Name: Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Öğrenin bakteri hücrelerinde pulldown testi ile protein-protein etkileşimlerini hızlıca analiz etme yöntemini. Escherichia coli BL21(DE3) kullanarak heterodimer oluşumunu ve kompleks montajını verimli şekilde çalışın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Rus Bilim Vakfı'nın 19-74-30026 (yöntem geliştirme ve doğrulama) ve 19-74-10099 (protein-protein etkileşim tahlilleri) projeleri tarafından desteklenmiştir; ve Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğretim Bakanlığı tarafından 075-15-2019-1661 (temsili protein-protein etkileşimlerinin analizi) hibesi.

Yöntem iş akışının şematik gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. E. coli'nin birlikte dönüşümü
<ol><li>Standart klonlama yöntemlerini kullanarak hedef proteinler için ekspresyon vektörleri hazırlayın. NOT: Tipik olarak, iyi bir başlangıç noktası, GST / MBP etiketli proteinlerin ekspresyonu için bir ampisilin direnç geni ve ColE1 orijinli geleneksel pGEX / pMAL vektörleri ve 6xHis etiketli proteinleri eksprese etmek için p15A veya RSF kökenli ve kanamisin direnci ile uyumlu bir vektör kullanmaktır. Genellikle, denemeden önce birkaç etiket kombinasyonunun test edilmesi gerekir. Açıklanan yöntemin kendisi, hedef proteinlerin ekspresyon koşullarını toplu olarak test etmek için uygundur. Çoğu Rosetta suşunun zaten nadir kodon için tRNA'ları eksprese etmek için p15A kökenli plazmid içerdiğine dikkat etmek önemlidir; Bu nedenle, bu tür suşların kullanılması olası bir seçenekse, p15A plazmidlerinden kaçınılmalıdır. Ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.<ol><li>Luria-Bertani (LB) ortamında 37 ° C'de 0.1-0.2'lik bir optik yoğunluğa (OD) uygun bir suştaki bakterileri büyütün. Bu çalışmada örnek olarak BL21(DE3) suşu kullanılmıştır. NOT: İki vektörle verimli bir şekilde birlikte dönüşüm elde etmek için taze hazırlanmış yetkin hücrelerin kullanılması önerilir. İkiden fazla vektörün birlikte dönüştürülmesi gerekiyorsa, iyi bir dönüşüm verimliliği elde etmek için bunları sırayla dönüştürmek daha iyidir. Elektroporasyon iyi bir alternatiftir.</li>
		<li>4 °C'de 9.000 x g'de 1 dakika boyunca bakteriyel süspansiyonun 1.0 mL'sini santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>0,5 mL buz gibi soğuk tampon dönüşüm tamponu (TB) (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 ve 15 mM CaCl2) ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>4 °C'de 8.000 x g'de 30 sn'lik santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
		<li>100 μL TB tampon ekleyin, her vektörden 100 ng ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika kuluçkaya yatırın. Birlikte ifade olmadan protein davranışını incelemek için tek vektörleri ayrı ayrı dönüştürün. Ek olarak, ifade vektörlerini, spesifik olmayan bağlama denetimleri için boş birlikte ifade vektörleriyle çiftler halinde birlikte dönüştürün. NOT: Bu çalışmada verilen örneklerde, GST/MBP cDNA'lara kaynaşmış karşılık gelen cDNA'lara sahip pGEX/pMAL vektörleri, Thioredoxin cDNA'ya kaynaşmış cDNA kodlama ortağı protein alanlarını taşıyan uyumlu pASIC türevi vektörlerle birlikte kullanılmıştır.</li>
		<li>42 °C'de 150 s ısıtın, ardından buz üzerinde 1 dakika soğutun.</li>
		<li>Antibiyotiksiz 1 mL sıvı LB ortamı ekleyin ve 90 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. % 0.5 glikoz ve karşılık gelen antibiyotikler içeren LB-agar plakaları üzerindeki plaka (yaygın konsantrasyonlar: 50 mg / L ampisilin; 20 mg / L kanamisin; 50 mg / L streptomisin; 35 mg / L kloramfenikol). Plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	</ol></li>
</ol>2. İfade
<ol><li>Hücreleri plakadan 2 mL sıvı LB ortamı ile karşılık gelen antibiyotiklerle 50 mL LB ortamına yıkayın (yaygın konsantrasyonlar: 50mg / L ampisilin; 20 mg / L kanamisin; 50 mg / L streptomisin; 35 mg / L kloramfenikol). Metal iyonları veya diğer bilinen ko-faktörleri ekleyin (bu çalışmada verilen örneklerde, medyaya 0.2 mM ZnCl2 eklenmiştir). Deneyin daha sonraki bir tekrarı için -70 ° C'de% 20 gliserol içeren bir aliquot saklayın. NOT: İki plazmid arasındaki ara sıra rekombinasyon olayları nedeniyle tek bir izole klonda kötü ekspresyon olasılığını dışlamak için birkaç koloninin doğrudan plakadan temizlenmesi önerilir.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de 220 rpm'lik sabit bir dönüşle 0.5-0.7'lik bir OD'ye büyütün, oda sıcaklığına (RT) soğutun ve izopropil β-D-1-tiyogalaktopironosid (IPTG) 1 mM'ye ekleyin. İndüklenmemiş numunenin kontrolü olarak 20 μL'lik bir hücre süspansiyonu aliquot'u saklayın.</li>
	<li>Hücreleri gece boyunca 18 ° C'de 220 rpm'lik sabit bir dönüşle inkübe edin. NOT: Optimum inkübasyon süresi ve sıcaklığı değişebilir; Gece boyunca 18 ° C çoğu protein için en iyi şekilde çalışır ve varsayılan olarak denenmesi önerilir. Spesifik olmayan güçlü bir bağlanma gözlenirse kuluçka süresini 2-3 saate düşürün.</li>
	<li>Bakteriyel süspansiyonu iki parçaya bölün (veya ikiden fazla farklı etiket kullanılıyorsa daha fazla) ve protein ekspresyonunu doğrulamak için hücre süspansiyonunun 20 μL'lik bir alikotunu saklayın. 15 dakika boyunca 4.000 x g'de santrifüj. NOT: Duraklama noktası: Bakteriyel peletler -70 °C'de en az 6 ay saklanabilir.</li>
</ol>3. Pulldown testi
NOT: 6xHis veya MBP/GST ile etiketlenmiş proteinler için ayrıntılı prosedürler açıklanmıştır. Tüm prosedürler 4 ° C'de gerçekleştirilir.
