Name: Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 47 s
Description: Öğrenin, HEK-293T hücrelerinde floresan mikroskopi kullanarak ligand-reseptör etkileşimlerini hızlıca ölçme yöntemini. Bu teknik, nörobiyolojide protein yapışma mekanizmalarını ve mutasyon etkilerini incelemek için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü'nden (R00MH103531 ve R01MH116901'den J.A.'ya), Ulusal Genel Tıp Enstitüsü'nden (T32GM007635'ten S.R.'ye) doktora öncesi eğitim Hibesi ve Lyda Hill Gilliam İleri Çalışma Bursu (GT11021'den S.R.'a) tarafından desteklendi. Mikroskopla ilgili yardımları için Dr. Kevin Woolfrey'e, epifluoresan mikroskopunun kullanımı için Dr. K Ulrich Bayer'e ve LRRTM2 plazmidi için Thomas Südhof'a (Stanford Üniversitesi) teşekkür ederiz.

1. Hücre kültürü ve transfeksiyon
<ol><li>DMEM, 1x (Dulbecco'nun Eagle's Medium Modifikasyonu) ile 4,5 g/L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ve %10 FBS ile desteklenmiş HEK hücre ortamı yapın. Steril filtre.</li>
	<li>Toplama tahlilleri için predetermin uygun ligandlar ve reseptörler. NOT: Bu çalışmada Neurexin3α SS4+/- ve bilinen ligandlarından biri olan LRRTM2 kullanılmıştır. Ligandlar ve ilgi reseptörleri pcDNA3.1'deki cDNA'lardan ifade edildi. Neurexin3α'yı pcDNA3.112'yeyerleştirmek için bir Gibson montajı kullanıldı. Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/ GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATCTGCAGAATTCTTACATAATACTCCTTGTCCTT.</li>
	<li>HEK293T hücrelerini hazırlayın.<ol>
<li>HEK293T hücrelerini tek bir T-75 şişesinde izdiah etmek için büyütün.</li>
		<li>Birleştiğinde, 2 mL tripsin kullanın ve 2 dakika boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin. Hücreleri yeniden çıkarmak için şişeye 6 mL HEK ortamı ekleyin ve 8 mL'nin tamamını 15 mL konik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>5 dakika boyunca 500 x g'da pelet ve toplam 8 mL için HEK hücre medyasında yeniden dirildi.</li>
		<li>Hücreleri sayın ve 6 kuyulu bir plakanın her kuyusuna 735.000 hücre ekleyin. HEK hücre ortamı kullanarak her kuyu için son ses seviyesini 2 mL'ye ayarlayın.</li>
		<li>37 °C inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin bir gecede veya% 50-60 izdiah edene kadar büyümesine izin verin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalsiyum fosfat yöntemini kullanarak HEK293T hücrelerini transfect13.<ol>
<li>Well-1'i 3 μg faiz proteini ile transfect ve 1 μg floresan protein (3 μg pcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4- ve 1 μg mCherry) ile birlikte transfect.</li>
		<li>1.4.1 adımında olduğu gibi well-2'ye transfect. ancak mutasyona uğramış ilgi proteini ile (pcDNA3.1-Neurexin3αA687T SS4-).</li>
		<li>3 μg faizli ligand ile well-3'ü transfect ve 1 μg başka bir floresan protein (3 μg pcDNA3.1 LRRTM2 ve 1 μg GFP).</li>
		<li>Negatif kontroller olarak hizmet etmek için kuyu-4 ve kuyu-5'i transfect: 1 μg GFP ile well-4 ve 1 μg mCherry ile well-5.</li>
		<li>Ek koşullar veya kontroller (Neurexin3αWT/A687T SS4+) gerekiyorsa başka bir plaka hazırlayın (adım 1.4.1-1.4.4'te olduğu gibi). NOT: Transfeksiyon verimliliği, bir epifluoresans mikroskobu altında transeksiyondan 24 saat sonra analiz edilir ve transektife edildikleri floresan proteini ifade eden hücre sayısı olarak ölçülür. Daha aerodinamik bir yaklaşım, HEK hücrelerinin floresan bir protein ve ilgi alanı için bicistronic vektör kodlaması ile transfectionını içerecektir ve ko-transfection üzerinde şiddetle tavsiye edilir. Bu çalışmada alfa Neurexins ~4.3 kb'dir ve ko-transfeksiyon gerektiren bir bicistronik sistem kullanılarak düşük floresan yoğunluğu gözlenmiştir.</li>
	</ol></li>
	<li>Transfection'dan 48 saat sonra, toplama için hücreleri toplar.<ol>
<li>PBS ile her kuyuya iki kez yıkayın.</li>
