Üç Boyutlu Motor Sinir Organoid Üretimi

Bu protokol, vücut dışındaki insan iPS hücrelerinden türetilen motor sinir organoidi kullanılarak akson demetlerinin gelişiminin ve hastalığının altında yatan mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştırır. Nöronal sferoid ve ısmarlama mikrokültür çiplerini basitçe kültürleyerek, tek yönlü akson demetleri kendiliğinden üretilebilir ve çeşitli aşağı akış deneyleri için kullanılabilir. Motor sinir organoidi, daha önceki in vitro sistemlerden daha fizyolojik bir model sağlayarak, LS de dahil olmak üzere motor nöron hastalıkları için ilaçların taranmasını ve test edilmesini kolaylaştırabilir.

Bir çeker ocakta ve uygun KKD'yi giyerek, asetonla temizlenmiş bir silikon gofret üzerine üç mililitre SU-8 2100 dağıtın ve gofretleri bir sıkma kaplayıcının ortasına yerleştirin. Gofret'i vakumla sabitleyin ve SU-8'i gofret yüzeyi boyunca düzgün bir şekilde kaplamak için gofreti dakikada 500 devirde 10 saniye boyunca döndürün, ardından gofret üzerinde 150 mikron kalınlığında bir fotorezist tabakası elde etmek için saniyede 300 devirlik bir ivme ile 30 saniye boyunca dakikada 1.500 devirde döndürün. Yumuşak pişirmeden sonra, fotoğraf maskesini maske hizalayıcıya ayarlayın ve gofreti 60 saniye boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın.

Sıcak bir plaka üzerinde pişirdikten sonra, gofretleri bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalama ile fotorezist geliştiricide 10 ila 20 dakika geliştirin ve işlem sırasında gelişen çözeltiyi bir kez değiştirin. Çipin alt tabakasını doku kültürüne hazırlamak için, taze hazırlanmış PDMS'yi gofret üzerine istenen kalınlığa kadar dökün ve karışımı bir vakum odasında gazdan arındırın. PDMS'yi 60 santigrat derecede en az üç saat fırında kürleyin.

Soğuduktan sonra, kürlenmiş PDMS'yi gofretten kesmek için bir bıçak kullanın, ardından monte edilmiş PDMS doku kültürü çipini elde etmek için orta bir rezervuarı PDMS alt katmanına bağlamak için pişirme ile kürlenmemiş PDMS kullanın. PDMS çipini motor sinir organoid oluşumuna hazırlamak için, çipi ve 76 x 52 milimetrelik bir mikroskop camını en az bir saat boyunca %70 etanol içeren bir Petri kabında sterilize edin. İnkübasyonun sonunda, çipi ıslak mikroskop camına yerleştirin.

Gece boyunca kuruduktan sonra, çip cama yapışmalıdır. Kanalın girişinin bir tarafına DMEM / F30'ye 12 mikrolitrelik bir seyreltilmiş bazal membran matrisi damlası yerleştirin ve mikrokanalın yüzeyini matrisle kaplamak için çözeltiyi girişin diğer tarafından aspire edin. Daha sonra PDMS çipini kaplama solüsyonu ile bir Petri kabında oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Motor nöronlara 3D iPS hücre farklılaşmasını indüklemek için, 10 mikrolitre besleyici ve 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenmiş serumsuz hücre kültürü ortamında 96 oyuklu bir U-alt plakanın uygun sayıda oyuğuna kuyu başına dört kez 10 ila dördüncü iPS hücresi tohumlayın. Ertesi gün, her bir oyuktaki süpernatanı, 10 mikromolar SB431542 ve 100 nanomolar LDN-193189 ile desteklenmiş 100 mikrolitre KSR ortamı ile değiştirin. İkinci ve üçüncü günlerde, süpernatanları 10 mikromolar SB431542, 100 nanomolar LDN-193189, beş mikromolar DAPT, beş mikromolar SU5402, bir mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar yumuşatılmış agonist ile takviye edilmiş 100 mikrolitre KSR ortamı ile değiştirin.

