Name: Üç Boyutlu Motor Sinir Organoid Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Keşfedin, insan iPS hücrelerinden motor sinir organoidleri üretmek için PDMS mikroakışkan çip kullanımını. Bu yöntem, motor nöron hastalıkları için ilaç taraması ve aks gelişimi araştırmaları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Japonya Bilimi Teşvik Derneği (JSPS) Bilimsel Araştırmalar için Yardım Hibeleri 17H05661 ve 18K19903, Core-2-core programı ve Beyond AI enstitüsü tarafından desteklendi.

<ol><li>Raper, J., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+strategies+of+axonal+pathfinding%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular strategies of axonal pathfinding.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (9), 001933(2010).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+mediates+axonal+degeneration+by+promoting+inflammation+and+necroptosis+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIPK1 mediates axonal degeneration by promoting inflammation and necroptosis in ALS.</a> Science. 353 (6299), 603-608 (2016).</li>
<li>Fujimori, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+sporadic+ALS+in+iPSC-derived+motor+neurons+identifies+a+potential+therapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling sporadic ALS in iPSC-derived motor neurons identifies a potential therapeutic agent.</a> Nature Medicine. 24 (10), 1579-1589 (2018).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+iPSCs+Reveals+that+Mutant+SOD1+Misregulates+Neurofilament+Balance+in+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with iPSCs Reveals that Mutant SOD1 Misregulates Neurofilament Balance in Motor Neurons.</a> Cell Stem Cell. 14 (6), 796-809 (2014).</li>
<li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+%28ALS%29+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), (2018).</li>
<li>Imamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Src%2Fc-Abl+pathway+is+a+potential+therapeutic+target+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Src/c-Abl pathway is a potential therapeutic target in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Science Translational Medicine. 9 (391), (2017).</li>
<li>Wang, L., Marquardt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+axons+tell+each+other%3A+axon-axon+signaling+in+nerve+and+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">What axons tell each other: axon-axon signaling in nerve and circuit assembly.</a> Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 974-982 (2013).</li>
<li>Kawada, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+Motor+Nerve+Organoid+with+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of a Motor Nerve Organoid with Human Stem Cell-Derived Neurons.</a> Stem Cell Reports. 9 (5), 1441-1449 (2017).</li>
<li>Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips+for+Compartmentalizing+Primary+Murine+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons.</a> JoVE. (141), e58421(2018).</li>
<li>Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+Human+Stem+Cell-Derived+Neurons+within+Pre-Assembled+Plastic+Microfluidic+Chips%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips.</a> JoVE. (147), e59250(2019).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+small-molecule+inhibition+accelerates+developmental+timing+and+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+nociceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors.</a> Nature Biotechnology. 30 (7), 715-720 (2012).</li>
<li>Rimington, R. P., Fleming, J. W., Capel, A. J., Wheeler, P. C., Lewis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+model+of+the+human+motor+unit+with+physiologically+functional+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Bioengineered model of the human motor unit with physiologically functional neuromuscular junctions.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Cullen, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bundled+Three-Dimensional+Human+Axon+Tracts+Derived+from+Brain+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Bundled Three-Dimensional Human Axon Tracts Derived from Brain Organoids.</a> iScience. 21, 57-67 (2019).</li>
<li>Giandomenico, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+at+the+air-liquid+interface+generate+diverse+nerve+tracts+with+functional+output%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output.</a> Nature Neurosciences. 22 (4), 669-679 (2019).</li>
<li>Egawa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+for+ALS+using+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Drug screening for ALS using patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Science Translational Medicine. 4 (145), (2012).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neurosciences. 19 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Qu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+motor+neuron+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+and+the+function+of+Islet-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-efficiency motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells and the function of Islet-1.</a> Nature Communications. 5 (1), 3449(2014).</li>
<li>Kirihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Tissue+Model+of+a+Cerebral+Tract+Connecting+Two+Cortical+Regions%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">A Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Tissue Model of a Cerebral Tract Connecting Two Cortical Regions.</a> iScience. 14, 301-311 (2019).</li>
<li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li>
<li>Yan, Y., Song, L., Madinya, J., Ma, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+Cortical+Spheroids+from+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Suspension+Bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Derivation of Cortical Spheroids from Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Suspension Bioreactor.</a> Tissue Engineering Part A. 24 (5-6), 418-431 (2017).</li>
</ol>

Bu protokolün bir parçası olarak, Jiro Kawada tarafından kurulan Jiksak Bioengineering, Inc.'e bir patent lisanslanmıştır.