<ol><li>Bakteriyel peletleri, deneyden hemen önce eklenen proteaz inhibitörleri ve indirgeyici ajanlar (aşağıya bakınız) ile 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponunda yeniden askıya alın. Metal yonlarını sıyırdığı için metal şelatlama reçineleri kullanırken ditiotreitolden (DTT) kaçının. Test edilen proteinler için tampon bileşimini ayarlayın. Çoğu protein için uygun bulunan lizis tamponlarının yaygın tarifleri şunlardır:<ol><li>6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, %0.1 NP40, %10 [w/w] gliserol, 5 mM beta-merkaptoetanol, 1 mM fenilmetilsülfonilflorür (PMSF) ve proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesini karıştırın (bkz.</li>
		<li>GST veya MBP pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, %0,1 NP40, %10 [w/w] gliserol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitörü kokteylinin 1:1.000 seyreltilmesini karıştırın (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>Buz üzerinde sonikasyon ile hücreleri bozun. Elektroforez için 20 μl'lik bir aliquot saklayın. NOT: Tipik olarak, numune başına 20 W çıkış gücüne sahip 15 s aralıklarla 5 sn'lik 20-25 darbe gerekir. Aşırı ısınmayı önlemek ve toplam hücre bozulmasını sağlamak için her cihaz için uygun sonikasyon gücü ayarlanmalıdır. Daha iyi performans elde etmek için, yüksek verimli çok uçlu sonikatör problarının kullanılması şiddetle tavsiye edilir.</li>
	<li>30 dakika boyunca 20.000 x g'de santrifüj. Sonraki SDS-PAGE analizi için 20 μL berraklaştırılmış lizat toplayın.</li>
	<li>Reçineyi (her numune için 50 μL) 10 dakika boyunca 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponu ile dengeleyin, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Reçineye hücre lizatları (toplam protein konsantrasyonu: 20-50 mg / mL) ekleyin, 15 rpm'lik sabit bir rotasyonda 10 dakika boyunca inkübe edin, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Sonraki SDS-PAGE analizi için ilişkisiz fraksiyonun 20 μL'sini toplayın.</li>
	<li>1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin ve 1 dakika kuluçkaya yatırın. 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Yıkama tamponları için yaygın tarifler şunlardır:<ol><li>6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, %0.1 NP40, %10 [w/w] gliserol ve 5 mM beta-merkaptoetanol karıştırın.</li>
		<li>GST veya MBP pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7,5), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0,1 mM ZnCl2, %0,1 NP40, %10 [w/w] gliserol ve 5 mM DTT karıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>İki uzun yıkama gerçekleştirin: 1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin, 15 rpm'lik sabit bir dönüşle 10-30 dakika inkübe edin, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>1 mL buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin, 1 dakika kuluçkaya yatırın, 30 s için 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın.</li>
	<li>Bağlı proteinleri, 50 μL elüsyon tamponu ile 10 dakika boyunca 1.200 rpm'de bir çalkalayıcıda süzün. Elüsyon tamponlarının yaygın tarifleri şunlardır:<ol><li>6xHis-pulldown: 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazol ve 5 mM beta-merkaptoetanol karıştırın.</li>
		<li>GST-pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7.5), 150 mM NaCl, 50 mM Glutatyon (bazik Tris ile pH 7.5'e ayarlanır) ve 5 mM DTT.</li>
		<li>MBP-pulldown: 20 mM Tris (25 °C'de pH 7,5), 150 mM NaCl, 40 mM maltoz ve 5 mM DTT'yi karıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Salınan proteinleri SDS-PAGE ile analiz edin. NOT: Akrilamid yüzdesi, proteinlerin boyutuna göre ayarlanmalıdır. Bu çalışmada verilen örneklerde, tris-glisin-SDS tamponunda (2 mM Tris, 250 mM Glisin,% 0.1 SDS) 180 V'luk sabit voltajda çalışan% 12 akrilamid jelleri kullanılmıştır. jeller% 0.2 Coomassie mavi R250,% 10 asetik asit ve% 30 izopropanol içinde kaynatılarak boyanmış ve% 10 asetik asit içinde kaynatılarak boyanmıştır. Yüklü protein miktarı eşit olmamalıdır, çünkü farklı deneylerde çeşitli miktarlarda etkileşime giren proteinler aşağı çekilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+Pulldown+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li>
<li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+dimerization%2C+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li>
<li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li>
<li>Nair, S. K., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+structures+of+Myc-Max+and+Mad-Max+recognizing+DNA.+Molecular+bases+of+regulation+by+proto-oncogenic+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">X-ray structures of Myc-Max and Mad-Max recognizing DNA. Molecular bases of regulation by proto-oncogenic transcription factors.</a> Cell. 112 (2), 193-205 (2003).</li>
<li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602(2022).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755(2021).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Shieh, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operon+structure+and+co-translational+subunit+association+direct+protein+assembly+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Operon structure and co-translational subunit association direct protein assembly in bacteria.</a> Science. 350 (6261), 678-680 (2015).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), 57-64 (2021).</li>
<li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li>
<li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316(2016).</li>
<li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+mediator+head+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li>
<li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li>
