Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Hücre bazlı tahlil, uzun protein saflaştırmalarına veya özel ekipmana ihtiyaç duymadan trans adezyon etkileşimlerinin gözlemlenmesine ve miktarının belirlenmesine izin verir. Burada test edilen protein etkileşimleri nörobiyoloji ile ilgili olsa da, bu yöntem protein yapışmasının hücreler arası olarak meydana geldiği herhangi bir araştırma alanına uygulanabilir. HEK-293T hücrelerinin transfekte edilmesinden 48 saat sonra, hücreleri agregasyon için altı oyuklu plakadan hasat edin.

İlk olarak, her bir kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri nazikçe ayırmak için, her oyuğa bir mililitre 10 milimolar EDTA ekleyin, ardından plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Beş dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe vurun ve her bir kuyuyu ayrı bir 15 mililitrelik konik tüpe koyun.

Tüpleri oda sıcaklığında 500 x g'da beş dakika santrifüjleyin. Hücreler peletlenirken, mikrosantrifüj tüplerinin üst kısımlarını deney koşullarıyla etiketleyerek altı inkübasyon tüpü hazırlayın. GFP ve mCherry'nin her permütasyonu kullanılmalıdır.

Süpernatanı 15 mililitrelik konik tüplerden çıkarın ve hücreleri 500 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak, her bir konik tüpteki hücreleri sayın. Daha sonra, toplam 500 mikrolitre hacminde bire bir karışım için her koşuldan 200.000 hücreyi uygun inkübasyon tüpüne alın.

Bir sonraki bölümde açıklanan temel agregasyonu değerlendirdikten sonra, inkübasyon tüplerini oda sıcaklığında yavaş bir tüp döndürücüye yerleştirin. Agregasyonu değerlendirmek için, başlangıçta ve 60 dakika sonra tekrar, inkübasyon tüpünden 40 mikrolitreyi yüklü bir mikroskop lamına pipetleyin. Temel edinim, hücrelerin mikrosantrifüj tüpüne eklenmesinden sonra mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.

Slaytı hem yeşil hem de kırmızı kanallarda floresan altında görüntüleyin. Her slayt için, tek bir odak düzleminde üç farklı görüş alanının görüntülerini yakalayın. HEK-293T hücreleri, ilgilenilen bir protein, ilgilenilen mutasyona uğramış bir protein veya ilgilenilen bir ligand ile transfekte edildi ve bir floresan proteini ile birlikte transfekte edildi.

İlgilenilen proteini ifade eden hücre popülasyonları, ilgilenilen ligandı ifade eden hücre popülasyonları ile karıştırıldı ve 60 dakika sonra agregasyon için değerlendirildi. Yeşil ve kırmızı kanallarda yakalanan görüntü katmanlarında, toplama sarı punkta olarak görünür. Hücrelerin herhangi bir sinaptik ligand eksprese etmediği koşullar minimal agregasyon gösterdi.

Ayrıca, iki popülasyondan sadece biri sinaptik ligandları eksprese ettiğinde minimal agregasyon sergilendi. İki hücre popülasyonu uyumsuz adezyon molekülleri eksprese ettiğinde herhangi bir agregasyon sergilenmedi. Uyumlu yapışma moleküllerine sahip koşullar, 60 dakikalık bir inkübasyondan sonra önemli bir agregasyon sergiledi.

Şaşırtıcı bir şekilde, ilgilenilen mutasyona uğramış protein, vahşi tip muadilinden önemli ölçüde daha fazla agregasyon sergiledi, bu da nokta mutasyonunun proteinlerin bağlanma yeteneklerini arttırdığını düşündürdü. Birçok adezyon molekülündeki mutasyonlar genellikle nörogelişimsel, nöropsikiyatrik ve bağımlılık bozuklukları ile bağlantılıdır. Bu teknikle, hastalıkla ilgili nokta mutasyonlarının trans etkileşimler üzerindeki etkileri taranabilir.