Bu protokol, insan iPS hücrelerinden üretilen bir motor nöron küreselden uzatılmış bir akson demetine sahip bir motor sinir organoidinin (MNO) oluşumunu açıklar. Oluşan akson demeti kalın, esnek ve tek yönlü yapılarda iyi organize edilmiş. Akson demetinin diseksiyonu ile biyokimyasal analizler için yüksek saflıkta aksonal protein ve RNA elde edilebilir. Nöronal aktivite kalsiyum görüntüleme ile akson demetleri ve sferoidlerde ölçülebilir. Aksonal lisattaki nükleer ve dendritik proteinlerin kirlenmesi batı şişkinliği ile tespit edilmedi ve yöntemimizin aksonları hücre gövdelerinden ve dendritlerden verimli bir şekilde ayırdığını gösterdi.
Bu protokolün avantajlarından biri, tüm işlemlerin 3D protokol ile 4 haftada ve 2D protokol kullanılarak 5-6 haftada yapılabileceği bir akson demeti ile donatılmış MNO'nun hızlı farklılaşması ve üretilmesidir. Bu, embriyonik kök hücrelerden ve iPS hücrelerinden 17'ye MN'ye ayırt edilmesi tipik olarak3-4 hafta süren diğer protokollere kıyasla kısadır ve aksonal uzama elde etmek 2-4 hafta daha sürer. 3D protokolü, 2D protokolüne kıyasla ayrışma adımı olmadan daha kısa farklılaşma süresi, daha az adım ve azaltılmış teknik riskler nedeniyle genellikle 2D protokole göre tercih edilir. Mikroakışkan tabanlı doku kültürü çipi, MNS'nin aksonlarının mikrokanal aracılığıyla diğer bölmeye doğru uzaması için tasarlanmıştır, bu da aksonlar arasında akson etkileşimleri ve benzeşimi teşvik ederek bir akson demetinin oluşumunu kolaylaştırır. Basit deneysel kurulum nedeniyle, burada açıklanan tüm protokoller sadece bir doku kültürü çipinin manipülasyonuna aşina olan biyomühendisler tarafından değil, aynı zamanda mikroakışkanlara ve mikrofabrikasyon tekniklerine aşina olmayan biyologlar ve sinirbilimciler tarafından da gerçekleştirilebilir. Adım 1 ve 2'nin harici bir imalat hizmeti kullanılarak da gerçekleştirilebileceği unutulmamalıdır.
Protokolü gerçekleştirmek için kritik adımlardan biri, kültür ortamının sıralı bir değişimidir. Harcanan ortamdaki faktörlerin MN farklılaşmasını bozmaması için farklılaşma sırasında her adımda kültür ortamının tamamen değiştirilmesi önerilir. Bu protokolün bir diğer kritik noktası, farklılaşmamış iPS hücrelerini iyi kalitede tutmaktır. İlk iPS hücre kültürünün kalitesi, motor nöronlar ve MNO elde etme verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Başka bir nokta, MNS çapının talaşın deliğinin boyutundan (1,5 mm) daha küçük olması gerektiğidir. Daha büyük küreseller odaya giremez ve potansiyel olarak orta kısımda şiddetli hipoksik nekroz yaşarlar. MNS'lerin boyutu, iPS hücrelerinin (3D protokolde) veya motor nöronların (2D protokolde) ilk tohumlama sayısı değiştirilerek kontrol edilebilir. Hücrelerin tohumlama yoğunluğu her iPS hücre hattı için optimize edilmelidir.
Mikrogroovlar ve küçük gözenek filtreleri ile bölmeli mikroakışkan cihazlar, aksonları hücre gövdelerinden ve dendritlerden ayırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bu teknik ayrıca aksonları hücre gövdelerinden ve dendritten ayırabilir, demetlenmiş dokularda üstün akson bolluğu ile. Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yöntemin önemli bir sınırlaması, doku kültürü çipinin mevcut tasarımında iki farklı kültür medyasını ayıramamasıdır, bu da iki farklı ortam gerektiren iki farklı hücrenin ortak kültür yeteneğini engeller. Diğer bir sınırlama, PDMS çipinin dokunun boyutuna önceden belirlenmiş bir kısıtlama koymasıdır. Delikten daha büyük bir küresel odaya giremez ve akson demeti mikroakışkan kanalın genişliğinden daha kalın büyüyemez.
Bu yöntem diğer nöron türlerine de uygulanabilir. Grubumuz serebral organoid teknikleri ile birlikte modifiye bir yöntem kullanarak serebral sistemi modelleme yeteneği göstermiştir18. Kortikal sferoidler her iki bölmeye de sokuldu ve aksonlar her bir küreseloide doğru karşılıklı olarak kendiliğinden uzadı ve daha sonra kendiliğinden bir akson demeti oluştu. Sonuç olarak, iki kortikal sferoid bir akson demeti ile bağlanabilir ve doku tek parça olarak elde edilebilir. Bu, nöronal hücre türlerinden bağımsız olarak akson demet dokuları oluşturmak için yaklaşımın çok yönlü olduğunu göstermektedir. Bu protokolde insan iPS hücreleri kullanılmıştır, ancak sunulan protokolde yapılan değişikliklerle insan ES hücreleri ve insan sinir kök hücreleri de dahil olmak üzere diğer kök hücreler kullanılabilir. Nöronların 3D sferoidleri çeşitli protokoller19,20ile üretilebilir. Bir akson demeti ile doku yapma bu yöntem potansiyel olarak gelecekte 3D MN sferoid yapmak için diğer farklılaşma protokolleri ile kombine edilebilir. Ek olarak, akson demetinin kalınlığı ve uzunluğu, gelecekteki gelişmeler için doku kültürü çipinin mikrokanellerinin genişliği ve yüksekliği değiştirilerek kontrol edilebilir.
Bu protokolün ilaç testi ve taraması için kullanılabileceğine ve akson fasiküllerinin gelişiminin ve hastalıklarının altında kalan mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunabileceğine inanıyoruz.