<li>Samara, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+assembly+and+function+of+the+SAGA+deubiquitinating+module%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the assembly and function of the SAGA deubiquitinating module.</a> Science. 328 (5981), 1025-1029 (2010).</li>
<li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li>
<li>Rucker, P., Torti, F. M., Torti, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+ferritin%3A+modulation+of+subunit+stoichiometry+in+bacterial+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Recombinant ferritin: modulation of subunit stoichiometry in bacterial expression systems.</a> Protein Engineering. 10 (8), 967-973 (1997).</li>
<li>Selzer, G., Som, T., Itoh, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+replication+of+plasmid+p15A+and+comparative+studies+on+the+nucleotide+sequences+around+the+origin+of+related+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The origin of replication of plasmid p15A and comparative studies on the nucleotide sequences around the origin of related plasmids.</a> Cell. 32 (1), 119-129 (1983).</li>
<li>Nijkamp, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+nucleotide+sequence+of+the+bacteriocinogenic+plasmid+CloDF13%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">The complete nucleotide sequence of the bacteriocinogenic plasmid CloDF13.</a> Plasmid. 16 (2), 135-160 (1986).</li>
<li>Som, T., Tomizawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+replication+of+Escherichia+coli+plasmid+RSF+1030%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+General+Genetics%22%5BJournal%5D)">Origin of replication of Escherichia coli plasmid RSF 1030.</a> Molecular General Genetics. 187 (3), 375-383 (1982).</li>
<li>Tsao, K. L., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+production+of+two+recombinant+proteins+in+Escherichia+coli+by+manipulating+plasmid+copy+number%3A+high-level+expression+of+heterodimeric+Ras+farnesyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+Purification%22%5BJournal%5D)">Balancing the production of two recombinant proteins in Escherichia coli by manipulating plasmid copy number: high-level expression of heterodimeric Ras farnesyltransferase.</a> Protein Expression Purification. 11 (3), 233-240 (1997).</li>
<li>Nallamsetty, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubility-enhancing+proteins+MBP+and+NusA+play+a+passive+role+in+the+folding+of+their+fusion+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+Purification%22%5BJournal%5D)">Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play a passive role in the folding of their fusion partners.</a> Protein Expression Purification. 45 (1), 175-182 (2006).</li>
<li>Paiano, A., Margiotta, A., De Luca, M., Bucci, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid+assay+to+identify+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid assay to identify interacting proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 70(2019).</li>
<li>Zolghadr, K., Rothbauer, U., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+two-hybrid+%28F2H%29+assay+for+direct+analysis+of+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The fluorescent two-hybrid (F2H) assay for direct analysis of protein-protein interactions in living cells.</a> Methods in Molecular Biology. 812, 275-282 (2012).</li>
<li>Fiebitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mammalian+two-hybrid+screening+for+protein-protein+interactions+using+transfected+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput mammalian two-hybrid screening for protein-protein interactions using transfected cell arrays.</a> BMC Genomics. 9, 68(2008).</li>
<li>Bonchuk, A. N., Georgiev, P. G., Maksimenko, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+and+Sgfl1+proteins+form+alternative+complexes+with+ENY2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Doklady+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">CTCF and Sgfl1 proteins form alternative complexes with ENY2 proteins.</a> Doklady Biochemistry and Biophysics. 468 (1), 180-182 (2016).</li>
<li>Maksimenko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+new+insulator+proteins%2C+Pita+and+ZIPIC%2C+target+CP190+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin.</a> Genome Research. 25 (1), 89-99 (2015).</li>
<li>Sabirov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+functional+role+of+the+interaction+between+CP190+and+the+architectural+protein+Pita+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Mechanism and functional role of the interaction between CP190 and the architectural protein Pita in Drosophila melanogaster.</a> Epigenetics Chromatin. 14 (1), 16(2021).</li>
<li>Dong, S., Provart, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+of+protein+interaction+networks+using+computational+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyses of protein interaction networks using computational tools.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 97-117 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Tarif edilen yöntem, in vitro olarak verimli bir şekilde monte edilemeyen ve birlikte ekspresyon gerektiren protein-protein etkileşimlerinin test edilmesine izin verir. Bu yöntem, homodimerizasyon yeteneğine sahip heterodimerize edici proteinleri incelemek için birkaç uygun yaklaşımdan biridir, çünkü ayrı ayrı saflaştırıldığında, bu tür proteinler deney sırasında çoğu zaman ayrışamayan ve yeniden birleşemeyen kararlı homodimerler oluşturur 3,11.
<p c...

