Name: Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Öğrenin, boncuk toplama tahlilleri ile hücre yapışma moleküllerinin yapışkan özelliklerini hızlıca karakterize etme yöntemini. Protein G ile fonksiyonlandırılmış manyetik boncuklar kullanılarak ekzodomainler yakalanır ve görüntü analizi ile kantitatif sonuçlar elde edilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma bir NSF/ARRA ödülü (IOS 0920357) ve NIH'den bir ödül (5R21MH098463) ile desteklenmiştir.

1. Hücre Hazırlanması (Gün 0 -2) <ol><li> Bölünmüş HEK293 hücreleri: 1 -% 80 konfluent (2-3 gün) ve% 0.05 Tripsin-EDTA çözeltisi kullanılarak 5 60 kadar,% 5 CO2 37 ° C&#39;de büyüme ortamı içinde inkübe edilir. Her durum için, 2 x 100 mm&#39;lik tabaklar içerisinde kültürü hücreleri. </li></ol> 2. Hücre transfeksiyonu (Gün 1) <ol><li> Bu Lipofectamine gibi bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak plazmid kodlayan Fc füzyonu ile transfekte edilmiş HEK293 hücreleri. Benzer transfeksiyon verimliliği neden alternatif yöntemleri de kullanılabilir. </li><li> 24 saat boyunca kuluçka transfekte hücreleri dönün. </li></ol> 3. Hücre Yayılma (Gün 2) <ol><li> 37 ° C&#39;ye kadar Cenin Sığır Serumu (-FBS olmadan) ön ısıtma Büyüme Ortamı. </li><li> Tabaklar 10 mi Büyüme Ortamı -FBS ile 2x durulayın ve 1 saat boyunca 37 ° C inkübatör bulaşıkları döner. </li><li> 3 yıkamadan toplam, 10 mL büyüme ortamında -FBS ile kültürler yemekler bir kez daha çalkalayın. </li><li> Incuasitleme ortam toplama önce FBS&#39;siz diğer bir 48 saat boyunca 37 ° C &#39;de transfekte edilmiş HEK293 hücreleri. </li></ol> 4. Boncuk Toplama (Gün 4) <ol><li> Kültür kaplarından ortamı toplamak için, hücre yıkıntıları pelet haline getirildi, 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de 50 ml konik tüp ve hızlı yemekler her biri bir medya transferi. </li><li> 30 ml şırınga ve 0.45 mikron şırınga filtre kullanarak bir santrifüj filtre içine 50 ml konik tüp filtre medya. </li><li> Konsantre kültür ortamı hacmi yaklaşık 500 ul (yaklaşık 15 dakika) kadar 4000 x g ve 4 ° C&#39;de santrifüj filtresi Spin. Tüm kültür ortamı ilave edildi ve konsantre edildi edilene kadar yineleyin. </li><li> Bir mıknatıs üzerinde buz her bir numune için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü Bağlama Tamponu soğuk, yer 1 ml Protein G, manyetik boncuk 1.5 ul tampon ve çıkartın. Hemen Protein G, manyetik boncuklar, konsantre kültür ortamı eklenir. </li><li> 2 saat boyunca 4 ° C&#39;de tüpler döndürün. </li><li> Plbir mıknatıs üzerinde ace tüpleri ve ortamı çıkarın. Çabuk buz ile iki kez Bağlama Buffer 1 ml boncuk yıkayın ve sonra Bağlama Tamponu 300 ul boncuklar tekrar süspansiyon. </li><li> Bölünmüş 2 boru, her bir tüpe 150 ul boncuk halinde yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve daha sonra sırasıyla, &quot;kalsiyum&quot; ve &quot;Kalsiyum&quot; koşulları için 200 mM CaCl2 ya da 200 mM EDTA, 1.5 ul ekleyin. </li><li> Bir depresyon Transfer her durumda 100 ul iyi kaydırın ve iletilen ışık mikroskobu (Şekil 2) kullanılarak mikrograflannı toplamak. İstenen her bir zaman noktasında her bir deney için 5 bakış alanları görüntü toplayın. </li></ol> 5. Veri Analizi <ol><li> ImageJ veya karşılaştırılabilir görüntü analiz yazılımı, Dosya açılan menüden İthalat / Görüntü Sırasını ... kullanarak beş görüntü veri setleri açık birini kullanma. Bu bir görüntü yığını olarak açılacaktır. </li><li> Görüntü / Özellikler ... iletişim kutusunda, i değiştirmek1.0 piksel ve set Piksel Genişlik ve Piksel Yükseklik büyücü birimleri. </li><li> Görüntü açılan menüde ayarlayın / Eşiği ... komutunu kullanarak ikili görüntüleri dönüştürmek. Boncuk veya boncuk agrega katkıda pikselleri dahil etmek eşiğini ayarlamak, ama o arka plan ve küçük parçacıkları hariç. Yığınının tüm resimlere uygulayın. </li><li> Set Ölçümler iletişim kutusunda, Alan ve Stack Pozisyon onay kutularını. </li><li> Açılan menüyü analiz içinde ... Parçacıklar analiz çalıştırın. Bu onların büyüklüğü (alanı) ve bunların tespit edildiği görüntü dahil tespit parçacıkların bir listesini oluşturacaktır. </li><li> Deney ve deneysel koşul için bu işlemi tekrarlayın. </li></ol>

