Yeni Nesil Sıralama için Manyetik Boncuk Bazlı Sivrisinek DNA Ekstraksiyon Protokolü
April 15th, 2021
Burada, sivrisineklerden yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonları üretmek için manyetik boncuklar kullanan bir DNA ekstraksiyon protokolü açıklanmıştır. Bu ekstraksiyonlar, aşağı akış yeni nesil sıralama yaklaşımı için uygundur.
Bu bütçe dostu manyetik boncuk bazlı DNA ekstraksiyon protokolü, yüksek verim sıralamasını kaynak sınırlı laboratuvarları ve çalışmaları için erişilebilir hale getirir. Bu protokol, yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonu için pahalı ekipman gerektirmez ve yüksek verim sıralaması için kaliteli yeterli miktarda DNA elde etmenin zor olduğu belirli tanı veya araştırma durumlarında yardımcı olabilir. Bu protokolün tek seferlik bir gösterimle çoğaltılması kolaydır.
İş akışını tanımak için önce az sayıda örnekle denenmelidir. Başlamak için, 100 mikrolitre PCR sınıfı su ekleyerek ve dokuyu yumuşatmak için dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırarak% 70'ten fazla alkolde depolanan sivrisinek dokusu örneklerini nemlendirin. Kuluçkadan sonra, suyu atın ve 100 mikrolitre Proteinaz K tampon enzim karışımı ekleyin.
Daha sonra dokuyu homojenize etmek için bir mikrosantrifüj tüp pestle kullanın. Homojenizasyondan sonra, doku lisatını santrifüj edin ve 56 santigrat derecede iki ila üç saat kuluçkaya yatırın. DNA'yı çıkarmak için, pipet 100 mikrolitre doku yeni bir temiz mikrosantrifüj tüpüne dökülür.
Ardından manyetik boncuk ana karışımının 215 mikrolitresini ekleyin. Bir pipet kullanarak, lisat ve manyetik boncuk karışımını 10 ila 20 saniye karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Kuluçka sırasında, DNA'nın manyetik boncuklara bağlanmasını en üst düzeye çıkarmak için tüpü ara sıra hafifçe sallayın.
Daha sonra, çözelti netleşene kadar tüpü manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin. Daha sonra bir pipet kullanarak, DNA'yı tutan manyetik boncukları bozmadan sıvıyı tüpten hafifçe emiş edin. Tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve 325 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek boncukları yıkayın.
Pipetleme ile iyice karıştırın ve oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırarak karıştırın. Kuluçkadan sonra, tüpü manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı çıkarın, ardından tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve boncukları bir kez yıkama tamponu ile yıkayın. Tampon bir ile ikinci yıkamadan sonra, boncukları aynı şekilde 250 mikrolitre yıkama tamponu iki ile iki kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve 100 mikrolitre elüasyon tamponu ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın ve ardından tüpü manyetik ayırıcıya geri yerleştirmeden önce oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın. Çözelti netleştiğinde, süpernatantı yeni, temiz 0,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve uygun şekilde saklayın.
Burada, 0,5 milimolar EDTA içeren bir elüasyon tamponunda sivrisinek DNA'sının tipik bir mikrovolum florometre okuması olarak gösterilmiştir. Ortalama 260 ila 280 nanometre absorbans oranı 2,3'dür. Bu tabloda, farklı ayıklama yöntemleri için bir iş gününde işlenen maliyetler ve numune sayısı gösterilmiştir.
Bu protokolle bir ekstraksiyon için tipik reaktif ve sarf malzemesi maliyeti örnek başına yaklaşık 9,50'dir. Bu maliyet, tipik manyetik boncuk bazlı ekstraksiyon yöntemine eşdeğerdir. Bu protokolün en büyük maliyet avantajı, otomatik DNA çıkarma cihazı gerektirmemekten kaynaklanır.