Geleneksel pulldown, protein-protein etkileşimlerini incelemek için yaygın olarak kullanılır1. Bununla birlikte, saflaştırılmış proteinler genellikle in vitro2,3 etkili bir şekilde etkileşime girmez ve bazılarıbağlanma ortakları 4,5 olmadan çözünmez. Bu tür proteinler ko-translasyonel montaj veya moleküler şaperonların varlığı gerektirebilir 5,6,7,8,9. Konvansiyonel pulldown'un bir başka sınırlaması, 8,10 ile birlikte translasyonelolarak bir araya getirilmiş kararlı homo-oligomerler olarak var olabilen alanlar arasındaki olası heteromultimerizasyon aktivitesinin test edilmesidir, çünkü birçoğu kuluçka süresi boyunca in vitro olarak ayrışamaz ve yeniden ilişkilendirilemez. Bu tür sorunların üstesinden gelmede birlikte ifade etmenin yararlı olduğu bulunmuştur 3,11. Bakterilerde uyumlu vektörler kullanılarak birlikte ekspresyon, polikomb baskılayıcı kompleks PRC2 12, RNA polimeraz II mediatör kafa modülü 13, bakteriyofaj T4 taban plakası14, SAGA kompleksi deubikitinilaz modülü 15,16 ve ferritin 17'yi içeren büyük çok alt birimli makromoleküler kompleksleri saflaştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Birlikte ifade için yaygın olarak kullanılan çoğaltma kaynakları ColE1, p15A18, CloDF1319 ve RSF20'dir. Ticari olarak temin edilebilen Duet ekspresyon sisteminde, bu kökenler farklı antibiyotik direnç genleri ve polisitronik vektörler üretmek için uygun çoklu klonlama bölgeleri ile birleştirilir ve sekiz proteine kadar ekspresyona izin verir. Bu kökenler farklı kopya numaralarına sahiptir ve hedef proteinlerin dengeli ekspresyon seviyelerini elde etmek için çeşitli kombinasyonlarda kullanılabilir21. Protein-protein etkileşimlerini test etmek için çeşitli afinite etiketleri kullanılır; en yaygın olanları 6xHistidin, glutatyon-S-transferaz (GST) ve maltoz bağlayıcı proteindir (MBP), bunların her biri karşılık gelen reçineye spesifik bir afiniteye sahiptir. GST ve MBP ayrıca etiketli proteinlerin çözünürlüğünü ve kararlılığını arttırır22.
Ökaryotik hücrelerde protein ko-ekspresyonunu içeren bir dizi yöntem de geliştirilmiştir, bunlardan en önemlisi maya iki hibrid tahlilidir (Y2H)23. Y2H testi ucuz, kolaydır ve çoklu etkileşimlerin test edilmesine izin verir; ancak, iş akışının tamamlanması 1 haftadan fazla sürer. Ayrıca, daha az sıklıkla kullanılan birkaç memeli hücre bazlı tahlil vardır, örneğin, floresan iki hibrid tahlil (F2H)24 ve hücre dizisi protein-protein etkileşim testi (CAPPIA)25. F2H testi nispeten hızlıdır ve doğal hücresel ortamlarında protein etkileşimlerini gözlemlemeye izin verir, ancak pahalı görüntüleme ekipmanlarının kullanılmasını içerir. Tüm bu yöntemler, doğal ökaryotik çeviri ve katlama ortamı sağlayan prokaryotik ifadeye göre avantajlıdır; Bununla birlikte, etkileşimi dolaylı olarak, transkripsiyonel aktivasyon veya genellikle eserler üreten floresan enerji transferi yoluyla tespit ederler. Ayrıca, ökaryotik hücreler, daha yüksek ökaryotların proteinleri arasındaki ikili etkileşimlerin test edilmesine müdahale edebilen, ilgilenilen proteinlerin diğer etkileşim ortaklarını içerebilir.
Bu çalışma, diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntemi ve ardından geleneksel pulldown tekniklerini açıklamaktadır. Yöntem, birlikte ekspresyon gerektiren hedef proteinler arasındaki etkileşimlerin incelenmesine izin verir. Geleneksel pulldown'a kıyasla daha zaman verimlidir ve birden fazla hedefin toplu olarak test edilmesine izin verir, bu da çoğu durumda avantajlı olmasını sağlar. Uyumlu vektörler kullanılarak birlikte ifade, zahmetli bir klonlama adımı gerektirmediğinden polisitronik birlikte ifadeden daha uygundur.