		<li>Hücreden hücreye etkileşimleri nazikçe ayırmak ve plakayı 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırmak için her kuyuya PBS'de 1 mL 10 mM EDTA ekleyin. NOT: Çalışmada yapışma moleküllerinin potansiyel proteolitik bölünmesi nedeniyle 1.5.2. adım için tripsin önerilmez. Ayrıca, EDTA eklendikten sonra, hücreler artık ortam koşullarına maruz kalacağından, protokol tamamlanana kadar durdurulmayabilir.</li>
		<li>Hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe dokunun ve her kuyuyu ayrı 15 mL konik tüpler halinde hasat edin.</li>
		<li>500 x g'da santrifüj konik tüpler ve 5 dakika oda sıcaklığında.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreler peletlenirken, her mikrosantrifüj tüpünün üstünü her koşulda etiketleyerek 6 kuluçka tüpü hazırlayın. NOT: GFP ve mCherry koşullarının her permütasyonu, tüm deneysel koşulları ve uygun kontrolleri kapsayacak şekilde kullanılmalıdır. Örneğin: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3αWT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3αA687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3αWT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Daha fazla koşul ve kontrole uyum sağlamak için ek tüpler yapın.</li>
	<li>10 mM CaCl 2 ve 10 mM MgCl 2 ile 37 °C'yeısıtılmış 500μL HEK ortamdaki süpernatant ve resuspend hücrelerini çıkarın. NOT: CaCl2 ve MgCl2'nin eklenmesi, yapışma moleküllerinin bağlamayı yeniden kurmasını sağlar ve yalnızca söz konusu hücrelerarası etkileşim ortakları yapışma için dalgıç katyonları gerektiriyorsa gereklidir.</li>
	<li>Her 15 mL konik tüpteki hücreleri bir hemositometre ve aliquot 200.000 hücre kullanarak, toplam 500 μL hacimde 1:1 karışım için adım 1.6.1'den uygun tüpe sayın. NOT: Saymak ve aliquot miktarları için koşul başına sadece 5 dakika sürmelidir.</li>
	<li>Tüpleri oda sıcaklığında yavaş bir tüp rotatorunda kuluçkaya yatırın.</li>
</ol>2. Görüntü alımı
<ol><li>Belirli numuneler için mikroskop alma parametrelerini optimize edin. Bu örnekte, görüntüler geniş alan mikroskopunda alınmıştır. 5x hava hedefi kullanın (NA: 0.15; WD: 20000 μm) analiz için yeterince büyük bir alan elde etmek için.</li>
	<li>1.8. adımda HEK hücrelerinin iki koşulunun karıştırılmasından hemen sonra taban çizgisi toplamayı değerlendirin. Bunlar artık 'sıfır zamanı' görüntüleri.<ol>
<li>Pipet 40 μL her örnek karışımın yüklü bir mikroskop slayt ve görüntü floresan altında hem 488 hem de 561 kanallarda.</li>
		<li>Örnek bırakma başına bir odak düzleminden üç farklı görüş alanı elde edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>'Time 60' görüntüsü olarak 60 dakikada son görüntüleri elde edin.<ol>
<li>60 dakikalık bir inkübasyondan sonra karışımın 'time 60' görüntüsünü elde etmek için, dönen tüplerden her durumun 40 μL'lik bir örneğini daha alın ve her numuneyi yüklü bir kaydırağa pipetleyin. Resim adım 2.2.2'deki gibi. NOT: Doygunluk gerçekleşene kadar hücre toplama her 15 dakikada bir kontrol edilmelidir. Toplamanın zamanlaması test edilen proteinlere bağlı olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ImageJ/Fiji Analizi
<ol><li>Fiji/ImageJ kullanarak toplamanın kapsamını ölçmek için analiz dosyalarını kaydedin.<ol>
<li>Sağlanan Ek kodlama dosyalarını bilgisayardaki imageJ makrolar klasörüne kaydedin.</li>
		<li>Sağlanan toplama makrosunu yükleyin (Eklentiler, Makrolar, Yükle ve "AggregationAssay.txt" dosyasını seçin).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eşikleri belirleyin.<ol>
<li>ImageJ'e 'sıfır zaman' .tif dosyası yükleyin ve kanalları bölün (Resim | Renk | Kanalları Böl). NOT: 'Sıfır süresi' görüntüsü, tüm deneme için eşik ve en küçük nokta boyutunu belirlemek için kullanılır.</li>