<ol><li>Chen, X., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraxial+protocadherin+mediates+cell+sorting+and+tissue+morphogenesis+by+regulating+C-cadherin+adhesion+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity.</a> J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).</li>
<li>Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+binding+of+Ng-CAM+to+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhes.+Commun%22%5BJournal%5D)">Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin.</a> Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).</li>
<li>Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+cDNA+encoding+a+neural+calcium-dependent+cell+adhesion+molecule%3A+its+identity+in+the+cadherin+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family.</a> J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).</li>
<li>Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+cell-cell+adhesion+molecules+%28cadherins%29%3A+subclass+specificities+and+possible+involvement+of+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles.</a> J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).</li>
<li>Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expressed+recombinant+cadherins+mediate+cell+sorting+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems.</a> Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).</li>
<li>Nose, A., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cadherin+cell+adhesion+molecule%3A+its+expression+patterns+associated+with+implantation+and+organogenesis+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos.</a> J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).</li>
<li>Schreiner, D., Weiner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+homophilic+interaction+between+gamma-protocadherin+multimers+greatly+expands+the+molecular+diversity+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).</li>
<li>Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+correlation+between+cell+adhesive+properties+and+some+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins.</a> J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).</li>
<li>Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+molecular+force+measurements+of+multiple+adhesive+interactions+between+cadherin+ectodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).</li>
<li>Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+multiple+adhesive+alignments+and+unbinding+trajectories+between+cadherin+extracellular+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains.</a> Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).</li>
<li>Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+initial+encounter+complex+in+cadherin+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion.</a> Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+cadherin+interactions+and+binding+cooperativity+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).</li>
<li>Yasuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+protocadherin+arcadlin+regulates+dendritic+spine+number+by+triggering+N-cadherin+endocytosis+via+TAO2beta+and+p38+MAP+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases.</a> Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).</li>
<li>Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cadherin+extracellular+repeats+mediate+homophilic+binding+and+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion.</a> J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).</li>
<li>Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complex+of+Protocadherin-19+and+N-cadherin+mediates+a+novel+mechanism+of+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion.</a> J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clustered+protocadherins+Pcdhalpha+and+Pcdhgamma+form+a+heteromeric+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish.</a> Neuroscience. 219, 280-289 (2012).</li>
<li>Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression%2C+alternative+splicing%2C+and+adhesive+properties+of+the+zebrafish+delta1-protocadherins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins.</a> Neuroscience. 199, 523-534 (2011).</li>
<li>Morishita, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cadherin-related+neuronal+receptor%2Fprotocadherin-alpha+first+extracellular+cadherin+domain+reveals+diversity+across+cadherin+families%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families.</a> J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+Drosophila+Dscam+generates+axon+guidance+receptors+that+exhibit+isoform-specific+homophilic+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding.</a> Cell. 118 (5), 619-633 (2004).</li>
<li>Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-adhesion+assays%3A+fabrication+of+an+E-cadherin+substratum+and+isolation+of+lateral+and+Basal+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches.</a> Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Hücre yapışması, çok hücreli yaşamının önemli bir özelliğidir ve hücre yüzey proteinleri, geniş bir dizi aracılık eder. Bunlardan, ayrıntılı, yapışkan özellikleri sadece nispeten küçük bir kısmı için anlaşılır. Burada, uygun bir epitop ucuna birleştirilen bir salgılanan ektoalanlarının homofilik yapışkanlı araştırmak için basit, hızlı bir protokol tanımlanmıştır. Bu yaklaşım, önemli avantajlara sahiptir. Amaçla yeterli miktarlarda protein, 100 mm&#39;lik tabaklar geçici transfeksiyonu ile elde edilebilir Üretim, stabil ...

