Immuno RNA-Floresan In Situ Hibridizasyonu Kullanılarak SARS-CoV-2'nin Görselleştirilmesi

Bu protokol, SARS-CoV-2 RNA'nın hücre hatlarında ve tamamen farklılaşmış, üç boyutlu insan hava yolu epitel kültürlerinde görselleştirilmesini mümkün kılarak tek hücre düzeyinde viral patogenezi ve replikasyonu daha iyi anlamak için bir araç sağladı. Yüksek özgüllüğü, duyarlılığı ve çözünürlüğü nedeniyle, bu yöntem sadece SARS-koronavirüs-2'nin temel bilim çalışmaları için değil, aynı zamanda teşhis gibi uygulamalı projeler için de yararlıdır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi olan Agnieszka Suder olacak.

Hücreleri metin el yazmasında açıklandığı gibi sabitledikten ve geçirgen hale getirdikten sonra, 1X PBS çözeltisini kuyulardan çıkarın ve her oyuğa en az 300 mikrolitre amplifikasyon tamponu ekleyin. Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İstenilen hacmi ayrı tüplerde hızlı bir şekilde soğutarak her bir HCR saç tokasını hazırlayın.

300 mikrolitre amplifikasyon çözeltisi hazırlamak için, her bir saç tokasından 18 pikool kullanın. Saç tokası solüsyonunu tüplere aktarın ve 95 santigrat derecede 90 saniye inkübe edin. Daha sonra karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığına soğutun.

Çıtçıtla soğutulmuş H1 ve H2 saç tokalarını amplifikasyon tamponuna ekleyerek bir saç tokası karışımı hazırlayın. Parafilm üzerine 30 ila 50 mikrolitre saç tokası karışımı damlatın. Hücreli lamelleri saç tokası karışımının damlalarının üzerine yerleştirin ve numuneleri gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin.

Slaytları monte etmek için, iki adet 10 mikrolitrelik montaj ortamı damlasını bir slayt üzerine yerleştirin ve damlaların iki lamel üzerine tek bir lamel yerleştirilmesine izin verecek kadar ayrıldığından emin olun. Lamelleri temiz bir havluya vurarak fazla sıvıyı çıkarın. Daha sonra bunları, hücreler aşağı bakacak şekilde antifade montaj ortamına yerleştirin.

Monte edilen numuneleri karanlıkta kuru, düz bir yüzeye yerleştirin ve kürlenmelerine izin verin. HAE hücrelerini metin el yazmasında anlatıldığı gibi sabitleyip geçirgen hale getirdikten sonra, numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika amplifikasyon tamponu ile inkübe ederek önceden amplifiye edin. 500 mikrolitre amplifikasyon çözeltisi hazırlamak için her saç tokasından 30 pikool kullanın.

Saç tokası çözeltisini tüplere aktarın ve 95 santigrat derecede 90 saniye inkübe edin. Daha sonra karanlıkta 30 dakika oda sıcaklığına soğutun. Tüm çıtçıtlı soğutmalı saç tokalarını oda sıcaklığında 500 mikrolitre amplifikasyon tamponuna ekleyerek saç tokası çözeltisini hazırlayın.

Preamplifikasyon solüsyonunu çıkarın ve tam saç tokası solüsyonunu ekleyin. Daha sonra numuneleri gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin. Transwell eklerinden kesilen membranı, hücreler yukarı bakacak şekilde 10 mikrolitre antifade montaj ortamına yerleştirin ve membrana ekstra montaj ortamı ekleyin.

Daha sonra zarları lamellerle örtün. Bu immüno-RNA-FISH protokolü, bir Vero hücre hattı ve bir 3D insan hava yolu epitel kültürü olmak üzere iki hücresel sistemde gerçekleştirildi. Enfekte ve sahte aşılanmış Vero hücrelerinde SARS-coronavirus-2 subgenomik RNA'nın lokalizasyonu burada gösterilmektedir.

Viral RNA kırmızı renkte görülebilir. Enfekte ve sahte aşılanmış insan hava yolu epitel hücrelerinde SARS-coronavirus-2 subgenomik RNA lokalizasyonu burada gösterilmektedir. Vero hücrelerinde geçirgenlik protokolü optimize edildi.

Deterjanla geçirgenleştirme, SARS-koronavirüs-2 subgenomik RNA için net, spesifik bir sinyalle sonuçlanırken, etanol kullanmak bulanık ve odaklanmamış bir görüntüye neden olur. Slaytları Vero hücreleri ile monte ederken, hücreler aşağı bakacak şekilde bir lamel yerleştirmek önemlidir. HAÖ kızaklarını monte ederken, zarın hücreler yukarı bakacak şekilde yerleştirilmesi gerekir.

Bu teknik, gelecekte ortaya çıkabilecek kodlamayan RNA'lar ve RNA virüsleri de dahil olmak üzere herhangi bir RNA'nın tespit edilmesini sağlamak için kolayca değiştirilebilir. İmmünofloresan ile birleştiğinde, tek hücre düzeyinde protein-RNA etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.