Spinal motor nöronlar (MN), vücut hareketini kontrol etmek için aksonları iskelet kaslarına uzatır. Aksonal yörüngeleri gelişim sürecinde son derece organize ve düzenlenmiştir. Axon uzatma ve rehberlik1ile ilgili birçok çalışmaya rağmen, organize akson demeti oluşumu için mekanizmalar hala incelenmektedir. Motor nöronların aksonları genellikle amyotrofik lateral skleroz (ALS)2gibi nörodejeneratif hastalıklardan zarar görür, ancak akson fasiküllerindeki hasarın patofizyolojik mekanizmaları iyi anlaşılmaz. Bu nedenle, alanda akson demeti oluşumunu ve gerilemesini rekapitüle etmek için fizyolojik ve patolojik bir model gereklidir.
İnsan kök hücre türevi motor nöron, ALS3gibi gelişimi ve hastalıkları anlamak için umut verici bir platformdur. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPS hücreleri) hasta kaynaklı hücreler kullanılarak hastalıkları modellemek için kullanılabilir. Bugüne kadar pluripotent kök hücrelerden MN'ye çeşitli farklılaşma yöntemleribildirilmiştir 4,5,6. Bununla birlikte, iki boyutlu kültürdeki nöronların aksonları rastgele yönlendirilir ve aksonların yoğun axo-aksonal etkileşimler yoluyla tek yönlü olarak bir araya getirildiği gelişen sinirler içinde in vivo mikroçevriciliği rekapitüle etmez7. Bu sorunun üstesinden gelmek için, insan iPS hücrelerinden motor sinire benzeyen üç boyutlu bir doku oluşturmak için bir teknik geliştirdik8ve dokuyu motor sinir organoidi (MNO) olarak adlandırdık. MNO, bir motor nöron sferoidinde (MNS) bulunan hücre gövdelerinden ve sferoidden uzatılmış bir aksonal fasikülden oluşur. Fasiküldeki aksonlar, motor sinirlerin gelişimindeki aksonlara benzeyen tek yönlüdür. Bu nedenle, MNO'lar benzersiz olarak, daha önce geliştirilen diğer nöronal kültür yöntemleri tarafından yapılmayan fizyolojik bir aksonal mikroçevronment sağlar.
Bu protokolde, geliştirilen çiplerde doku kültürü yongaları imalatı, hızlı motor nöron farklılaşması ve motor sinir organoid oluşumu için yöntemler açıklanmaktadır. Doku kültürü çipimiz çok basittir ve sadece bir küresel kabul etmek için bir bölme, bir akson demeti oluşturmak için bir mikro kanal ve axon terminallerini muhafaza etmek için bir bölme içerir. Cihaz, genellikle aksonları ve hücre gövdelerini9,10boyutuna göre ayırmak için kullanılan mikrogroovlar veya mikropor filtreleri de dahil olmak üzere karmaşık yapılar içermez. Bu nedenle, bir fotolithografi kurulumu mevcutsa, cihazlarımız bu protokolde açıklanan adımları izleyerek kolayca üretilebilir.
İnsan iPS hücrelerinin hızlı farklılaşması, indükleme ve desenleme faktörlerinin (SB431542, LDN-193189, retinoik asit (RA) ve yumuşatılmış agonist (SAG)) ve ivme faktörlerinin (SU5402 ve DAPT) optimize edilmiş bir kombinasyonu ile elde edilir. SU5402 ve DAPT kombinasyonunun periferik nöronların ve nöral kret hücrelerinin farklılaşmasını hızlandırdığı bildirilmiştir11. Bu protokolde, okuyucuların ihtiyaçlarına en uygun bir yönteme karar verebilmeleri için MNO'lar oluşturmak için üç farklı yöntem sunuyoruz. Farklılaştırılmış MNS doğrudan bir doku kültürü çipine aktarılabildiğinden, bir küresel (3D yöntem) oluşturduktan sonra insan iPS hücrelerinin farklılaştırılmasını öneririz. Alternatif olarak, insan iPS hücreleri monolayer (2D) kültüründe motor nöronlara ayırt edilebilir ve daha önce bildirdiğimiz gibi üç boyutlu motor nöron küresellere oluşturulabilir8. Protokolü güncelledik ve bu protokolde açıklanan üç boyutlu farklılaşma yöntemi ile 2D'den 3D'ye geçiş önlenebilir ve MNO'lar ayrışma adımı olmadan daha kısa farklılaşma süresi, daha az adım ve azaltılmış teknik risklerle elde edilebilir. Piyasada bulunan nöronlar, farklılaşma süresini azaltmak için MNS üretmek için de kullanılabilir.
Bir MNO oluşturmak için, doku kültürü çipinde bir MNS kültürü yaptık. Aksonlar küreselden uzaklaşır ve aksonların tek yönlü olarak toplandığı ve hizalandığı mikro kanala uzanır. Bu, mikrokanalde sıkıca monte edilmiş tek yönlü akson demet dokusunun axo-aksonal etkileşimini ve kendiliğinden oluşumunu kolaylaştırır, bu protokolle benzersiz bir şekilde elde edilirken, spontan demet oluşumu veya kılavuzlu aksonal yönelim tek başına diğer protokoller12 , 13,14ile elde edilebilir. Tipik bir deneyde, çok az hücre küresellerden mikro kanallara göç eder ve çoğu hücre sferoidlerin yakınında kalır. Bu yöntem, aksonları hücre gövdelerinden ayırmak için boyuta bağımlı fiziksel bariyerler (örneğin, mikrogroovlar veya mikropore filtreleri) kullanmadan aksonların sferoidlerden kendiliğinden ayrılmasını sağlar.
