Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde
December 23rd, 2022
Burada, bir dizi uyumlu vektör kullanarak diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntem açıklıyoruz, ardından in vitro olarak bir araya gelemeyen protein komplekslerini incelemek için geleneksel pulldown teknikleri izleniyor.
Bu yöntem, heterodimer oluşumu gibi verimli test örnekleri için birlikte ekspresyon gerektiren protein komplekslerinin oluşumlarını incelemeye izin verir. Bu yöntemin ana uç potansiyeli, verimli karmaşık montajı teşvik etmek için uyumlu vektörlerin kombinasyonlarını kullanarak farklı şekilde etiketlenmiş çalışılmış proteinlerin birlikte ekspresyonundan, zaman açısından verimli iş akışından ve çoklu etkileşimlerin hızlı yama testine izin veren ölçeklenebilirlikten yararlanmaktır. Bu yöntem aynı zamanda optimal protein ekspresyonu ve saflaştırma koşullarının hızlı bir şekilde taranması için de kullanılabilir.
Görsel gösterim, protokolün birlikte ifade kurulumu, hücre bozulması ve sonraki açılır adımlar gibi kritik adımlarının doğru bir şekilde gerçekleştirilmesine yardımcı olur. Başlamak için, Luria-Bertani'de Escherichia coli BL21 (DE3) suşunu veya LB'yi, 37 santigrat derecelik ortamda, 0.1 ila 0.2'lik bir optik yoğunluğa veya OD'ye kadar büyütün. Bakteriyel süspansiyonun bir mililitresini dört santigrat derecede 9.000 G'de bir dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın.
Daha sonra, 0,5 mililitre buz gibi soğuk dönüşüm tamponu veya TB ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, dört santigrat derecede 8.000 G'de 30 saniye boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Daha sonra, 100 mikrolitre TB tamponu, her vektörün 100 nanogramını ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.
150 saniye boyunca 42 santigrat derecede ısıtın, ardından bir dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Daha sonra, antibiyotiksiz bir mililitre LB ortamı ekleyin ve 90 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süspansiyonu% 0.5 glikoz ve karşılık gelen antibiyotikler içeren bir LB agar plakasına kaplamadan önce peleti 100 mikrolitre LB ortamında santrifüj edin ve yeniden askıya alın.
Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri plakadan iki mililitre LB ortamı ile karşılık gelen antibiyotiklerle 50 mililitre LB ortamına yıkayın. Sonraki deneyler için eksi 70 santigrat derecede eksi% 20 gliserol içeren bir aliquot depolamadan önce metal iyonları veya diğer bilinen ko-faktörleri ekleyin.
Hücreleri 37 santigrat derecede 220 RPM'lik sabit bir dönüşle 0,5 ila 0,7 OD'ye büyütün. Kültürü oda sıcaklığına soğutun ve IPTG'yi bir milimolün son konsantrasyonuna ekleyin. İndüklenmemiş numunenin kontrolü olarak 20 mikrolitrelik bir hücre süspansiyonu aliquot'u saklayın.
Hücreleri gece boyunca 18 santigrat derecede 220 RPM'de inkübe edin. Ertesi gün, bakteriyel süspansiyonu iki parçaya bölün ve protein ekspresyonunu doğrulamak için 20 mikrolitrelik alikotları saklayın. Kalan hücre süspansiyonunu 15 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüj edin.
Pulldown testi için, peletleri bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponunda, proteaz inhibitörleri ve deneyden hemen önce eklenen indirgeyici ajanlarla yeniden askıya alın. Test edilen proteinler için tampon bileşimini ayarlayın. Buz üzerinde sonikasyon ile hücreleri bozun ve elektroforez için 20 mikrolitrelik bir aliquot saklayın.
30 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüj yapın ve elektroforez için 20 mikrolitre arıtılmış lizat toplayın. Reçineyi 10 dakika boyunca bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ile dengeleyin, ardından 30 saniye boyunca 2.000 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Reçineye hücre lizatları ekleyin ve 15 RPM'lik sabit bir dönüşte 10 dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra, analiz için bağlanmamış fraksiyonun 20 mikrolitresini toplamadan önce süpernatantı santrifüj edin ve atın. Daha sonra, bir mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin. Yine, süpernatanı santrifüj yapın ve atın.
Ardından, buz gibi soğuk yıkama tamponu ile iki uzun yıkama gerçekleştirin. İkinci yıkamadan sonra, bağlı proteinleri 50 mikrolitre elüsyon tamponu ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 1.200 RPM'de bir çalkalayıcıda süzün. Salınan proteinleri SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile analiz edin.
Çinko parmakla ilişkili alan veya ZAD, maltoz bağlayıcı protein veya MBP'de homo-dimerizasyon ve 6xHistidin pulldown tahlilleri ile ilgili çalışmalar burada gösterilmiştir. MBP ve Thioredoxin 6xHistidin-kaynaşmış ZAD'lerin birlikte ekspresyonu, MBP pulldown testinin SDS-PAGE sonuçlarında ek bir bant olarak görünen, iyi ve tekrarlanabilir homodimerizasyon aktivitesi gösterir. Alternatif kompleks oluşumu incelemek için yöntemi kullanmanın bir başka örneği burada gösterilmiştir.
