhangi bir agregasyon sergilenmedi. Uyumlu yapışma moleküllerine sahip koşullar, 60 dakikalık bir inkübasyondan sonra önemli bir agregasyon sergiledi.
Şaşırtıcı bir şekilde, ilgilenilen mutasyona uğramış protein, vahşi tip muadilinden önemli ölçüde daha fazla agregasyon sergiledi, bu da nokta mutasyonunun proteinlerin bağlanma yeteneklerini arttırdığını düşündürdü. Birçok adezyon molekülündeki mutasyonlar genellikle nörogelişimsel, nöropsikiyatrik ve bağımlılık bozuklukları ile bağlantılıdır. Bu teknikle, hastalıkla ilgili nokta mutasyonlarının trans etkileşimler üzerindeki etkileri taranabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, HEK-293T hücrelerinde floresan mikroskopi yaklaşımını kullanarak, trans durumunda ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı kantitatif olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunar. Yöntem, sinirbilim ve potansiyel olarak diğer araştırma alanları için önemli olan protein yapışma etkileşimlerinin kantitatif analizini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre yapışması
- Protein etkileşimleri
Arka Plan
- Ligand-reseptör etkileşimleri, hücresel iletişim için kritiktir.
- Bu etkileşimleri anlamak, sinirgelişimsel ve sinirpsikiyatrik bozuklukların mekanizmalarının açıklığa kavuşturulmasına yardımcı olur.
- Geleneksel yöntemler, kapsamlı protein saflaştırma veya özel ekipman gerektirebilir.
- Bu çalışma, floresan mikroskopi kullanarak daha verimli bir yaklaşım önermektedir.
Çalışmanın Amacı
- Hücre bazlı bir tahlile protein yapışmasını incelemek için hızlı ve etkili bir protokol geliştirmek.
- Proteinlerdeki nokta mutasyonlarının trans etkileşimlerini nasıl etkilediğini değerlendirmek.
- Bu yöntemi, sinirbilim dışında protein yapışma çalışmalarında geniş çapta uygulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre etkileşimlerini görselleştirmek için floresan mikroskopi kullanılmıştır.
- Biyolojik model olarak HEK-293T hücreleri kullanılmıştır ve transfekte edilen proteinler ve ligandlar üzerinde odaklanılmıştır.
- Deney zaman çizelgesi, transfeksiyon sonrası 60 dakikadan sonra hücre agregasyonunun değerlendirilmesini içermiştir.
- Hücre sayımı, bir hemokiyometre kullanılarak gerçekleştirilmiş, ardından hücreler resüspanse edilmiş ve görüntüleme için karıştırılmıştır.
Ana Sonuçlar
- Uyumlu yapışma moleküllerini ifade eden hücrelerin agregasyonu, 60 dakika sonrasında önemli ölçüde artmıştır.
- Mute mutasyonları, yabani tip karşılıklarına göre daha fazla agregasyon göstermiştir, bu da gelişmiş bağlanma kabiliyetlerini gösterir.
- Eğer hiçbiri veya sadece bir popülasyon sinaptik ligandlar ifade ediyorsa minimal agregasyon gözlenmiştir.
Sonuçlar
- Bu çalışma, hücreler arası yapışma etkileşimlerini değerlendirmek için yöntemleştirilmiş bir yöntem göstermektedir.
- Bulgular, bu tekniğin protein etkileşimleri üzerindeki mutasyonların etkilerini keşfetmede potansiyeli olduğunu vurgulamaktadır.
- Bu yöntemden elde edilen bilgiler, çeşitli sinirgelişimsel ve psikolojik bozuklukların altında yatan mekanizmaları anlamak için değerlidir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This assay enables direct measurement of trans protein-protein interactions in a cellular context, addressing a key limitation of biochemical assays that cannot distinguish cis from trans binding. By quantifying only physiologically relevant intercellular adhesion, the method improves target validation confidence and reduces false positives in early discovery. It supports mechanistic de-risking of adhesion targets implicated in neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring functional trans adhesion between ligand and receptor pairs expressed on separate cells.
- Operational Value: Eliminates need for protein purification, enabling rapid screening of mutants or variants directly in a cellular system.
- Predictive Value: Enhanced aggregation with a disease-linked mutation demonstrates how the assay can identify gain-of-function variants for prioritization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescently tagged HEK cells to generate quantifiable imaging readouts (e.g., yellow puncta in overlays) for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Standardized cell mixing and incubation conditions allow consistent aggregation measurements across experiments.
- Scalability: Protocol supports testing multiple conditions (e.g., wild-type vs. mutant, ligand combinations) in parallel using simple mixing and imaging steps.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly tests how point mutations in adhesion molecules—common in neurodevelopmental, neuropsychiatric, and addiction disorders—affect trans interactions.
- Translational Continuity: Bridges in vitro binding assays to cellular phenotypes, supporting go/no-go decisions based on functional adhesion data.
- Mechanistic De-risking: Identifies whether mutations enhance or disrupt intercellular binding, informing target mechanism and safety profiling.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits between target engagement screening and functional validation, providing adhesion-specific data to inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Tests whether genetic variants alter intercellular adhesion, supporting pathway clarification and target hypothesis validation.
- Analytics: Generates quantitative imaging-based readouts (aggregate formation over time) to compare conditions and assess interaction strength.
- Translational Research: Links molecular changes to cellular phenotypes relevant to synapse formation and neuronal connectivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any intercellular protein adhesion system, making it a reusable platform across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures only trans interactions, reducing overestimation of binding seen in lysate-based assays and improving target specificity.
- Operational Value: Uses standard cell culture and fluorescence microscopy, requiring no specialized equipment or complex reagents.
- Strategic Value: Enables rapid assessment of mutation effects on target function, supporting better go/no-go decisions in lead identification.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying variants with altered adhesion that may influence efficacy or toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection, fluorescent protein tagging, and flow cytometry or hemocytometer-based cell counting.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-channel imaging capability (e.g., GFP and mCherry) and image analysis tools for aggregate quantification.
- Needs standardization of cell expression levels and mixing ratios to ensure reproducible aggregation readouts across teams.
- Adaptation to non-HEK systems may require optimization of transfection efficiency and adhesion molecule surface expression.
- Limited to assessing adhesion; does not report on downstream signaling or internalization events following binding.
