Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

Bu yöntem, heterodimer oluşumu gibi verimli test örnekleri için birlikte ekspresyon gerektiren protein komplekslerinin oluşumlarını incelemeye izin verir. Bu yöntemin ana uç potansiyeli, verimli karmaşık montajı teşvik etmek için uyumlu vektörlerin kombinasyonlarını kullanarak farklı şekilde etiketlenmiş çalışılmış proteinlerin birlikte ekspresyonundan, zaman açısından verimli iş akışından ve çoklu etkileşimlerin hızlı yama testine izin veren ölçeklenebilirlikten yararlanmaktır. Bu yöntem aynı zamanda optimal protein ekspresyonu ve saflaştırma koşullarının hızlı bir şekilde taranması için de kullanılabilir.

Görsel gösterim, protokolün birlikte ifade kurulumu, hücre bozulması ve sonraki açılır adımlar gibi kritik adımlarının doğru bir şekilde gerçekleştirilmesine yardımcı olur. Başlamak için, Luria-Bertani'de Escherichia coli BL21 (DE3) suşunu veya LB'yi, 37 santigrat derecelik ortamda, 0.1 ila 0.2'lik bir optik yoğunluğa veya OD'ye kadar büyütün. Bakteriyel süspansiyonun bir mililitresini dört santigrat derecede 9.000 G'de bir dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın.

Daha sonra, 0,5 mililitre buz gibi soğuk dönüşüm tamponu veya TB ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, dört santigrat derecede 8.000 G'de 30 saniye boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Daha sonra, 100 mikrolitre TB tamponu, her vektörün 100 nanogramını ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.

150 saniye boyunca 42 santigrat derecede ısıtın, ardından bir dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Daha sonra, antibiyotiksiz bir mililitre LB ortamı ekleyin ve 90 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süspansiyonu% 0.5 glikoz ve karşılık gelen antibiyotikler içeren bir LB agar plakasına kaplamadan önce peleti 100 mikrolitre LB ortamında santrifüj edin ve yeniden askıya alın.

Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri plakadan iki mililitre LB ortamı ile karşılık gelen antibiyotiklerle 50 mililitre LB ortamına yıkayın. Sonraki deneyler için eksi 70 santigrat derecede eksi% 20 gliserol içeren bir aliquot depolamadan önce metal iyonları veya diğer bilinen ko-faktörleri ekleyin.

Hücreleri 37 santigrat derecede 220 RPM'lik sabit bir dönüşle 0,5 ila 0,7 OD'ye büyütün. Kültürü oda sıcaklığına soğutun ve IPTG'yi bir milimolün son konsantrasyonuna ekleyin. İndüklenmemiş numunenin kontrolü olarak 20 mikrolitrelik bir hücre süspansiyonu aliquot'u saklayın.

Hücreleri gece boyunca 18 santigrat derecede 220 RPM'de inkübe edin. Ertesi gün, bakteriyel süspansiyonu iki parçaya bölün ve protein ekspresyonunu doğrulamak için 20 mikrolitrelik alikotları saklayın. Kalan hücre süspansiyonunu 15 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüj edin.

Pulldown testi için, peletleri bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponunda, proteaz inhibitörleri ve deneyden hemen önce eklenen indirgeyici ajanlarla yeniden askıya alın. Test edilen proteinler için tampon bileşimini ayarlayın. Buz üzerinde sonikasyon ile hücreleri bozun ve elektroforez için 20 mikrolitrelik bir aliquot saklayın.

30 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüj yapın ve elektroforez için 20 mikrolitre arıtılmış lizat toplayın. Reçineyi 10 dakika boyunca bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ile dengeleyin, ardından 30 saniye boyunca 2.000 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Reçineye hücre lizatları ekleyin ve 15 RPM'lik sabit bir dönüşte 10 dakika boyunca inkübe edin.

Daha sonra, analiz için bağlanmamış fraksiyonun 20 mikrolitresini toplamadan önce süpernatantı santrifüj edin ve atın. Daha sonra, bir mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin. Yine, süpernatanı santrifüj yapın ve atın.

Ardından, buz gibi soğuk yıkama tamponu ile iki uzun yıkama gerçekleştirin. İkinci yıkamadan sonra, bağlı proteinleri 50 mikrolitre elüsyon tamponu ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 1.200 RPM'de bir çalkalayıcıda süzün. Salınan proteinleri SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile analiz edin.

Çinko parmakla ilişkili alan veya ZAD, maltoz bağlayıcı protein veya MBP'de homo-dimerizasyon ve 6xHistidin pulldown tahlilleri ile ilgili çalışmalar burada gösterilmiştir. MBP ve Thioredoxin 6xHistidin-kaynaşmış ZAD'lerin birlikte ekspresyonu, MBP pulldown testinin SDS-PAGE sonuçlarında ek bir bant olarak görünen, iyi ve tekrarlanabilir homodimerizasyon aktivitesi gösterir. Alternatif kompleks oluşumu incelemek için yöntemi kullanmanın bir başka örneği burada gösterilmiştir.

Ortak ifade testinde, 6xHistidine etiketli ENY2 hem GST etiketli Sgf11 hem de MBP-CTCF ile etkileşime girdi, ancak MBP pulldown'larında GST-Sgf11 yoktu ve bunun tersi de geçerliydi. Burada, geleneksel pulldown testinin iş akışında gerekli zaman aralıklarının, birlikte ifadeye bağlı pulldown ile karşılaştırıldığında adım adım karşılaştırılması gösterilmektedir. CP190 proteininin BTB alanı ile Drosophila CTCF proteininin GST etiketli C-terminal alanı arasındaki aynı etkileşimi incelemek için her iki tekniğin de kullanılmasının sonuçları burada gösterilmiştir.

Doğru afinite ve çözünürlük testi, Thioredoxin, GST veya MBP seçimi, tahlilin verimli bir şekilde yürütülmesi için kritik öneme sahiptir. Bir diğer kritik adım hızlı ve düzgün hücre bozulmasıdır. Çok uçlu sonikatör probların kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

Bu yöntem, geleneksel pulldown testinde saflaştırılmış proteinlerin inkübasyonu sırasında ayrılmayan homodimerler oluşturan protein alanları arasındaki heterodimer oluşumunun doğrudan incelenmesine izin verir.