Ortak ifade testinde, 6xHistidine etiketli ENY2 hem GST etiketli Sgf11 hem de MBP-CTCF ile etkileşime girdi, ancak MBP pulldown'larında GST-Sgf11 yoktu ve bunun tersi de geçerliydi. Burada, geleneksel pulldown testinin iş akışında gerekli zaman aralıklarının, birlikte ifadeye bağlı pulldown ile karşılaştırıldığında adım adım karşılaştırılması gösterilmektedir. CP190 proteininin BTB alanı ile Drosophila CTCF proteininin GST etiketli C-terminal alanı arasındaki aynı etkileşimi incelemek için her iki tekniğin de kullanılmasının sonuçları burada gösterilmiştir.
Doğru afinite ve çözünürlük testi, Thioredoxin, GST veya MBP seçimi, tahlilin verimli bir şekilde yürütülmesi için kritik öneme sahiptir. Bir diğer kritik adım hızlı ve düzgün hücre bozulmasıdır. Çok uçlu sonikatör probların kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
Bu yöntem, geleneksel pulldown testinde saflaştırılmış proteinlerin inkübasyonu sırasında ayrılmayan homodimerler oluşturan protein alanları arasındaki heterodimer oluşumunun doğrudan incelenmesine izin verir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, uyumlu vektörler kullanılarak farklı şekilde etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel ortak ekspresyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşım, in vitro olarak birleştirilemeyen protein komplekslerinin çalışmasını kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Moleküler Biyoloji
- Protein Etkileşimi Çalışmaları
Arka Plan
- Protein kompleksleri genellikle verimli bir birleşim için ortak ekspresyon gerektirir.
- Heterodimer oluşumu bu yöntemin ana odak noktasıdır.
- Bu kompleksleri analiz etmek için geleneksel pulldown teknikleri kullanılır.
- Görsel gösterimler protokol anlayışını artırır.
Çalışmanın Amacı
- Farklı şekilde etiketlenmiş proteinlerin ortak ekspresyonunu kullanmak.
- Verimli kompleks birleşimini teşvik etmek.
- Protein ekspresyon koşullarının hızlı taranmasını sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Escherichia coli BL21(DE3) suşunda proteinlerin ortak ekspresyonu.
- 37 derece Celsius'ta Luria-Bertani (LB) besiyerinde büyüme.
- Hücreleri izole etmek için bakteriyel süspansiyonun santrifüjlenmesi.
- Protein etkileşimlerini analiz etmek için sonraki pulldown adımları.
Ana Sonuçlar
- Protein komplekslerinin verimli birleşimi sağlandı.
- Zaman açısından verimli iş akışı, etkileşimlerin hızlı test edilmesine izin verdi.
- Optimal protein ekspresyon koşulları belirlendi.
- Protokolün kritik adımları başarılı bir şekilde gösterildi.
Sonuçlar
- Bu yöntem, protein komplekslerini incelemek için sağlam bir yaklaşım sunar.
- Hücresel bir bağlamda protein etkileşimlerinin anlayışını artırır.
- Gelecekteki uygulamalar daha geniş protein etkileşimi çalışmalarını içerebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Efficient and reproducible interrogation of protein-protein interactions is critical for early-stage target validation and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The pulldown assay coupled with bacterial co-expression enables rapid, scalable assessment of challenging complexes that cannot be reconstituted in vitro, directly impacting predictive confidence at the discovery inflection point. This workflow supports portfolio triage by enabling batch testing of interaction hypotheses with reduced time and technical variability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of protein complexes requiring co-translational assembly or chaperone support.
- Facilitates functional validation of interaction partners that are unstable or non-reconstitutable in vitro.
- Supports mechanistic de-risking by confirming biologically relevant interactions under near-native conditions.
- Accelerates hypothesis-driven triage of candidate targets and pathways.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein complexes for downstream screening and assay development workflows.
- Improves reproducibility and standardization by minimizing proteolysis and oxidation during sample handling.
- Enables rapid, parallelized batch testing of multiple protein-protein interactions.
- Supports optimization of expression and purification conditions for challenging targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns interaction studies with disease-relevant protein complexes when in vitro reconstitution is not feasible.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting robust mechanistic insights.
- Reduces risk of late-stage attrition due to undetected interaction dependencies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and functional validation of protein interactions prior to downstream screening or preclinical modeling.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by enabling direct assessment of complex assembly requirements.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Provides SDS-PAGE and affinity-based readouts for robust measurement of interaction strength and specificity.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant systems when standard in vitro approaches are insufficient.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable platform for batch testing diverse protein-protein interactions across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through time-efficient, reproducible protocols and minimized sample handling.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by rapidly de-risking interaction hypotheses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated interaction dependencies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial co-expression systems and affinity purification techniques.
- Needs access to compatible expression vectors, multi-tip sonicators, and analytical infrastructure for SDS-PAGE.
- Demands cross-team standardization of tagging strategies and buffer compositions for reproducibility.
- May require adaptation for different protein classes or interaction types based on solubility and stability.
- Limited to interactions amenable to bacterial expression and compatible with available affinity tags.