Hücre-hücre yapışma çok hücreli organizmaların gelişimi ve bütünlüğü için gerekli olan ve hücre yüzeyi zengin bir molekül dizisi aracılık eder. Birçok tespit edilmesi gerekmektedir, bu da yapışma moleküllerinin çoğu, tanımlanmış ve karakterize edilmiştir. Çeşitli yöntemler, atomik kuvvet mikroskopisi ve yüzey kuvvet spektroskopisi 9-12 gibi hücre sıralama deneyleri, hücre toplama deneyleri 1-8 ve biyofiziksel yöntemler dahil olmak üzere, hücre yapışma moleküllerinin özellikleri (CAMlar) araştırmak için kullanılır. Da hücre dizileri kullanılarak in vitro sistemlerde basitleştirilmiş karmaşıklığı zor bir varsayımsal CAM yapışkanlık özelliklerini belirlemek için yapar. Tipik olarak, bir molekül, bir yapışkan olmayan hücre hattı içine geçirildiğinde, hücre birikmesinin sebep olursa CAM olarak kabul edilir. Ancak, bu yapışkan etkinliğinin doğrudan bir kanıt olmadığı açıktır. Örneğin, bir hücre yüzeyi dengesini ve çıkışını kolaylaştırmakTAT aynı zamanda, artmış hücre toplanmasının 1,13 ile sonuçlanacaktır. Ayrıca, gerçek bir TAT hücre çizgisi, hücre yüzeyi gönderilmesi veya stabilizasyonu için gerekli diğer ko-faktörlerini sahip olmayan hücre toplanmasını aracılık başarısız olabilir. Bu komplike faktörleri önlemek için, fikrine dayanır daha doğrudan tahlilleri kullanılabilecektir yapışma etkileşimlerini hücre dışı bir alanındaki bir içsel özelliği biyokimyasal olmalıdır. Boncuklar, Ng-CAM, başlangıçta 2 karakterize etmek için kullanıldı ise de, bu deneyler, kaderin-aracılı adhezyon 12,14,15 araştırmak amacıyla genişletilmiştir. C-kaderin ekto-Fc füzyon füzyonlarının kullanarak, çok sayıda laboratuar Gumbiner kadherin tekrarlar etkileşimleri 14 homofilik katkıda bulunduğunu göstermiştir. Drosophila &#39;dan gelen protocadherins 1,15-18 ve Dscam izoformlarının bir dizi gibi benzer topuk kısmı agregasyon analizleri, E-kadherin ve N-kadherin yapışma kullanılması da, 12,15 karakterize edilmiştir <em&gt; 19. Burada farazi homofilik kamları (Şekil 1), salgılanan, epitop ektoalanlarının yapışma aktivitesini karakterize etmek için nispeten basit ve hızlı bir deneyi tarif eder. Biz öncelikle kaderin süperailesinin üyelerini karakterize bu tahlili kullandık.