<table><tbody><tr><td>8 ELEMANLI prob</td><td>Sonics</td><td>630-0586</td><td>Yüksek verimli 8 elemanlı sonikatör probları</td></tr><tr><td>Agar</td><td>AppliChem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Amiloz reçinesi</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021</td><td>MBP etiketli proteinlerin saflaştırılması için reçine</td></tr><tr><td>Antibiyotikler</td><td>AppliChem</td><td>A4789 (kanamisin); A0839 (ampisilin)</td><td></td></tr><tr><td>Beta-merkaptoetanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>69450-M</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>AppliChem</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5415R (Z605212)</td><td></td></tr><tr><td>Glutatyon</td><td>AppliChem</td><td>A9782</td><td></td></tr><tr><td>Glutatyon agaroz</td><td>Pierce</td><td>16100</td><td>GST etiketli proteinlerin saflaştırılması için reçine</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>AppliChem</td><td>A2926</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>25214</td><td>6xHis etiketli proteinlerin saflaştırılması için reçine</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>AppliChem</td><td>A1378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A4773</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AppliChem</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>AppliChem</td><td>414753</td><td></td></tr><tr><td>Maltoz</td><td>Uygulaması</td><td>A3891</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Uygulaması</td><td>A2947</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Uygulaması</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>pACYCDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71147</td><td>p15A replikasyon orijinli proteinlerin birlikte ekspresyonu için vektör</td></tr><tr><td>pCDFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71340</td><td>Proteinlerin CloDF13 replikasyon orijinli PMSF ile birlikte ekspresyonu için vektör</td></tr><tr><td></td><td>AppliChem</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitör Kokteyli VII</td><td>Calbiochem</td><td>539138</td><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyli</td></tr><tr><td>pRSFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71341</td><td>RSF replikasyon orijinli proteinlerin birlikte ekspresyonu için vektör</td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>VC505 sonikatör</td><td>Sonics</td><td>CV334</td><td>Ultrasonik sıvı işlemci</td></tr><tr><td>ZnCl2</td> <td>AppliChem</td><td>A6285</td><td></td></tr></tbody></table>