		<li>Her kanalı maskele (Eklentiler | Makrolar | AggregationAssay_MakeMask). Görüntüden Maske Yap penceresi görünecektir. Görüntü eşiğini belirle ve Histogram'dan Küme Paramlarını Belirle 'nin yanındaki onay kutuları tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>Slayt çubuğunu kullanarak görüntünün eşiğini belirleyin, sayıyı slayt çubuğunun sağ kısmına kaydedin ve Tamam 'ıtıklatın.</li>
		<li>Küme Boyutu histogramı görünecektir. Histogramdan denemeye uygun bir küme boyutu seçin, bu sayıyı En Küçük Küme Boyutu: kutusuna yazın ve Tamam 'ıtıklatın. Bu boyutun altındaki kümeler çözümlenmez.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizi çalıştır.<ol>
<li>ImageJ'de koşul 1'in 'time 60' görüntüsünü açın ve kanalları adım 3.2.1'deki gibi bölün.</li>
		<li>Her kanalı maskeleyin (Eklentiler, Makrolar, AggregationAssay_MakeMask). 3.2.3 ve adım 3.2.4'te belirlenen eşik ve boyutu kullanın. Görüntü eşiğini belirleme ve Histogram'dan Küme Paramlarını Belirleme'nin yanındaki kutuların seçimini kaldırın ve boyutu ve eşikleri uygun alanlara el ile yazın ve Tamam'ı tıklatın.</li>
		<li>Toplama dizinini hesaplama (Eklentiler | Makrolar | AggregationAssay_CalculateOverlap). Karşılaştırılacak maskelenmiş kanalları ve elde edilen dosyaların kaydedileceği dizini seçin.</li>
		<li>Her koşulda her 'zaman 60' görüntüsü için 3.3.1–3.3.3 adımlarını yineleyin. NOT: Toplama dizini, iki kanal alanının toplamına bölünen toplam çakışma alanı eksi örtüşme alanının 100 ile çarpışması olarak tanımlanır (Toplama indeksi = çakışma alanı/[kanal 1 alanı + kanal 2 alanı – örtüşme alanı] x 100). Bu normalleştirme, her iki maskedeki toplam pikselleri temsil eden iki maskelenmiş kanal arasında bir 'OR' işlemidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li>
<li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li>
<li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li>
<li>Aoto, J., Földy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li>
<li>Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Neurexin+Complexes%3A+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li>
<li>Dai, J., Aoto, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li>
<li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+a+Neurexin-3%CE%B1+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling a Neurexin-3α Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li>
<li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li>
<li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li>
<li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li>
<li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li>
<li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li>
<li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li>
<li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Magazine%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li>
<li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatic+Diseases+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li>
<li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964(2018).</li>
<li>Nguyen, T., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li>
<li>Boucard, A. A., Ko, J., Südhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1%2FLatrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Hücre yapışması sırasında transta meydana gelen protein-protein etkileşimlerinin parçalanması, olgunlaşma ve yeniden şekillendirme sırasında sinapsların oluşumu, işlevi ve bakımı da dahil olmak üzere temel hücresel süreçlerin altında bulunan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına neden olabilir. Hücreden hücreye etkileşimlerin etkileri nörobiyolojinin ötesine genişler ve sinyal transdüksiyonunda, hücre göçünde ve doku gelişiminde daha geniş rollere sahiptir14. Hücre yapışmasındaki sapmala...