<table><tbody><tr><td>pFc-N1 plazmid</td><td>Addgene</td><td>To to submitted</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 hücreleri</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech - Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>100x Pen-Strep (10.000 U/ml)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>%0.05 Tripsin-EDTA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11668030</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads &ndash; Protein G</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>Depresyon slaytları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>71878-06</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Ultracel-10 membranlı Santrifüj Filtre Ünitesi</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm şırınga filtresi</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 Mıknatıs Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ) Görüntü Analiz Yazılımı</td><td><a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tamponlar/Çözeltiler</td></tr><tr><td>Tablosu Büyüme Ortamı</td><td>DMEM +% 10 FBS + Pen-Strep</td><td>Filtresi sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın.</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme Medyası &ndash; FBS</td><td>DMEM + Pen-Strep</td><td>Filtresi sterilize edilir ve 4 ° C'de saklanır.</td><td></td></tr><tr><td>Bağlayıcı Tampon</td><td>50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, %0.2 BSA</td><td>Vorteks çözünene kadar buz üzerinde tutun.</td><td></td></tr></tbody></table>

putatif hücre yapışma molekülleri karakterizasyonu için boncuk toplama tahliller

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Hücre-hücre yapışması çok-hücreli yaşam için esas olduğunu ve hücre yüzeyi proteinlerinin çeşitli bir dizi aracılık eder. Bununla birlikte, bu proteinler çoğu için yapışma etkileşimlerini tam olarak anlaşılamamıştır. Burada farazi homofilik hücre yapışma moleküllerinin yapışkanlık özelliklerini karakterize etmek için basit ve hızlı bir yöntem sunuyoruz. Kültürlenmiş HEK293 hücreleri DNA plazmid, bir hücre yüzeyi proteini, salgılanan, epitop takılı ekto sahası kodlayan yapılarla transfekte edilir. Epitop takısı için spesifik işlevselleştirilmiş boncuk kullanılarak, çözünür, salgılanan füzyon proteini kültür ortamından tespit edilir. Kaplı boncuklar, homofilik yapışma test etmek üzere deneyler sıralama boncuk agregasyonu deneylerinde ya da floresan boncuğu direkt olarak kullanılabilir. Eğer arzu edilirse, o zaman mutagenez yapışması için gerekli olan özel amino asitleri ya da etki aydınlatmak için kullanılabilir. Bu deney, stabil hücre hatlarının üretilmesini gerektirmez, ifade edilen proteinin sadece küçük miktarlarda gerektirir ve acco edilebilir4 gün içinde mplished.

Bir örnek deney Fc (NcadEC-Fc) bağlı olarak N-kaderin-ekto-saha ile kalsiyuma bağlı boncuk toplanmasını gösterir, Şekil 2, sunulmuştur. Kalsiyum yokluğunda, taneler bir araya çok az veya hiç bir eğilim göstermedikleri ve zaman (Şekil 1A, C), olan, toplam ebadında bir artış vardır. Kalsiyum varlığında, tanecikler toplam miktarı zaman (Şekil 1B, C) ​​üzerinde giderek artan NcadEC-Fc göstermek sağlam birleştirilmesi ile kaplanmıştır. Bu deney, beş örtüşmeyen alanlardan gör...

Burada, varsayılan hücre adezyon moleküllerinin içsel yapışkan özelliklerini karakterize etmek için basit, hızlı bir yöntem sunuyoruz. Bir hücre adezyon molekülünün salgılanan, epitop etiketli ektodomaini, kültür ortamından küçük, düzgün işlevselleştirilmiş boncuklar üzerinde yakalanır. Bu boncuklar daha sonra basit boncuk agregasyon testlerinde hemen kullanılabilir.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

