Putatif Hücre yapışma molekülleri Karakterizasyonu için Boncuk Toplama Tahliller

Bu prosedürün genel amacı, protein ekto alanlarının homofilik yapışmaya aracılık etme yeteneğini test etmektir, bu başarmak için, bir ekto alan fragmanının insan IgG'sinin FC bölgesine füzyonunu kodlayan plazmitler, HEC 2 93 hücrelerine transfekte edilir. Salgılanan Odin FC füzyon proteinleri, protein G'ye konjuge edilmiş manyetik boncuklar üzerinde yakalanır ve bir yıkamanın ardından, kaplanmış boncukların çözelti içinde etkileşime girmesine izin verilir. Kaplanmış boncuklar daha sonra agregasyonun derecesini değerlendirmek için görüntülenir ve son olarak nicelleştirilir Basit görüntü analizi kullanılarak, elde edilen veriler, protein yedeğinin homofilik yapışmaya aracılık edip etmediğini ortaya çıkarır.

Bu tekniğin hücre agregasyon tahlilleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajları, hızlı, basit olması ve seçtiğiniz proteinin yapışkan aktivitesini doğrudan test etmesidir. Bu tekniği göstermek, laboratuvardan kıdemli bir bilim adamı olan Dr.Michelle Eman olacak. Bu prosedüre, transfeksiyondan iki ila üç gün önce, ECFC'de NCA için kültürlenmiş hücreleri hazırlayarak başlayın.

HEC 2 93 hücrelerini kültür kaplarından ayırmak için EDTA'da %0,05'lik açmalar kullanın. Her koşul için iki adet 100 milimetrelik tabak hazırlayın. Hücreleri bir ila beşe bölün ve sonra onları kültürleyin.

Takviye edilmiş büyüme ortamı. Hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile% 60 ila 80 birleşim olana kadar inkübe edin. Transfeksiyon gününde, FC füzyonunu kodlayan bir plazmid eklemek için lipo gibi bir reaktif kullanın.

Transfeksiyondan sonra, hücreleri transfeksiyondan sonraki gün 24 saat boyunca inkübatöre geri koyun Ön ısıtma, pent strep ile DMEM ve fetal sığır serumu olmadan 37 santigrat dereceye kadar. Her bir kabı 10 mililitre ısıtılmış ortamla iki kez durulayın ve daha sonra bulaşıkları inkübasyondan sonra bir saat boyunca 37 derece Santigrat inkübatöre geri koyun, kültür kaplarını bir kez daha 10 mililitre DMEM ile durulayın toplam üç yıkama için fetal sığır serumu olmadan, daha sonra kesilen hücreleri ortamı toplamadan önce 48 saat daha 37 santigrat derecede inkübe edin. Transfeksiyondan dört gün sonra, ortamı her bir kültür kabı çiftinden toplamak için serolojik bir pipet kullanın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Daha sonra, sıkma işleminden sonra hücresel kalıntıları peletlemek için ortamı beş dakikada 500 Gs'de santrifüjleyin, ortamı her 50 mililitrelik konik tüpten 30 mililitrelik bir şırıngaya dökün ve 0.45 mikronluk bir şırıngadan süzün. Bir santrifüj yoğunlaştırıcıya filtreleyin. Santrifüj filtreleri, konsantre kültür ortamının hacmi yaklaşık 500 mikrolitreye düşene kadar döndürün.

Bu işlem yaklaşık 15 dakika sürer. Tüm kültür ortamı eklenene ve konsantre olana kadar bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, her numune için 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde, 1.5 mikrolitre protein G manyetik boncuktan bir mililitre buz gibi soğuk bağlayıcı tampona.

Bu prosedürün en zor yönü boncuk toplamadır. Başarıyı sağlamak için prosedürü tam olarak uyguladığınızdan emin olun. Boncukları hızlı bir şekilde izleyin, ancak çok sert değil.

Tüpün yan tarafında kurumasına veya mıknatıs üzerinde çok uzun süre kalmasına asla izin verilmemelidir. Tüpü bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve bir pipet kullanarak tamponu aspire edin. Daha sonra konsantre kültür ortamını hemen protein G manyetik boncuklarına ekleyin.