Ortaya çıkan MNO morfolojik, biyokimyasal ve fiziksel analizler de dahil olmak üzere çeşitli incelemelere tabi tutulabilir. Hücre gövdesi ve genişletilmiş akson demeti kesilerek fiziksel olarak izole edilebilir ve biyokimyasal tahliller gibi aşağı akış deneyleri için ayrı ayrı analiz edilebilir. RNA ve protein gibi biyolojik malzemeler, RT-PCR ve batı şişkinliği de dahil olmak üzere düzenli biyokimyasal tahliller için sadece birkaç akson demetinden izole edilebilir. Burada, akson fasiküllerinin gelişiminin ve hastalığının altında kalan mekanizmayı incelemek için çekici bir fizyolojik ve patolojik model sunan iPS hücrelerinden motor sinir organoidi üretmek için bir protokol açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>(Tridekafloro-1,1,2,2-tetrahidrooktil)-1-triklorosilan</td><td>Sigma</td><td>440302</td><td></td></tr><tr><td>%16 Paraformaldehit (formaldehit) sulu çözelti</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>200 & l Geniş Delikli Pipet Uçları</td><td>BMBio</td><td>BMT-200WRS</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar</td><td>Violamo</td><td>2-8588-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50X)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>Beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF)</td><td>Wako</td><td>020-12913</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS10</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>07959</td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4</td><td>Dojindo Laboratuvarları</td><td>CS22</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme faktörü azaltılmış Matrigel (bazal membran matrisi)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>HB9 Antikoru</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-22542</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wako</td><td>085-09355</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>iCell motor nöron (ticari olarak temin edilebilen insan iPS hücresinden türetilmiş motor nöronlar)</td><td>Hücresel Dinamikler</td><td>R1051</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil alkol (IPA)</td><td>Wako</td><td>166-04836</td><td></td></tr><tr><td>Knock Out Serum Değiştirme</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sigma</td><td>SML0559</td><td></td></tr><tr><td>MEA probu</td><td>Alpha MED Scientific inc</td><td>MED-P5004A</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x) (NEAA)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Cam</td><td>Matsunami</td><td>S9111</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>05825</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi</td><td>Wako</td><td>141-08941</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal ortam</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fotorezist SU-8 2100</td><td>Microchem</td><td>#SU-8 2100</td><td></td></tr><tr><td>Prime yüzey 96U</td><td>Sumitomo Bakalit</td><td>MS-9096U</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR (pasaj reaktifi)</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>05872</td><td></td></tr><tr><td>Retinoik asit</td><td>Wako</td><td>186-01114</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Sigma</td><td>SML1314</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Wako</td><td>192-16541</td><td></td></tr><tr><td>Silikon gofret</td><td>SUMCO</td><td>PW-100-100</td><td></td></tr><tr><td>Silpot 184 w/c kit</td><td>Dow Toray</td><td>Silpot 184 w/c kit</td><td></td></tr><tr><td>Smi32 Antikor</td><td>Biolegend</td><td>801701</td><td></td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma</td><td>SML0443</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Geliştirici</td><td>Microchem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Synapsin I Antikoru</td><td>Millipore</td><td>Ab1543</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Fenol kırmızısı içermeyen ekspres sıvı (ayrışma çözeltisi)</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1 Antikor</td><td>Biyoefsanesi</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>030-24021</td><td></td></tr></tbody></table>