Bu prosedürün genel amacı, protein ekto alanlarının homofilik yapışmaya aracılık etme yeteneğini test etmektir, bu başarmak için, bir ekto alan fragmanının insan IgG'sinin FC bölgesine füzyonunu kodlayan plazmitler, HEC 2 93 hücrelerine transfekte edilir. Salgılanan Odin FC füzyon proteinleri, protein G'ye konjuge edilmiş manyetik boncuklar üzerinde yakalanır ve bir yıkamanın ardından, kaplanmış boncukların çözelti içinde etkileşime girmesine izin verilir. Kaplanmış boncuklar daha sonra agregasyonun derecesini değerlendirmek için görüntülenir ve son olarak nicelleştirilir Basit görüntü analizi kullanılarak, elde edilen veriler, protein yedeğinin homofilik yapışmaya aracılık edip etmediğini ortaya çıkarır.Bu tekniğin hücre agregasyon tahlilleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, hızlı, basit olması ve seçtiğiniz proteinin yapışkan aktivitesini doğrudan test etmesidir. Bu tekniği göstermek, laboratuvardan kıdemli bir bilim adamı olan Dr.Michelle Eman olacak. Bu prosedüre, transfeksiyondan iki ila üç gün önce, ECFC'de NCA için kültürlenmiş hücreleri hazırlayarak başlayın.HEC 2 93 hücrelerini kültür kaplarından ayırmak için EDTA'da %0,05'lik açmalar kullanın. Her koşul için iki adet 100 milimetrelik tabak hazırlayın. Hücreleri bir ila beşe bölün ve sonra onları kültürleyin.Takviye edilmiş büyüme ortamı. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile% 60 ila 80 birleşim olana kadar inkübe edin. Transfeksiyon gününde, FC füzyonunu kodlayan bir plazmid eklemek için lipo gibi bir reaktif kullanın.Transfeksiyondan sonra, hücreleri transfeksiyondan sonraki gün 24 saat boyunca inkübatöre geri koyun Ön ısıtma, pent strep ile DMEM ve fetal sığır serumu olmadan 37 santigrat dereceye kadar. Her bir kabı 10 mililitre ısıtılmış ortamla iki kez durulayın ve daha sonra bulaşıkları inkübasyondan sonra bir saat boyunca 37 derece Santigrat inkübatöre geri koyun, kültür kaplarını bir kez daha 10 mililitre DMEM ile durulayın toplam üç yıkama için fetal sığır serumu olmadan, daha sonra kesilen hücreleri ortamı toplamadan önce 48 saat daha 37 santigrat derecede inkübe edin. Transfeksiyondan dört gün sonra, ortamı her bir kültür kabı çiftinden toplamak için serolojik bir pipet kullanın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Daha sonra, sıkma işleminden sonra hücresel kalıntıları peletlemek için ortamı beş dakikada 500 Gs'de santrifüjleyin, ortamı her 50 mililitrelik konik tüpten 30 mililitrelik bir şırıngaya dökün ve 0.45 mikronluk bir şırıngadan süzün. Bir santrifüj yoğunlaştırıcıya filtreleyin. Santrifüj filtreleri, konsantre kültür ortamının hacmi yaklaşık 500 mikrolitreye düşene kadar döndürün.Bu işlem yaklaşık 15 dakika sürer. Tüm kültür ortamı eklenene ve konsantre olana kadar bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, her numune için 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde, 1.5 mikrolitre protein G manyetik boncuktan bir mililitre buz gibi soğuk bağlayıcı tampona.Bu prosedürün en zor yönü boncuk toplamadır. Başarıyı sağlamak için prosedürü tam olarak uyguladığınızdan emin olun. Boncukları hızlı bir şekilde izleyin, ancak çok sert değil.Tüpün yan tarafında kurumasına veya mıknatıs üzerinde çok uzun süre kalmasına asla izin verilmemelidir. Tüpü bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve bir pipet kullanarak tamponu aspire edin. Daha sonra konsantre kültür ortamını hemen protein G manyetik boncuklarına ekleyin.Tüpleri iki saat boyunca dört santigrat derecede döndürün. Tüpleri bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve ortamı hızlı bir şekilde çıkarın. Boncukları bir mililitre buz gibi soğuk bağlama tamponu ile iki kez yıkayın ve ardından boncukları 300 mikrolitre bağlama tamponu içinde yeniden süspanse edin.Yeniden asılı boncukları, her tüpe 150 mikrolitre olacak şekilde iki tüpe bölün. Daha sonra sırasıyla kalsiyum ve kalsiyum koşulları için 1.5 mikrolitre kalsiyum klorür veya EDTA ekleyin. Her koşuldan 100 mikrolitreyi bir depresyona aktarın.İletilen bir ışık mikroskobu kullanarak iyi kaydırın. İstenen her zaman noktasında her deney için beş görüş alanından görüntüler toplayın. Görüntü J veya karşılaştırılabilir görüntü analiz yazılımı kullanma.Açılır menüdeki J görüntüsündeki beş görüntü veri kümesinden birini açın. Ekranın üst kısmında dosya'yı seçin. Ardından içe aktar'ı ve ardından görüntü sırasını seçin.Görüntü dosyalarını içeren klasörü bulun, ardından bunları bir görüntü yığını olarak açın. Ardından, açılır menü çubuğunda resme tıklayın, ardından özellikleri seçin. Orada özellikler penceresini açmak için.Görüntü birimlerini piksel olarak değiştirin ve piksel genişliğini ve piksel yüksekliğini 1,0 olarak ayarlayın. Resme tekrar tıklayın, eşik penceresini açmak için ayarla ve ardından eşiği seçin ve görüntü eşiğini ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın. Boncuklara katkıda bulunan pikselleri dahil edin ve küçük parçacıkları hariç tutun.Eşiği görüntü yığınındaki tüm görüntülere uygulayın. Sonraki, ekranın üst kısmındaki açılır menü çubuğunda. Analiz et'e tıklayın.Ardından, ekranın üst kısmındaki alanı ve yığın konumunu seçin onay kutularını kullanarak ölçüm iletişim kutusunu açmak için ölçümleri ayarla'yı seçin. Analiz et'e tıklayın, ardından parçacıkları analiz et'i seçin. Bu, boyutları ve tanımlandıkları görüntü de dahil olmak üzere tanımlanmış parçacıkların bir listesini oluşturacaktır.Zebra balığı ve kaderinin kalsiyuma bağımlı yapışma kabiliyetini belirlemek için her deney ve her deney koşulu için bu işlemi tekrarlayın. HEC 2 9 3 hücreleri NCAT herrin OD domain ile kaynaşmış iki fc ile transfekte edildi ve aşağıdaki kalsiyum bağımlı boncuk agregasyon hücreleri bu görüntülerde görülebileceği gibi bu videoda anlatıldığı gibi görüntülendi ve analiz edildi. Kalsiyum yokluğunda, boncuklar toplanma eğilimi çok az gösterir veya hiç göstermez ve kalsiyum varlığında zamanla toplam boyutunda bir artış olmaz.Bununla birlikte, burada NCAT ve ECFC ile kaplanmış atımlar, yarı kantitatif bir yapışma ölçüsü olarak zamanla artan agrega boyutu ile sağlam bir agregasyon gösterir. Üç deneyden iletilen ışık görüntüleri, agregaların ortalama boyutunu belirlemek için analiz edildi. Bu grafikte de görüleceği gibi, kalsiyum varlığında ve kalsiyum yokluğunda ncoer ECFC kaplı boncukların agregasyonu 15 dakikalık aralıklarla belirlenmiştir.Bir saat boyunca, bu veriler, zebra balığı n kaderinin ekto alanının kalsiyuma bağlı homofilik yapışmaya aracılık ettiğini ortaya koymaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, yapışmanın ilgilendiğiniz proteinin içsel bir biyokimyasal özelliği olup olmadığını nasıl test edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