Tüpleri iki saat boyunca dört santigrat derecede döndürün. Tüpleri bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve ortamı hızlı bir şekilde çıkarın. Boncukları bir mililitre buz gibi soğuk bağlama tamponu ile iki kez yıkayın ve ardından boncukları 300 mikrolitre bağlama tamponu içinde yeniden süspanse edin.

Yeniden asılı boncukları, her tüpe 150 mikrolitre olacak şekilde iki tüpe bölün. Daha sonra sırasıyla kalsiyum ve kalsiyum koşulları için 1.5 mikrolitre kalsiyum klorür veya EDTA ekleyin. Her koşuldan 100 mikrolitreyi bir depresyona aktarın.

İletilen bir ışık mikroskobu kullanarak iyi kaydırın. İstenen her zaman noktasında her deney için beş görüş alanından görüntüler toplayın. Görüntü J veya karşılaştırılabilir görüntü analiz yazılımı kullanma.

Açılır menüdeki J görüntüsündeki beş görüntü veri kümesinden birini açın. Ekranın üst kısmında dosya'yı seçin. Ardından içe aktar'ı ve ardından görüntü sırasını seçin.

Görüntü dosyalarını içeren klasörü bulun, ardından bunları bir görüntü yığını olarak açın. Ardından, açılır menü çubuğunda resme tıklayın, ardından özellikleri seçin. Orada özellikler penceresini açmak için.

Görüntü birimlerini piksel olarak değiştirin ve piksel genişliğini ve piksel yüksekliğini 1,0 olarak ayarlayın. Resme tekrar tıklayın, eşik penceresini açmak için ayarla ve ardından eşiği seçin ve görüntü eşiğini ayarlamak için kaydırıcıyı kullanın. Boncuklara katkıda bulunan pikselleri dahil edin ve küçük parçacıkları hariç tutun.

Eşiği görüntü yığınındaki tüm görüntülere uygulayın. Sonraki, ekranın üst kısmındaki açılır menü çubuğunda. Analiz et'e tıklayın.

Ardından, ekranın üst kısmındaki alanı ve yığın konumunu seçin onay kutularını kullanarak ölçüm iletişim kutusunu açmak için ölçümleri ayarla'yı seçin. Analiz et'e tıklayın, ardından parçacıkları analiz et'i seçin. Bu, boyutları ve tanımlandıkları görüntü de dahil olmak üzere tanımlanmış parçacıkların bir listesini oluşturacaktır.

Zebra balığı ve kaderinin kalsiyuma bağımlı yapışma kabiliyetini belirlemek için her deney ve her deney koşulu için bu işlemi tekrarlayın. HEC 2 9 3 hücreleri NCAT herrin OD domain ile kaynaşmış iki fc ile transfekte edildi ve aşağıdaki kalsiyum bağımlı boncuk agregasyon hücreleri bu görüntülerde görülebileceği gibi bu videoda anlatıldığı gibi görüntülendi ve analiz edildi. Kalsiyum yokluğunda, boncuklar toplanma eğilimi çok az gösterir veya hiç göstermez ve kalsiyum varlığında zamanla toplam boyutunda bir artış olmaz.

Bununla birlikte, burada NCAT ve ECFC ile kaplanmış atımlar, yarı kantitatif bir yapışma ölçüsü olarak zamanla artan agrega boyutu ile sağlam bir agregasyon gösterir. Üç deneyden iletilen ışık görüntüleri, agregaların ortalama boyutunu belirlemek için analiz edildi. Bu grafikte de görüleceği gibi, kalsiyum varlığında ve kalsiyum yokluğunda ncoer ECFC kaplı boncukların agregasyonu 15 dakikalık aralıklarla belirlenmiştir.

Bir saat boyunca, bu veriler, zebra balığı n kaderinin ekto alanının kalsiyuma bağlı homofilik yapışmaya aracılık ettiğini ortaya koymaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, yapışmanın ilgilendiğiniz proteinin içsel bir biyokimyasal özelliği olup olmadığını nasıl test edeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.