Yeni Nesil Sıralama için Manyetik Boncuk Bazlı Sivrisinek DNA Ekstraksiyon Protokolü

Bu bütçe dostu manyetik boncuk bazlı DNA ekstraksiyon protokolü, yüksek verim sıralamasını kaynak sınırlı laboratuvarları ve çalışmaları için erişilebilir hale getirir. Bu protokol, yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonu için pahalı ekipman gerektirmez ve yüksek verim sıralaması için kaliteli yeterli miktarda DNA elde etmenin zor olduğu belirli tanı veya araştırma durumlarında yardımcı olabilir. Bu protokolün tek seferlik bir gösterimle çoğaltılması kolaydır.

İş akışını tanımak için önce az sayıda örnekle denenmelidir. Başlamak için, 100 mikrolitre PCR sınıfı su ekleyerek ve dokuyu yumuşatmak için dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırarak% 70’ten fazla alkolde depolanan sivrisinek dokusu örneklerini nemlendirin. Kuluçkadan sonra, suyu atın ve 100 mikrolitre Proteinaz K tampon enzim karışımı ekleyin.

Daha sonra dokuyu homojenize etmek için bir mikrosantrifüj tüp pestle kullanın. Homojenizasyondan sonra, doku lisatını santrifüj edin ve 56 santigrat derecede iki ila üç saat kuluçkaya yatırın. DNA’yı çıkarmak için, pipet 100 mikrolitre doku yeni bir temiz mikrosantrifüj tüpüne dökülür.

Ardından manyetik boncuk ana karışımının 215 mikrolitresini ekleyin. Bir pipet kullanarak, lisat ve manyetik boncuk karışımını 10 ila 20 saniye karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Kuluçka sırasında, DNA’nın manyetik boncuklara bağlanmasını en üst düzeye çıkarmak için tüpü ara sıra hafifçe sallayın.

Daha sonra, çözelti netleşene kadar tüpü manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin. Daha sonra bir pipet kullanarak, DNA’yı tutan manyetik boncukları bozmadan sıvıyı tüpten hafifçe emiş edin. Tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve 325 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek boncukları yıkayın.

Pipetleme ile iyice karıştırın ve oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırarak karıştırın. Kuluçkadan sonra, tüpü manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı çıkarın, ardından tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve boncukları bir kez yıkama tamponu ile yıkayın. Tampon bir ile ikinci yıkamadan sonra, boncukları aynı şekilde 250 mikrolitre yıkama tamponu iki ile iki kez yıkayın.

Son yıkamadan sonra, tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve 100 mikrolitre elüasyon tamponu ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın ve ardından tüpü manyetik ayırıcıya geri yerleştirmeden önce oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın. Çözelti netleştiğinde, süpernatantı yeni, temiz 0,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve uygun şekilde saklayın.

Burada, 0,5 milimolar EDTA içeren bir elüasyon tamponunda sivrisinek DNA’sının tipik bir mikrovolum florometre okuması olarak gösterilmiştir. Ortalama 260 ila 280 nanometre absorbans oranı 2,3’dür. Bu tabloda, farklı ayıklama yöntemleri için bir iş gününde işlenen maliyetler ve numune sayısı gösterilmiştir.

Bu protokolle bir ekstraksiyon için tipik reaktif ve sarf malzemesi maliyeti örnek başına yaklaşık 9,50’dir. Bu maliyet, tipik manyetik boncuk bazlı ekstraksiyon yöntemine eşdeğerdir. Bu protokolün en büyük maliyet avantajı, otomatik DNA çıkarma cihazı gerektirmemekten kaynaklanır.

Birden fazla örnekle çalışırken DNA’nın çapraz kirlenmesini önlemek için numuneler arasındaki pipet uçlarını değiştirdiğinizi unutmayın. Bu yöntem kullanılarak çıkarılan yüksek kaliteli DNA’yı tüm genom dizilimleri için kullanıyoruz. Şu anda insektisit direncindeki yeni mutasyonları veya halk sağlığı ve hastalık kontrolünde endişe verici bağışıklık genlerini tanımlamak için sıralama verilerini kullanıyoruz.

Yüksek verimli dizileme için uygun fiyatlı çözümlere sahip olmak, birçok yeni genetik kontrol stratejisinin başarısını etkileyen sivrisinek dağılımını ve gen akışını anlamayı amaçlayan popülasyon genomikleri ve peyzaj genomikleri için heyecan verici kapılar açar.