Sinaptik yapışma molekülleri tarafından kolaylaştırılan sinaptik etkileşimler, sinapsların gelişimi, organizasyonu, spesifikasyonu, bakımı ve işlevi ve sinir ağlarının üretimi için temeldir. Bu transsynaptik hücre yapışma moleküllerinin tanımlanması hızla artmaktadır; bu nedenle, bağlayıcı ortakları tanımlamak ve bu yeni yapışma moleküllerinin birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini anlamak temel olarak önemlidir. Ek olarak, genom dizilimi, yaygın olarak çok sayıda nörogelişimsel, nöropsikiyatrik ve bağımlılık bozukluğu ile bağlantılı olan bu yapışma moleküllerinin çoğunda mutasyonlar tanımlamıştır1. Sinaptik hücre yapışma moleküllerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar trans etkileşimlerini zararlı bir şekilde değiştirebilir ve sinaps oluşumunda ve bakımında patofizyolojik değişikliklere katkıda bulunabilir.
İzotermal kalorimetre, dairesel dikroizm, yüzey plazmon rezonansı2 gibi protein-protein etkileşimlerini nicel olarak değerlendirmek için birden fazla tahlil mevcuttur ve doğada nicel olmasına rağmen, birkaç sınırlamaları vardır. İlk olarak, bazen uzun ve sıkıcı saflaştırma adımları gerektiren rekombinant protein gerektirirler. İkincisi, sofistike özel ekipman ve teknik uzmanlık gerektirirler. Üçüncüsü, doğal olarak bir membran in vivo'ya bağlı proteinler arasında hem cis hem de trans etkileşimlerine izin verdikleri için bağlamanın kapsamını abartabilirler. Burada sadece trans etkileşimlerini test eden basit ve nispeten hızlı bir test öneriyoruz.
Saflaştırılmış protein testleriyle ilişkili komplikasyonların çoğunu atlatmak için, azaltılmış heterolog hücre sisteminde trans etkileşimlerini yeniden sağlayan hücre bazlı bir protein etkileşimi testini optimize ettik. Bu test daha önce hücrelerarası etkileşimleri incelemek için çeşitli şekillerde kullanılmıştır. Bu yaklaşımda aday hücre yapışma molekülleri HEK293T hücrelerine aktarılır. Fizyolojik koşullarda, HEK293T hücreleri kendi kendine toplama sergilemez, bu da onları bu test için örnek modeller haline getirir. Bununla birlikte, reseptör ve ligand ifade eden HEK hücrelerinin bireysel popülasyonları birleştirildiğinde, reseptörün bağlanması ve ligand HEK hücrelerinin toplanmasına zorlar. Bu toplama sadece trans etkileşimleri tarafından aracılık edilir ve genellikle onlarca dakika içinde gözlemlenebilir. Bu yöntemde protein saflaştırma adımlarına gerek yoktur ve yöntemin verimliliği, kognate yapışma moleküllerini ifade eden HEK hücrelerinin popülasyonlarının birleştirildiği ve sadece on dakika sonra görüntülandığı paradigmasına dayanır. Ek olarak, bu yöntem nispeten ucuzdur, çünkü ne antikorlar ne de pahalı ekipmanlar gereklidir. Verilerin eldei için gerekli olan tek ekipman standart bir floresan mikroskoptur. Bu hücre bazlı testin ek bir avantajı, hastalıkla ilgili nokta mutasyonlarının trans etkileşimleri üzerindeki etkisini hızlı bir şekilde tarama yeteneğidir. Bu, ilgi çekici proteinin mutant varyantlarının cDNA'ları ile HEK hücrelerinin transfecting ile gerçekleştirilerek gerçekleştirilebilir.
Bu protokolde, derin zihinsel engellilik ve epilepsi tanısı alan bir hastada tanımlanan Neurexin3α'daki (Neurexin3αA687T)bir yanlış beyin mutasyonu,lösin bakımından zengin tekrarlayan transmembran protein 2 (LRRTM2) ile trans etkileşimlerini değiştirip değiştirmediğini araştırdığımız bir örnek sunuyoruz. Neurexin3α, evrimsel olarak korunmuş presinaptik hücre yapışma molekülleri ailesinin bir üyesidir ve son çalışmalar sinaps3, 4,5,6,7'debirden fazla rol belirlemiş olsa da, bu molekül ve neüroksin ailesinin tüm üyelerine ilişkin sinaptik anlayışımız eksik