Dördüncü ve beşinci günlerde, süpernatantları 10 mikromolar SB431542, 100 nanomolar LDN193189, beş mikromolar DAPT, beş mikromolar SU5402, bir mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar düzleştirilmiş agonist ile desteklenmiş KSR ortamının% 75'i ve N2 ortamının% 25'i karışımıyla değiştirin. Altıncı ve yedinci günlerde, süpernatantları% 50 KSR ortamı ve% 50 N2 ortamının bir karışımı ile değiştirin beş mikromolar DAPT, beş mikromolar SU5402, bir mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar pürüzsüzleştirilmiş agonist ile desteklenmiş. Sekizinci ve dokuzuncu günlerde, süpernatantları KSR ortamının% 25'i ve N2 ortamının% 75'i ile tamamlayın, beş mikromolar DAPT, beş mikromolar SU5402, bir mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar pürüzsüzleştirilmiş agonist takviyesi yapın.

10. ve 11. günlerde, süpernatanları beş mikromolar DAPT, beş mikromolar SU5402, bir mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar düzleştirilmiş agonist ile desteklenmiş N2 ortamı ile değiştirin. 12. günde, her bir oyuktaki süpernatantları, kuyu başına mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ile desteklenmiş 100 mikrolitre olgunlaşma ortamı ile değiştirin. Motor sinir organoid oluşumunu indüklemek için, PDMS çipindeki kaplama solüsyonunu, mililitre başına 20 nanogram beyin kaynaklı nörotrofik faktör ile takviye edilmiş 150 mikrolitre olgunlaşma ortamı ile değiştirin ve geniş delikli bir mikropipet ucu kullanarak motor nöron sferoidlerini 96 oyuklu plakanın bir oyuğundan çipin mikro kanalının girişine nazikçe ekleyin.

Orta buharlaşmayı önlemek için tabağın içindeki doku kültürü çipinin yanına küçük bir steril su rezervuarı yerleştirin ve tabağı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Her iki ila üç günde bir, tükenmiş kültür ortamının yarısını, orta rezervuarın merkezinden, mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ile desteklenmiş taze olgunlaşma ortamı ile değiştirin. Aksonlar, motor nöron sferoidinden kanala doğru büyüyecek ve bir motor sinir organoidi oluşturmak için iki ila üç haftalık bir süre boyunca kendiliğinden tek bir demet halinde toplanacaktır.

Motor nöronlar, 3D farklılaşma prosedürlerinde 12 ila 14 gün içinde farklılaşır. Daha da önemlisi, hücrelerin %60'ından fazlası farklılaşma sırasında motor nöron belirteci HB9'u eksprese eder ve motor nöron sferoidindeki hücrelerin yaklaşık %80'i SMI32 pozitiftir. Mikrokanalın fiziksel kılavuzlar olarak hizmet etmesiyle, aksonlar, sferoide girişten sonraki 24 saat içinde akso-aksonal etkileşim ile bir demet oluşturmak üzere motor nöron küresinden uzar.

Aksonlar, önümüzdeki üç ila dört gün içinde mikrokanalın merkezine ulaştı ve 10 gün daha sonra mikrokanalın diğer ucuna uzandı. Motor sinir organoidleri, PDMS'yi mikroskop camından ayırarak biyolojik analiz için çipten toplanabilir. Akson demetleri ve hücre gövdeleri daha sonra cerrahi bir bıçak veya cımbız kullanılarak mikroskop altında diseke edilebilir ve izole edilebilir.

Motor sinir organoidlerinin akson demetlerinde, dendritik işaretleyici proteinler Western blotlama ile tespit edilmez. Sferoidlerin kültür çipi içinde tamamen dibe düştüğünden emin olmak önemlidir. Sitelerin incelenmesini gösterdik ve alt kısım çip içindeki sferoidin yerini belirlemeye yardımcı olabilir.

İzole edilmiş akson demetleri çeşitli ek yöntemler için incelenebilir. Büyük miktarda akson elde edilebilir ve önemli miktarda malzeme gerektiren biyokimyasal tahliller için kullanılabilir.