Üç boyutlu motor sinir organoid Üretimi

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

Akson fasikülleri sinir sisteminde gözlenen başlıca yapısal motiflerden biridir. Akson fasiküllerinin bozulması gelişimsel ve nörodejeneratif hastalıklara neden olabilir. Her ne kadar çok sayıda akson çalışması yapılmış olsa da, sağlam üç boyutlu in vitro modellerin eksikliği nedeniyle akson fasiküllerinin oluşumu ve işlev bozukluğu anlayışımız hala sınırlıdır. Burada, mikroakışkan tabanlı bir doku kültürü çipinde insan kaynaklı pluripotent sap (iPS) hücrelerinden bir motor sinir organoidinin (MNO) hızlı üretimi için adım adım bir protokol açıklıyoruz. İlk olarak, yöntem için kullanılan çiplerin imalatı açıklanmaktadır. İnsan iPS hücrelerinden motor nöron sferoid (MNS) oluşur. Daha sonra, farklılaştırılmış MNS çipe aktarılır. Bundan sonra, aksonlar kendiliğinden küreselden büyür ve çipte bulunan bir mikrokanal içinde bir fasikül haline gelir ve bu da küreselden uzatılmış bir akson demeti taşıyan bir MNO dokusu oluşturur. Aşağı akış analizi için, MNO'lar morfolojik analizler için sabitlenecek çipten çıkarılabilir veya biyokimyasal analizlerin yanı sıra kalsiyum görüntüleme ve çoklu elektrot dizi kayıtları için incelenebilir. Bu protokol ile oluşturulan MNO'lar ilaç testini ve taramasını kolaylaştırabilir ve aksion fasiküllerinin gelişiminin ve hastalıklarının altında kalan mekanizmaların anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Motor nöronlar 3D farklılaşma işlemlerinde 12-14 gün içinde farklılaştırılmıştır (Şekil 4 ve Şekil 5). Daha da önemlisi, hücrelerin% 60'ından fazlası farklılaşma sırasında motor nöron belirteci HB9'ı ifade etti. İmmünohistokimya, MNS'deki hücrelerin yaklaşık% 80'inin SMI32 pozitif motor nöronlar olduğunu ortaya koydu. HB9 ve SMI32, kurulan erken aşama motor nöron belirteçleridir15,16. HB9 ve SMI32 ifadesi, motor nöronların hücresel kimliğini sağlamak için onaylanması gereken temel parametrelerdir. Kültür yongasına bir MNS girdikten sonra, aksonlar kanala uzanır ve bir akson demeti oluşur. Fiziksel kılavuz olarak hizmet veren mikrokanaller nedeniyle, aksonlar MNS'den uzaktır ve axo-axonal etkileşim ile bir demet oluşturur (Şekil 6A). Bir MNO'nun oluşumunu doğrulamak için mikroskobik gözlemle akson demetinin oluşumunu onaylamak önemlidir. Başarılı bir MNO, kanaldaki demetin dışında 50 μm'den daha geniş bir akson demeti ve birkaç izole akson taşır. Aksonların ilk uzaması, sferoidin girişinden 24 saat sonra gözlemlenebilir. Sonraki 3-4 gün içinde, aksonlar mikrokananın merkezine ulaştı ve daha sonra ek 10 gün içinde diğer uca ulaşır (Şekil 6A). Sonuç olarak, aksonlar bir çipte 2-3 hafta içinde düz ve tek yönlü bir demet oluşturdular ve bundan sonra nöronal aktiviteler gözlendi.
Motor sinir organoidleri biyolojik analiz için PDMS'yi mikroskop camından ayırarak çipten toplanabilir (Şekil 6B). Akson demetleri ve hücre gövdeleri mikroskop altında cerrahi bıçak veya cımbız kullanılarak kesilerek izole edilebilir (Şekil 6B). RNA ve protein de dahil olmak üzere bu biyolojik malzemeler RT-PCR ve batı şişkinliği gibi düzenli biyokimyasal tahliller için kullanılabilir. MNO'ların akson demetlerinde, batı şişkinliğinde nükleer veya dendritik yapıcı proteinler tespit edilmemiştir (Şekil 6C).
Bir kalsiyum göstergesi (Fluo-4 AM) ile birlikte, doku kültürü çipinde nöronal aktivite yakalanabilir. MNO içinde sferoid ve akson demetinde motor nöronların spontan aktivitesi gözlendi. Ayrıca, sinirsel aktiviteler çok elektrotlu bir dizi sistemi kullanılarak gözlendi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig01.jpg"> Şekil 1: PDMS doku kültürü çipinin boyutu. (A) Doku kültürü çipinin fotomask. (B) Doku kültürü çipinde mikrokanel boyutları. Motor nöron sferoidini tutmak için taban odasının çapı 2 mm ve odanın üzerindeki PDMS deliği 1,5 mm'dir. İki odacık arasında köprü kuran bir mikrokananın genişliği ve yüksekliği 150 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig02.jpg"> Şekil 2: Motor nöron farklılaşması şematik illüstrasyonu. (A) Farklılaşma adımları nöral indüksiyon, motor nöron soyuna desenleme ve motor nöronların olgunlaşmasını içeriyordu. (B) iPS hücrelerinden motor nöron küresel (MNS) oluşturmak için iki seçenek: 3D protokol ve motor nöronların ayrışma adımına sahip bir 2D protokol. Motor sinir organoidi (MNO) her iki protokolle de elde edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig03.jpg"> Şekil 3: Bodrum membran matrisi kaplaması ve motor nöron küresel tanıtımı için adım adım protokol. (A) Doku kültürü çipinin kanalında bodrum membran matrisi kaplaması. (B) Çipin deliğine MNS girişi. (C) Tükenmiş ortamın aspirasyonu ile kültür orta değişimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig04.jpg"> Şekil 4: 2D ve 3D motor nöron farklılaşması. (A) Temsili 3D MNS farklılaşma süresi (3D protokolü). MNS'nin boyutu zamanla kademeli olarak arttı. Ölçek çubuğu: 500 μm. (B) -D2, D0, D1, D6, D12 (2D protokolü) üzerinde 2D farklılaşma süresi. Ölçek çubuğu: 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig05.jpg"> Şekil 5: Motor nöronların karakterizasyonu. (A) (Sol) SMI-32 antikor ve DAPI ile boyanmış bir MNS kriyoseksiyon. (Orta) Bodrum membran matrisi kaplı bir yüzeyde replated MNS faz kontrast görüntüsü. Aksonal uzama gözlendi. (Sağ) Sinapsin I ve Tuj1 antikorları ile boyanmış replated MNS aksonları. Ölçek çubuğu: 500 μm (Sol ve Orta) ve 50μm (Sağ). (B) Tuj ve HB9 antikorları ile bağışıklık sistemi baskılanmış 2D motor nöronların temsili bir görüntüsü. Ölçek çubuğu: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61544/61544fig06.jpg"> Şekil 6: Bir kültür çipinde üretilen bir motor sinir organoidinin (MNO) karakterizasyonu. (A) D32'de akson uzama ve kalın akson demeti oluşumunun temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu: 500 μm. (B) Motor sinir organoidinin (MNO) SMI-32 ve DAPI tarafından immünostainingi. Aksonlar ve hücre gövdeleri fiziksel olarak kesilerek izole edilebilir. Ölçek çubuğu: 1 mm. (C) Batı şişkinliği ile ölçülen aksonlardan ve hücre gövdelerinden proteinin saflığı. Bir dendritik belirteç olan MAP2, aksonal proteinde tespit edilmedi, aksional işaretleyici Tau1 ise aksonal proteinde zenginleştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61544/61544fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu protokol, bir doku kültürü çipinde bir sferoidden uzatılan sağlam bir akson demetinin kendiliğinden montajı yoluyla insan iPS hücre türevi motor sinir organoidini imal etmek için kapsamlı bir prosedür sağlar.