bead-aggregation-assays-for-characterization-putative-cell-adhesion

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hem molekülleri etkileşen hücrelerin yüzeylerinde demirlemiş olan reseptör-ligand etkileşimi kinetiği ölçmek için bir yapışma frekans tahlil açıklanmıştır. Bu mekanik tabanlı test mikropipet basınçlı bir insan adezyon sensörü olarak kırmızı kan hücresi ve integrin αLβ2 ve hücrelerarası adezyon molekülü-1 reseptörleri ve ligandlar etkileşim olarak kullanarak örneklenir.

Yapışma için Frekans Testi Yerinde</emHücre-Hücre Arayüz Çapraz Junctional Moleküler Etkileşimler> Kinetik Analizi

Bu videoda, HEK hücre agregasyon testi yoluyla sinaptik hücre adezyon molekülleri arasındaki hücre içi etkileşimleri ölçme tekniğini gösteriyoruz. Bu tahlilde, istenen bir presinaptik hücre adezyon molekülünü ve bir floresan proteini eksprese eden eşit sayıda HEK hücresi, bir post-sinaptik hücre adezyon molekülü ve başka bir floresan proteini eksprese eden HEK hücreleri ile karıştırılır. Hücre adezyon molekülleri arasındaki etkileşim, hücreleri floresan mikroskobu ile ölçülebilen toplanmaya...