kalır. LRRTM2, sinaps oluşumu ve bakımı 8,9,10'akatılan uyarıcı bir postynaptik hücre yapıştırma proteinidir. Daha da önemlisi, LRRTM2 sadece splice bölgesi 4 alternatif eksondan (SS4-) yoksun neurexin izoformları ile etkileşime girer, ancak splice bölgesi 4 alternatif ekson (SS4 +) içeren neurexin izoformları ile etkileşime girmez. Neurexin3α'da tanımlanan insan missense mutasyonu (A687T), evrimsel olarak korunan ve tüm alfa neurexins7arasında korunan, unstudied hücre dışı bir bölgede bulunur. Bu iki molekül arasındaki etkileşimkurulduğundan 8,9,11, şu soruyu ortaya attık: Neurexin3α SS4- to LRRTM2'nin bağlanma kabiliyeti bir A687T nokta mutasyonu ile mi değiştirildi? Bu tahlil, A687T nokta mutasyonunun beklenmedik bir şekilde Neurexin3α'nın toplanmasını LRRTM2'ye artırdığını ve nokta mutasyonunun bulunduğu hücre dışı bölgenin transsinaptik etkileşimlere aracılık etmede rol oynadığını ortaya koydu.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL geçmeli kapaklı tek kullanımlık mikrotüpler</td><td>VWR</td><td>89000-028</td><td>HEK hücrelerinin karışık popülasyonunun inkübasyonu</td></tr><tr><td>1000 mL Rapid&mdash; Akış Filtre Ünitesi, 0.2 um aPES membran</td><td>Thermo Fisher</td><td>567-0020</td><td>HEK ortamının sterilizasyonu</td></tr><tr><td>15 mL SpectraTube santrifüj tüpleri</td><td>Koğuş s Science</td><td>470224-998</td><td>HEK hücrelerinin toplanması</td></tr><tr><td>6 kuyulu steril doku kültürü plakaları</td><td>VWR</td><td>100062-892</td><td>HEK hücrelerinin kültürlenmesi</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>223506-500G</td><td>Kalsiyum fosfat transfeksiyonu, HEK hücre resüspansiyonu</td></tr><tr><td>Santrifüj- Sorvall Legend RT</td><td>Kendro Laboratuvar Ürünleri</td><td>75004377</td><td>HEK hücrelerinin toplanması</td></tr><tr><td>CO2 hücre inkübatörü</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACELL 150i</td><td>Büyüme sırasında HEK hücrelerinin inkübasyonu</td></tr><tr><td>DMEM, 1x (Dulbecco'nun Eagle's Medium'un Modifikasyonu) 4.5 g / L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ile</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>HEK hücre bakımı</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Geçiş/hasat HEK hücresi</td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit</td><td>Sigma</td><td>ED-500G</td><td>HEK hücrelerinin toplanması</td></tr><tr><td>Falcon Havalandırmalı kültür şişeleri, 75cm2 büyüme alanı</td><td>Corning</td><td>9381M26</td><td>HEK hücrelerinin kültürlenmesi</td></tr><tr><td>Fetal Sığır</td><td>Serumu Sigma</td><td>17L184</td><td>HEK hücre bakımı</td></tr><tr><td>HEK293T hücreleri</td><td>ATCC</td><td></td><td>Model sistemi</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td><td>Görüntü analizi</td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür hekzahidrat</td><td>Sigma</td><td>M9272-500G</td><td>HEK hücre resüspansiyonu</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik susuz</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP332-500</td><td>Kalsiyum fosfat transfeksiyonu</td></tr><tr><td>Tripsin %0.25 (1X) Çözüm</td><td>GE Healthcare Life Fen Bilimleri</td><td>SH30042.01</td><td>HEK hücrelerinin geçirilmesi</td></tr>, <tr><td>Tüp döndürücü</td><td></td><td></td>, <td>HEK hücrelerinin karışık popülasyonunun inkübasyonu</td></tr><tr><td>, UltraClear Mikroskop slaytları. Beyaz buzlu, pozitif şarjlı</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>M1021</td><td>Görüntü elde</td></tr><tr><td>etme Geniş alan mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td>Axio Vert 200M</td><td>Görüntü alma</td></tr></tbody></table>