Üç Boyutlu Motor Sinir Organoid Üretimi

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...

Bu protokol, vücut dışındaki insan iPS hücrelerinden türetilen motor sinir organoidi kullanılarak akson demetlerinin gelişiminin ve hastalığının altında yatan mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştırır. Nöronal sferoid ve ısmarlama mikrokültür çiplerini basitçe kültürleyerek, tek yönlü akson demetleri kendiliğinden üretilebilir ve çeşitli aşağı akış deneyleri için kullanılabilir. Motor sinir organoidi, daha önceki in vitro sistemlerden daha fizyolojik bir model sağlayarak, LS de dahil olmak üzere motor nöron hastalıkları için ilaçların taranmasını ve test edilmesini kolaylaştırabilir.Bir çeker ocakta ve uygun KKD'yi giyerek, asetonla temizlenmiş bir silikon gofret üzerine üç mililitre SU-8 2100 dağıtın ve gofretleri bir sıkma kaplayıcının ortasına yerleştirin. Gofret'i vakumla sabitleyin ve SU-8'i gofret yüzeyi boyunca düzgün bir şekilde kaplamak için gofreti dakikada 500 devirde 10 saniye boyunca döndürün, ardından gofret üzerinde 150 mikron kalınlığında bir fotorezist tabakası elde etmek için saniyede 300 devirlik bir ivme ile 30 saniye boyunca dakikada 1.500 devirde döndürün. Yumuşak pişirmeden sonra, fotoğraf maskesini maske hizalayıcıya ayarlayın ve gofreti 60 saniye boyunca ultraviyole ışığa maruz bırakın.Sıcak bir plaka üzerinde pişirdikten sonra, gofretleri bir orbital çalkalayıcı üzerinde çalkalama ile fotorezist geliştiricide 10 ila 20 dakika geliştirin ve işlem sırasında gelişen çözeltiyi bir kez değiştirin. Çipin alt tabakasını doku kültürüne hazırlamak için, taze hazırlanmış PDMS'yi gofret üzerine istenen kalınlığa kadar dökün ve karışımı bir vakum odasında gazdan arındırın. PDMS'yi 60 santigrat derecede en az üç saat fırında kürleyin.Soğuduktan sonra, kürlenmiş PDMS'yi gofretten kesmek için bir bıçak kullanın, ardından monte edilmiş PDMS doku kültürü çipini elde etmek için orta bir rezervuarı PDMS alt katmanına bağlamak için pişirme ile kürlenmemiş PDMS kullanın. PDMS çipini motor sinir organoid oluşumuna hazırlamak için, çipi ve 76 x 52 milimetrelik bir mikroskop camını en az bir saat boyunca %70 etanol içeren bir Petri kabında sterilize edin. İnkübasyonun sonunda, çipi ıslak mikroskop camına yerleştirin.Gece boyunca kuruduktan sonra, çip cama yapışmalıdır. Kanalın girişinin bir tarafına DMEM / F30'ye 12 mikrolitrelik bir seyreltilmiş bazal membran matrisi damlası yerleştirin ve mikrokanalın yüzeyini matrisle kaplamak için çözeltiyi girişin diğer tarafından aspire edin. Daha sonra PDMS çipini kaplama solüsyonu ile bir Petri kabında oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.Motor nöronlara 3D iPS hücre farklılaşmasını indüklemek için, 10 mikrolitre besleyici ve 10 mikromolar Y-27632 ile desteklenmiş serumsuz hücre kültürü ortamında 96 oyuklu bir U-alt plakanın uygun sayıda oyuğuna kuyu başına dört kez 10 ila dördüncü iPS hücresi tohumlayın. Ertesi gün, her bir oyuktaki süpernatanı, 10 mikromolar SB431542 ve 100 nanomolar LDN-193189 ile desteklenmiş 100 mikrolitre KSR ortamı ile değiştirin. İkinci ve üçüncü günlerde, süpernatanları 10 mikromolar SB431542, 100 nanomolar LDN-193189, beş mikromolar DAPT, beş mikromolar SU5402, bir mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar yumuşatılmış agonist ile takviye edilmiş 100 mikrolitre KSR ortamı ile değiştirin.Dördüncü ve beşinci günlerde, süpernatantları 10 mikromolar SB431542, 100 nanomolar LDN193189, beş mikromolar DAPT, beş mikromolar SU5402, bir mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar düzleştirilmiş agonist ile desteklenmiş KSR ortamının% 75'i ve N2 ortamının% 25'i