Hücre Adezyon Molekülleri Arasındaki Trans Etkileşimleri Tespit Etmek için Hücre Agregasyon Testi

Bir endotel hücre tek tabakası içindeki gerçek yapışkan hücre sayısının kantitasyonuna izin veren bir in vitro yöntem sunuyoruz.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

Konak hücrelere bakteri bağlanması, konak kolonizasyonu ve enfeksiyonu sırasında önemli bir adımdır. Bu protokol, diğer bakteriyel faktörlerden bağımsız olarak, bireysel adezinlerin bu süreçlere katkısının analizine izin veren biyomimetik malzemeler olarak polimere bağlı rekombinant adezinlerin üretilmesini tanımlar.

Bakteri-konak Etkileşimleri karakterize etmek Biyomimetik Malzemeler

Bu akış yapışma deneyi T hücresi epitel hücre etkileşimleri basit, çok etkili bir model sağlar. Bir şırınga pompası kayma gerilimi oluşturmak için kullanılır ve konfokal mikroskopi ölçümü için görüntü yakalar. Bu çalışmaların amacı, etkili akış koşulları kullanılarak T hücre yapışmasını ölçümüdür.

T Lenfosit-Yapışma Molekülü Etkileşimleri Çalışmaları Yapışma Altında Kesme Stres Testi

mekanik gerilim iletmek ve doku homeostazında ve geliştirme dahil sinyal yollarını başlatmak gibi hücre yüzey yapışıklıklar, mechanotransduction merkezi bulunmaktadır. Burada, ligand kaplı manyetik mikroboncukları ve yapışma reseptörlerine kuvvet uygulaması ile, gerilim cevap olarak aktive edilir biyokimyasal yollar kesme için bir protokol mevcut.

Manyetik Boncuk Kullanarak Mekanik Gerilim Cevabı Hücre Yüzey Yapışma Modelleme Analizi

Bu çalışmada yardımcı programı ve kolaylığı nicel hücre zarı uzantısı ölçüm ve hücre yapışkanlı kapasite için onun korelasyon gösterir. Temsil edici bir örnek olarak, biz burada Dickkopf ilgili biraz protein 3 (DKK3) artan lobopodia oluşumu teşvik ve vitroAdrenokortikal Karsinom hücre adhesiveness hücreleri göstermek.

Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

Gemi duvara bağışıklık hücrelerinin dinamik yapışma gut posta için bir önkoşuldur. Burada, insan hücreleri kılcal isteyebileğinizi kaplı kullanarak dinamik hücre yapışma anti-integrin antikorlar, kemokinler ya da başka etmenlerin etkisi analizi için fonksiyonel vitro tahlil için bir iletişim kuralı mevcut.

Dinamik yapışma tahlil için anti-yapışma tedaviler iltihabi bağırsak hastalığı fonksiyonel analiz

Burada, floresan mikroskopisi kullanarak heterolog bir hücre sisteminde transta ligand-reseptör etkileşimlerini hızlı ve yarı niteliksel olarak ölçmek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz.

Heterolog Hücre Sisteminde Protein Toplama Yoluyla Hücrelerarası Etkileşimlerin Ölçülmesi

Makalede, 1) odak yapışıklıklarının büyüklüğü ve sayısı ile 2) hücre şekil indeksi ve MCF7 hücrelerinin eşzamanlı monolayers konfokal görüntülerinden dağılımının nicelikselleştirilmesi açıklanmaktadır.

MCF7 HücreLi Monokatmanlarda Hücre-Substrat Adezyon Alanı ve Hücre Şekli Dağılımlarının Ölçülmesi

Bu protokol, hızlı hücre yuvarlaması yapışması sırasında yapışma olaylarını görüntüleyene kadar yapışma ayak izi testini gerçekleştirmek için deneysel prosedürleri sunar.

Yapışma Ayak İzi Tahlili ile Hücre Yuvarlanmasında Görüntüleme Moleküler Yapışması

Öğrenin, boncuk toplama tahlilleri ile hücre yapışma moleküllerinin yapışkan özelliklerini hızlıca karakterize etme yöntemini. Protein G ile fonksiyonlandırılmış manyetik boncuklar kullanılarak ekzodomainler yakalanır ve görüntü analizi ile kantitatif sonuçlar elde edilir.

Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Daha fazla video keşfet