pulldown testi, zorlu protein-protein etkileşimlerini test etmek İçin zaman verimli bir araç olarak bakteri hücrelerinde ko-ekspresyon ile birleştiğinde

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown, kolay ve yaygın olarak kullanılan bir protein-protein etkileşim testidir. Bununla birlikte, in vitro olarak etkili bir şekilde bir araya gelmeyen protein komplekslerini incelemede sınırlamaları vardır. Bu tür kompleksler, ko-translasyonel montaj ve moleküler şaperonların varlığını gerektirebilir; ya in vitro olarak ayrışamayan ve yeniden birleşemeyen kararlı oligomerler oluştururlar ya da bağlayıcı bir partner olmadan kararsızdırlar. Bu sorunların üstesinden gelmek için, geleneksel pulldown tekniklerinin izlediği bir dizi uyumlu vektör kullanarak farklı şekilde etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonuna dayanan bir yöntem kullanmak mümkündür. İş akışı, geleneksel pulldown'a kıyasla daha zaman verimlidir, çünkü etkileşime giren proteinlerin ayrı ayrı saflaştırılması ve sonraki inkübasyonlarının zaman alıcı adımlarından yoksundur. Diğer bir avantaj, önemli ölçüde daha az sayıda adım ve in vitro ortamda bulunan proteinlerin proteoliz ve oksidasyona maruz kaldığı daha kısa bir süre nedeniyle daha yüksek bir tekrarlanabilirliktir. Yöntem, diğer in vitro tekniklerin uygun olmadığı tespit edildiğinde bir dizi protein-protein etkileşimini incelemek için başarıyla uygulandı. Yöntem, protein-protein etkileşimlerini toplu olarak test etmek için kullanılabilir. BTB alanı ile içsel olarak düzensiz proteinler arasındaki etkileşimlerin ve çinko-parmak ile ilişkili alanların heterodimerlerinin çalışmaları için temsili sonuçlar gösterilmiştir.

Açıklanan yöntem birçok farklı hedefle rutin olarak kullanılmıştır. Burada, geleneksel pulldown teknikleri kullanılarak elde edilemeyen bazı temsili sonuçlar sunulmaktadır. Birincisi, spesifik ZAD (Çinko-parmak ile ilişkili alan) dimerizasyonunun incelenmesidir11. ZAD'ler stabil ve spesifik dimerler oluşturur, heterodimerler sadece paralog gruplar içindeki yakından ilişkili alanlar arasında mümkündür. Bu alanlar tarafından oluşturulan dimerler kararlıdır ve en az birkaç gün boyunca ayrışmazlar; Bu...

Burada, bir dizi uyumlu vektör kullanarak diferansiyel olarak etiketlenmiş proteinlerin bakteriyel birlikte ekspresyonu için bir yöntem açıklıyoruz, ardından in vitro olarak bir araya gelemeyen protein komplekslerini incelemek için geleneksel pulldown teknikleri izleniyor.

Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Bu yöntem, heterodimer oluşumu gibi verimli test örnekleri için birlikte ekspresyon gerektiren protein komplekslerinin oluşumlarını incelemeye izin verir. Bu yöntemin ana uç potansiyeli, verimli karmaşık montajı teşvik etmek için uyumlu vektörlerin kombinasyonlarını kullanarak farklı şekilde etiketlenmiş çalışılmış proteinlerin birlikte ekspresyonundan, zaman açısından verimli iş akışından ve çoklu etkileşimlerin hızlı yama testine izin veren ölçeklenebilirlikten yararlanmaktır. Bu yöntem aynı zamanda optimal protein ekspresyonu ve saflaştırma koşullarının hızlı bir şekilde taranması için de kullanılabilir.Görsel gösterim, protokolün birlikte ifade kurulumu, hücre bozulması ve sonraki açılır adımlar gibi kritik adımlarının doğru bir şekilde gerçekleştirilmesine yardımcı olur. Başlamak için, Luria-Bertani'de Escherichia coli BL21 (DE3) suşunu veya LB'yi, 37 santigrat derecelik ortamda, 0.1 ila 0.2'lik bir optik yoğunluğa veya OD'ye kadar büyütün. Bakteriyel süspansiyonun bir mililitresini dört santigrat derecede 9.000 G'de bir dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın.Daha sonra, 0,5 mililitre buz gibi soğuk dönüşüm tamponu veya TB ekleyin ve buz üzerinde 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, dört santigrat derecede 8.000 G'de 30 saniye boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Daha sonra, 100 mikrolitre TB tamponu, her vektörün 100 nanogramını ekleyin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.150 saniye boyunca 42 santigrat derecede ısıtın, ardından bir dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Daha sonra, antibiyotiksiz bir mililitre LB ortamı ekleyin ve 90 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kuluçkadan sonra, süspansiyonu% 0.5 glikoz ve karşılık gelen antibiyotikler içeren bir LB agar plakasına kaplamadan önce peleti 100 mikrolitre LB ortamında santrifüj edin ve yeniden askıya alın.Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri plakadan iki mililitre LB ortamı ile karşılık gelen antibiyotiklerle 50 mililitre LB ortamına yıkayın. Sonraki deneyler için eksi 70 santigrat derecede eksi% 20 gliserol içeren bir aliquot depolamadan önce metal iyonları veya diğer bilinen ko-faktörleri ekleyin.Hücreleri 37 santigrat derecede 220 RPM'lik sabit bir dönüşle 0,5 ila 0,7 OD'ye büyütün. Kültürü oda sıcaklığına soğutun ve IPTG'yi bir milimolün son konsantrasyonuna ekleyin. İndüklenmemiş numunenin kontrolü olarak 20 mikrolitrelik bir hücre süspansiyonu aliquot'u saklayın.Hücreleri gece boyunca 18 santigrat derecede 220 RPM'de inkübe edin. Ertesi gün, bakteriyel süspansiyonu iki parçaya bölün ve protein ekspresyonunu doğrulamak için 20 mikrolitrelik alikotları saklayın. Kalan hücre süspansiyonunu 15 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüj edin.Pulldown testi için, peletleri bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponunda, proteaz inhibitörleri ve deneyden hemen önce eklenen indirgeyici ajanlarla yeniden askıya alın. Test edilen proteinler için tampon bileşimini ayarlayın. Buz üzerinde sonikasyon ile hücreleri bozun ve elektroforez için 20 mikrolitrelik bir aliquot saklayın.30 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüj yapın ve elektroforez için 20 mikrolitre arıtılmış lizat toplayın. Reçineyi 10 dakika boyunca bir mililitre buz gibi soğuk lizis tamponu ile dengeleyin, ardından 30 saniye boyunca 2.000 G'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Reçineye hücre lizatları ekleyin ve 15 RPM'lik sabit bir dönüşte 10 dakika boyunca inkübe edin.Daha sonra, analiz için bağlanmamış fraksiyonun 20 mikrolitresini toplamadan önce süpernatantı santrifüj edin ve atın. Daha sonra, bir mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu ekleyin ve bir dakika boyunca inkübe edin. Yine, süpernatanı santrifüj yapın ve atın.Ardından, buz gibi soğuk yıkama tamponu ile iki uzun yıkama gerçekleştirin. İkinci yıkamadan sonra, bağlı proteinleri 50 mikrolitre elüsyon tamponu ile 10 dakika boyunca dört santigrat derecede 1.200 RPM'de bir çalkalayıcıda süzün. Salınan proteinleri SDS poliakrilamid jel elektroforezi ile analiz edin.Çinko parmakla ilişkili alan veya ZAD, maltoz bağlayıcı protein veya MBP'de homo-dimerizasyon ve 6xHistidin pulldown tahlilleri ile ilgili çalışmalar burada gösterilmiştir. MBP ve Thioredoxin 6xHistidin-kaynaşmış ZAD'lerin birlikte ekspresyonu, MBP pulldown testinin SDS-PAGE sonuçlarında ek bir bant olarak görünen, iyi ve tekrarlanabilir homodimerizasyon aktivitesi gösterir. Alternatif kompleks oluşumu incelemek için yöntemi kullanmanın bir başka örneği burada gösterilmiştir.Ortak ifade testinde, 6xHistidine etiketli ENY2 hem GST etiketli Sgf11 hem de MBP-CTCF ile etkileşime girdi, ancak MBP pulldown'larında GST-Sgf11 yoktu ve bunun tersi de geçerliydi. Burada, geleneksel pulldown testinin iş akışında gerekli zaman aralıklarının, birlikte ifadeye bağlı pulldown ile karşılaştırıldığında adım adım karşılaştırılması gösterilmektedir. CP190 proteininin BTB alanı ile Drosophila CTCF proteininin GST etiketli C-terminal alanı arasındaki aynı etkileşimi incelemek için her iki tekniğin de kullanılmasının sonuçları burada gösterilmiştir.Doğru afinite ve çözünürlük testi, Thioredoxin, GST veya MBP seçimi, tahlilin verimli bir şekilde yürütülmesi için kritik öneme sahiptir. Bir diğer kritik adım hızlı ve düzgün hücre bozulmasıdır. Çok uçlu sonikatör probların kullanılması şiddetle tavsiye edilir.Bu yöntem, geleneksel pulldown testinde saflaştırılmış proteinlerin inkübasyonu sırasında ayrılmayan homodimerler oluşturan protein alanları arasındaki heterodimer oluşumunun doğrudan incelenmesine izin verir.

pulldown-assay-coupled-with-co-expression-bacteria-cells-as-time

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Test protein-protein etkileşim protein işlevsellik diseksiyon için vazgeçilmezdir. Burada, bir...