karışımıyla değiştirin. Altıncı ve yedinci günlerde, süpernatantları% 50 KSR ortamı ve% 50 N2 ortamının bir karışımı ile değiştirin beş mikromolar DAPT, beş mikromolar SU5402, bir mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar pürüzsüzleştirilmiş agonist ile desteklenmiş. Sekizinci ve dokuzuncu günlerde, süpernatantları KSR ortamının% 25'i ve N2 ortamının% 75'i ile tamamlayın, beş mikromolar DAPT, beş mikromolar SU5402, bir mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar pürüzsüzleştirilmiş agonist takviyesi yapın.10. ve 11. günlerde, süpernatanları beş mikromolar DAPT, beş mikromolar SU5402, bir mikromolar retinoik asit ve bir mikromolar düzleştirilmiş agonist ile desteklenmiş N2 ortamı ile değiştirin. 12. günde, her bir oyuktaki süpernatantları, kuyu başına mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ile desteklenmiş 100 mikrolitre olgunlaşma ortamı ile değiştirin. Motor sinir organoid oluşumunu indüklemek için, PDMS çipindeki kaplama solüsyonunu, mililitre başına 20 nanogram beyin kaynaklı nörotrofik faktör ile takviye edilmiş 150 mikrolitre olgunlaşma ortamı ile değiştirin ve geniş delikli bir mikropipet ucu kullanarak motor nöron sferoidlerini 96 oyuklu plakanın bir oyuğundan çipin mikro kanalının girişine nazikçe ekleyin.Orta buharlaşmayı önlemek için tabağın içindeki doku kültürü çipinin yanına küçük bir steril su rezervuarı yerleştirin ve tabağı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin. Her iki ila üç günde bir, tükenmiş kültür ortamının yarısını, orta rezervuarın merkezinden, mililitre beyin kaynaklı nörotrofik faktör başına 20 nanogram ile desteklenmiş taze olgunlaşma ortamı ile değiştirin. Aksonlar, motor nöron sferoidinden kanala doğru büyüyecek ve bir motor sinir organoidi oluşturmak için iki ila üç haftalık bir süre boyunca kendiliğinden tek bir demet halinde toplanacaktır.Motor nöronlar, 3D farklılaşma prosedürlerinde 12 ila 14 gün içinde farklılaşır. Daha da önemlisi, hücrelerin %60'ından fazlası farklılaşma sırasında motor nöron belirteci HB9'u eksprese eder ve motor nöron sferoidindeki hücrelerin yaklaşık %80'i SMI32 pozitiftir. Mikrokanalın fiziksel kılavuzlar olarak hizmet etmesiyle, aksonlar, sferoide girişten sonraki 24 saat içinde akso-aksonal etkileşim ile bir demet oluşturmak üzere motor nöron küresinden uzar.Aksonlar, önümüzdeki üç ila dört gün içinde mikrokanalın merkezine ulaştı ve 10 gün daha sonra mikrokanalın diğer ucuna uzandı. Motor sinir organoidleri, PDMS'yi mikroskop camından ayırarak biyolojik analiz için çipten toplanabilir. Akson demetleri ve hücre gövdeleri daha sonra cerrahi bir bıçak veya cımbız kullanılarak mikroskop altında diseke edilebilir ve izole edilebilir.Motor sinir organoidlerinin akson demetlerinde, dendritik işaretleyici proteinler Western blotlama ile tespit edilmez. Sferoidlerin kültür çipi içinde tamamen dibe düştüğünden emin olmak önemlidir. Sitelerin incelenmesini gösterdik ve alt kısım çip içindeki sferoidin yerini belirlemeye yardımcı olabilir.İzole edilmiş akson demetleri çeşitli ek yöntemler için incelenebilir. Büyük miktarda akson elde edilebilir ve önemli miktarda malzeme gerektiren biyokimyasal tahliller için kullanılabilir.

three-dimensional-motor-nerve-organoid-generation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Video, mikroakışkan bir cihaz kullanılarak nöromüsküler kavşakların oluşumunu göstermektedir. Nöral öncü hücreler ve kas progenitör hücreleri, cihaz içindeki farklı kuyucuklara ekilir ve sırasıyla motor nöronlara ve miyotüplere olgunlaşmaya bırakılır. Bir hacim ve kimyasal gradyanın oluşturulması, aktif nöromüsküler kavşakların gelişmesine yol açar.