heterolog hücre sisteminde protein toplama yoluyla hücrelerarası etkileşimlerin Ölçülmesi

Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

Hücresel arayüzlerdeki protein etkileşimleri, doku gelişimi ve kanserin ilerlemesinden sinaps oluşumu ve bakımına kadar çok sayıda biyolojik sonucu belirler. Bu temel etkileşimlerin çoğu transta gerçekleşir ve tipik olarak membran bağlantılı bağlama çiftlerini ifade eden hücreler arasındaki heterofilik veya homofilik etkileşimler tarafından indüklenir. Hastalıkla ilgili mutasyonların bu temel protein etkileşimlerini nasıl bozduğunun aydınlatıcı olması, sayısız hücre biyolojisi alanı hakkında fikir verebilir. Birçok protein-protein etkileşim tahlilleri tipik olarak cis ve trans etkileşimleri arasında ayrım yapmaz, bu da potansiyel olarak in vivo olarak meydana gelen ve protein ve / veya özel izleme ekipmanının emek yoğun saflaştırılmasını içeren bağlama kapsamının aşırı tahmin edilmesine yol açar. Burada, uzun protein saflaştırmalarına veya özel ekipmanlara ihtiyaç duymadan sadece trans etkileşimlerin gözlemlenmesine ve ölçülmesine izin veren optimize edilmiş basit bir protokol sunuyoruz. HEK hücre toplama tahlili, her biri membran bağlı konyak ligandlarını ifade eden iki bağımsız HEK hücresi popülasyonunun karıştırılmasıdır. Kısa bir kuluçka süresinden sonra, örnekler görüntülenir ve elde edilen agregalar ölçülür.

A687T mutasyonu Neurexin3α SS4'ü artırır- LRRTM2 7'ye bağlanma Bilinen iki sinaptik proteinin hücreler arası etkileşimlerinin, zihinsel engelli ve epilepsili bir hastada bulunan bir nokta mutasyonunun ortaya girmesinden nasıl etkilendiğini araştırmak için yukarıdaki HEK hücre toplama testini kullandık (Şekil 1). Hücreler bölüm 1'e göre trans enfekte olmuş ve protokolün 1. ve 2. bölümlerine göre görüntüleme için hazırlanmıştır. Hücreler, beklendiği gibi toplanma...

Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

Hücre bazlı tahlil, uzun protein saflaştırmalarına veya özel ekipmana ihtiyaç duymadan trans adezyon etkileşimlerinin gözlemlenmesine ve miktarının belirlenmesine izin verir. Burada test edilen protein etkileşimleri nörobiyoloji ile ilgili olsa da, bu yöntem protein yapışmasının hücreler arası olarak meydana geldiği herhangi bir araştırma alanına uygulanabilir. HEK-293T hücrelerinin transfekte edilmesinden 48 saat sonra, hücreleri agregasyon için altı oyuklu plakadan hasat edin.İlk olarak, her bir kuyuyu PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hücreleri nazikçe ayırmak için, her oyuğa bir mililitre 10 milimolar EDTA ekleyin, ardından plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Beş dakikalık inkübasyondan sonra, hücreleri ayırmak için plakaya hafifçe vurun ve her bir kuyuyu ayrı bir 15 mililitrelik konik tüpe koyun.Tüpleri oda sıcaklığında 500 x g'da beş dakika santrifüjleyin. Hücreler peletlenirken, mikrosantrifüj tüplerinin üst kısımlarını deney koşullarıyla etiketleyerek altı inkübasyon tüpü hazırlayın. GFP ve mCherry'nin her permütasyonu kullanılmalıdır.Süpernatanı 15 mililitrelik konik tüplerden çıkarın ve hücreleri 500 mikrolitre ortamda yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak, her bir konik tüpteki hücreleri sayın. Daha sonra, toplam 500 mikrolitre hacminde bire bir karışım için her koşuldan 200.000 hücreyi uygun inkübasyon tüpüne alın.Bir sonraki bölümde açıklanan temel agregasyonu değerlendirdikten sonra, inkübasyon tüplerini oda sıcaklığında yavaş bir tüp döndürücüye yerleştirin. Agregasyonu değerlendirmek için, başlangıçta ve 60 dakika sonra tekrar, inkübasyon tüpünden 40 mikrolitreyi yüklü bir mikroskop lamına pipetleyin. Temel edinim, hücrelerin mikrosantrifüj tüpüne eklenmesinden sonra mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.Slaytı hem yeşil hem de kırmızı kanallarda floresan altında görüntüleyin. Her slayt için, tek bir odak düzleminde üç farklı görüş alanının görüntülerini yakalayın. HEK-293T hücreleri, ilgilenilen bir protein, ilgilenilen mutasyona uğramış bir protein veya ilgilenilen bir ligand ile transfekte edildi ve bir floresan proteini ile birlikte transfekte edildi.İlgilenilen proteini ifade eden hücre popülasyonları, ilgilenilen ligandı ifade eden hücre popülasyonları ile karıştırıldı ve 60 dakika sonra agregasyon için değerlendirildi. Yeşil ve kırmızı kanallarda yakalanan görüntü katmanlarında, toplama sarı punkta olarak görünür. Hücrelerin herhangi bir sinaptik ligand eksprese etmediği koşullar minimal agregasyon gösterdi.Ayrıca, iki popülasyondan sadece biri sinaptik ligandları eksprese ettiğinde minimal agregasyon sergilendi. İki hücre popülasyonu uyumsuz adezyon molekülleri eksprese ettiğinde herhangi bir agregasyon sergilenmedi. Uyumlu yapışma moleküllerine sahip koşullar, 60 dakikalık bir inkübasyondan sonra önemli bir agregasyon sergiledi.Şaşırtıcı bir şekilde, ilgilenilen mutasyona uğramış protein, vahşi tip muadilinden önemli ölçüde daha fazla agregasyon sergiledi, bu da nokta mutasyonunun proteinlerin bağlanma yeteneklerini arttırdığını düşündürdü. Birçok adezyon molekülündeki mutasyonlar genellikle nörogelişimsel, nöropsikiyatrik ve bağımlılık bozuklukları ile bağlantılıdır. Bu teknikle, hastalıkla ilgili nokta mutasyonlarının trans etkileşimler üzerindeki etkileri taranabilir.