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Bu videoda, boncuk tabanlı bir yakınlık testi olan güçlendirilmiş ışıldayan yakınlık homojen testini gösteriyoruz. Protein etkileşimlerini inhibe eden potansiyel küçük molekülleri taramak için etkileşime girme eğiliminde olan iki protein ile hareketsiz hale getirilmiş, homojen boyutta alıcı ve verici boncuklar kullanır.

Amplifiye Lüminesan Yakınlık Homojen Deneyi: Protein-Protein Etkileşimlerini İnhibe Eden Küçük Molekülleri Taramak için Boncuk Tabanlı Bir Yakınlık Testi

Bu video, protein-protein etkileşimini incelemek için ökaryotik hücrelerden protein komplekslerini saflaştırmaya yönelik bir teknik olan tandem afinite saflaştırmasını göstermektedir. Kompleks, farklı epitop etiketleriyle etiketlenmiş iki protein içerir. Kompleksin, iki farklı etiket için bir afiniteye sahip iki reçine kullanılarak sıralı bir şekilde saflaştırılması üzerine, elütede her iki proteinin varlığı, ikisi arasındaki etkileşimi doğrular.

Protein-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Tandem Afinite Saflaştırma Testi

Bu makale, ilgilenilen bir protein ile E. coli'deki diğer faktörler arasındaki etkileşimleri izlemek için bölgeye özgü fotoçapraz bağlama ile birlikte nabız kovalama radyo etiketlemesinin kullanımını göstermektedir. Geleneksel kimyasal çapraz bağlama yöntemlerinden farklı olarak, bu yaklaşım, canlı bir hücredeki düzenli bir montaj yolunun yüksek çözünürlüklü "anlık görüntülerini" oluşturur.

Bölgeye Özgü Çapraz Bağlama Kullanarak Salgılanan Bir Bakteriyel Virülans Faktörünün Montajının İzlenmesi

Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Protein etkileşimleri: SILAC immunopresipitasyon deneyler yeni proteini keşfetmek için güçlü bir araç temsil eder. Sağlayarak kontrol ve test örnekleri, gerçek etkileşim hem de protein bolluğu doğru nispi miktar kolaylıkla deneysel kirletici ayırt edilebilir ve düşük afiniteli etkileşimler daha az sıkı tampon koşullarında kullanımı yoluyla korunur.

SILAC-immunoprecipitation Kantitatif PROTEOMİK kullanma Memeli Hücrelerde Protein Etkileşim Ortakların Kimlik

Proteinler birbirleri ile etkileşim halindedir ve bu etkileşimler fonksiyonlarını büyük ölçüde belirler. Protein etkileşim ortakları, dihidrofolat redüktaz protein fragmanı tamamlama testine (DHFR-PCA) dayalı bir maya uygunluk testi kullanılarak in vivo olarak yüksek verimli olarak tanımlanabilir.

Yaşayan Hücrelerde Protein-fragmanı tamamlama Assay (PCA) ile genom Protein-protein etkileşimi Eleme

Protein ko-ekspresyonu, protein komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasına güçlü bir alternatiftir ve in vivo biyokimyasal ve genetik testlerin gerçekleştirilmesinde yardımcı olur. Burada, protein kompleksleri elde etmek ve hücrelerin mutasyon frekansını ayarlamak için Escherichia coli'de protein ko-ekspresyonunun kullanımını rapor ediyoruz.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Öğrenin bakteri hücrelerinde pulldown testi ile protein-protein etkileşimlerini hızlıca analiz etme yöntemini. Escherichia coli BL21(DE3) kullanarak heterodimer oluşumunu ve kompleks montajını verimli şekilde çalışın.

Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde (Video) | JoVE Journal

Pulldown Testi, Zorlu Protein-Protein Etkileşimlerini Test Etmek İçin Zaman Verimli Bir Araç Olarak Bakteri Hücrelerinde Ko-Ekspresyon ile Birleştiğinde

Daha fazla video keşfet