Mikroakışkan bir cihaz kullanarak nöromüsküler kavşakların oluşturulması

Bu video, önce insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri sferoidler oluşturmak için özel bir ortamda kültürleyerek, daha sonra bunları spesifik inhibitörler kullanarak motor nöronlara farklılaştırarak ve son olarak aksonları uzatmak ve motor sinir organoidleri oluşturmak için mikroakışkan bir çipte yetiştirerek motor sinir organoidleri oluşturma yöntemini göstermektedir.

Mikroakışkan Çip Kullanarak İnsan iPSC'den Türetilmiş Motor Sinir Organoidlerinin Geliştirilmesi

Bu video, Parkinson hastalığını incelemek için bir model sağlamak üzere insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) dopaminerjik nöronlara farklılaşmasını göstermektedir. hESC'ler, 3D nöroküreler oluşturmak için bir mikro kuyu plakasında bir nöral indüksiyon ortamında kültürlenir. Bunlar daha sonra dopaminerjik progenitör nöronlara farklılaşmayı teşvik etmek için bir nöral indüksiyon ortamında kültürlenir. Nöronların son olgunlaşması, hava-sıvı arayüz koşulları altında bir kültür ekinde...

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Dopaminerjik Nöronal Organoidlerin Üretilmesi

Bu çalışmada, iki spesifik insan nöral organoidleri, insan sinirsel organoidlerin içinde sadece insanlarda ve 2) nöron dopaminerjik olarak eğitim için ilgili ve doğru bir model olarak 1) insan glioblastoma gelişimi türetmek için protokoller tanıtır ve açıklanmaktadır üç boyutlu bir organoid üreten farklılaşma.

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

fonksiyonel olarak aktif nöromüsküler kavşakların oluşumuyla sonuçlanan insan primer mezoangioblast türevli miyotüplerle birlikte insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi motor nöronları birlikte kült haline getirmekle ticari olarak mevcut mikroakışkan cihazlarda insan motor üniteleri üretmek için bir yöntem açıklıyoruz.

Mikroakışkan Cihazlarda Fonksiyonel Nöromüsküler Kavşaklara Sahip İnsan Motor Ünitelerinin Üretimi

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (iPSC' ler) beyin organoidleri üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Beyin organoidlerini büyük miktarlarda ve yüksek kalitede elde etmek için ev yapımı mini biyoreaktörler kullanıyoruz.

Ev Yapımı Mini Biyoreaktörlerde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Beyin Organoidi Üretimi

Bu çalışmada, standart besleyicisiz hPSC kültürlerini kullanarak basit ama sağlam bir kortikal organoid kültür sistemi için ayrıntılı bir teknik sunuyoruz. Bu, in vitro beyin yaşlanmasının yönlerini modelleyen organoidler üretmek için hızlı, verimli ve tekrarlanabilir bir protokoldür.

Beyin Nöronal Yaşlanmasını Modellemek için Kortikal Beyin Organoidlerinin Sağlam ve Yüksek Oranda Yeniden Üretilebilir Üretimi In Vitro

Periferal sinir sisteminin (PNS) yaralanmadan sonra önemli tamir yeteneğine sahip olmasına rağmen, küçük bu olgu yöneten hücresel ve moleküler mekanizmaları bilinmektedir. Canlı, transgenik zebrafish ve tekrarlanabilir bir sinir kesisi testi kullanarak, sinir dejenerasyonu ve rejenerasyonu sırasında dinamik glial hücre davranışlarını eğitim görebilirsiniz.

Motor Sinir transeksiyonu ve Canlı Zebra balığı Glial Hücre Davranışlarının Time-lapse Görüntüleme

CNS'deki astrositler, zararlı uyaranlara yanıt olarak fonksiyonel ve yapısal özelliklerini değiştirir. Bu rapor, hastalıklı durumlarda veya terapötik müdahaleler sonrasında üç boyutlu astrosit morfolojisinin değerlendirilmesi için bir protokol sunmaktadır.

Astrositler Üç boyutlu Konfokal Morfometrik Analizi Protokolü

Bu iletişim kuralı görselleştirmek ve sinir özgü mitokondri ölçmek için üç boyutlu (3D) görüntüleme ve çözümleme teknikleri kullanır. Teknikleri bir floresan sinyal başka bir floresan sinyalinden gelen verilerin bir alt kümesini yalıtmak için kullanıldığı diğer durumlar için geçerlidir.

Üç boyutlu görüntüleme ve mitokondri içinde insan Intraepidermal sinir lifleri analizi

Keşfedin, insan iPS hücrelerinden motor sinir organoidleri üretmek için PDMS mikroakışkan çip kullanımını. Bu yöntem, motor nöron hastalıkları için ilaç taraması ve aks gelişimi araştırmaları sağlar.

Üç Boyutlu Motor Sinir Organoid Üretimi

Daha fazla video keşfet