measuring-transcellular-interactions-through-protein-aggregation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu videoda, proteazom aktivitesini bloke eden, yanlış katlanmış, mutant proteinlerin, bir floresan etikete kaynaşmış, ubikitine bağımlı proteazomal bozunmaya uğramasını önleyen proteazom inhibitörleri kullanılarak hücre bazlı bir protein agregasyon testini gösteriyoruz, bu da hücre sitoplazması içinde birikmelerine yol açar. Protein agregatları daha sonra floresan mikroskobu ile görselleştirilir ve ölçülür.

Protein Agregat Oluşum Deneyi: Proteazom İnhibitörü ile İndüksiyon Üzerine Kültürlenmiş Hücrelerde Protein Agregasyonunu Tespit Etmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Bu videoda, HEK hücre agregasyon testi yoluyla sinaptik hücre adezyon molekülleri arasındaki hücre içi etkileşimleri ölçme tekniğini gösteriyoruz. Bu tahlilde, istenen bir presinaptik hücre adezyon molekülünü ve bir floresan proteini eksprese eden eşit sayıda HEK hücresi, bir post-sinaptik hücre adezyon molekülü ve başka bir floresan proteini eksprese eden HEK hücreleri ile karıştırılır. Hücre adezyon molekülleri arasındaki etkileşim, hücreleri floresan mikroskobu ile ölçülebilen toplanmaya...

Hücre Adezyon Molekülleri Arasındaki Trans Etkileşimleri Tespit Etmek için Hücre Agregasyon Testi

Bu videoda, etiketlenmemiş aşırı eksprese edilmiş proteinler ve küçük moleküller arasındaki protein-ligand etkileşimlerini incelemek için hücre içi nükleer manyetik rezonans spektroskopisi tekniğini gösteriyoruz. Başarılı ligand-protein etkileşimi, orijinal zirvelerin yerini alan spektral ilgi bölgesinde ek bir tepe kümesinin ortaya çıkmasıyla görsel olarak doğrulanır.

Protein-ligand etkileşimlerini izlemek için kantitatif hücre içi hidrojen NMR spektroskopisi

Hücresel canlılığı proteinin hatalı katlanması zamanında ve etkin yönetimine bağlıdır. Inklüzyonlarınca refolding, bozulması veya sekestrasyon: Burada bir katlanan proteinin farklı potansiyel kaderi görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz Ubc9, katlanabilir sensör kullanımını...

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

Burada, varsayılan hücre adezyon moleküllerinin içsel yapışkan özelliklerini karakterize etmek için basit, hızlı bir yöntem sunuyoruz.  Bir hücre adezyon molekülünün salgılanan, epitop etiketli ektodomaini, kültür ortamından küçük, düzgün işlevselleştirilmiş boncuklar üzerinde yakalanır.  Bu boncuklar daha sonra basit boncuk agregasyon testlerinde hemen kullanılabilir.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ta protein agregasyon kinetiğinin analizi için bir yöntem sunulmuştur. Yaş senkronize edilmiş bir popülasyondan gelen hayvanlar farklı zaman noktalarında görüntülenir, ardından CellProfiler'da yarı otomatik dahil etme sayımı ve AmyloFit'teki matematiksel bir modele uyar.

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Burada, bir dizi uyumlu vektör kullanarak diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntem açıklıyoruz, ardından in vitro olarak bir araya gelemeyen protein komplekslerini incelemek için geleneksel pulldown teknikleri izleniyor.

Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Öğrenin, HEK-293T hücrelerinde floresan mikroskopi kullanarak ligand-reseptör etkileşimlerini hızlıca ölçme yöntemini. Bu teknik, nörobiyolojide protein yapışma mekanizmalarını ve mutasyon etkilerini incelemek için uygundur.

Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Daha fazla video keşfet