Birden fazla örnekle çalışırken DNA'nın çapraz kirlenmesini önlemek için numuneler arasındaki pipet uçlarını değiştirdiğinizi unutmayın. Bu yöntem kullanılarak çıkarılan yüksek kaliteli DNA'yı tüm genom dizilimleri için kullanıyoruz. Şu anda insektisit direncindeki yeni mutasyonları veya halk sağlığı ve hastalık kontrolünde endişe verici bağışıklık genlerini tanımlamak için sıralama verilerini kullanıyoruz.
Yüksek verimli dizileme için uygun fiyatlı çözümlere sahip olmak, birçok yeni genetik kontrol stratejisinin başarısını etkileyen sivrisinek dağılımını ve gen akışını anlamayı amaçlayan popülasyon genomikleri ve peyzaj genomikleri için heyecan verici kapılar açar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, sivrisineklerden yüksek kaliteli DNA elde etmek için manyetik boncuklar kullanan uygun maliyetli bir DNA ekstraksiyon protokolünü açıklamaktadır. Yöntem, yüksek verimli dizileme için tasarlanmış olup, kaynak kısıtlı laboratuvarlar için erişilebilir hale getirilmiştir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genetik
- Moleküler Biyoloji
- Dizileme Teknolojisi
Arka Plan
- Yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonu, yeni nesil dizileme için kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel yöntemler pahalı ekipman gerektirebilir.
- Kaynak kısıtlı laboratuvarlar genellikle yeterli DNA kalitesi elde etmede zorluklarla karşılaşır.
- Bu protokol, ekstraksiyon sürecini basitleştirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Sivrisinekler için erişilebilir bir DNA ekstraksiyon yöntemi sağlamak.
- Kaynak kısıtlı ortamlarda yüksek verimli dizilemeyi kolaylaştırmak.
- Araştırmacılar için tekrarlanabilir bir protokol göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Sivrisinek doku örneklerinin PCR sınıfı su ile hidrasyonu.
- Dokunun yumuşaması için 4 derece Celsius'ta inkübasyon.
- Hindistirim için Proteinaz K tampon enzim karışımının eklenmesi.
- Küçük numune boyutu ile kolay tekrarlanabilirlik için tasarlanmış protokol.
Ana Sonuçlar
- Sıralama için uygun yüksek kaliteli DNA'nın başarılı bir şekilde ekstraksiyonu.
- Protokolün kaynak kısıtlı ortamlarda etkili olduğu gösterildi.
- Yüksek verimli dizileme daha erişilebilir hale getirildi.
- Kolay kullanım, ilk gösterimlerle doğrulandı.
Sonuçlar
- Manyetik boncuk tabanlı protokol, DNA ekstraksiyonu için uygun bir alternatiftir.
- Kaynak kısıtlı ortamlarda araştırmalara önemli ölçüde yardımcı olabilir.
- İş akışını optimize etmek için daha fazla test yapılması önerilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Cost-effective, scalable DNA extraction is critical for enabling high-throughput sequencing in vector biology and genomics, especially in resource-limited settings. This magnetic-bead-based protocol eliminates the need for expensive automation, supporting broader access to genomic data for population and landscape genomics. By lowering barriers to high-quality DNA extraction, the protocol enhances portfolio-wide discovery and surveillance capabilities in biopharma and public health R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust genomic interrogation of vector populations for target validation in disease control research.
- Supports identification of genetic mutations relevant to resistance and immune pathways.
- Facilitates biological de-risking by providing high-quality DNA for downstream analyses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated DNA samples for sequencing-based screening workflows.
- Ensures reproducible, quantitative DNA yields suitable for assay standardization.
- Supports scalable sample processing for population-level studies.
Translational & Preclinical Research
- Enables translational genomics by supporting studies on gene flow and dispersal relevant to vector control strategies.
- Provides continuity from field sample collection to preclinical genetic analysis.
- Reduces operational barriers for implementing genomics in translational research pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol fits from early discovery through preclinical research, supporting workflows from field sample collection to sequencing-based analysis.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway analysis by enabling access to high-quality DNA from individual vectors.
- Screening: Delivers reproducible DNA extraction for sequencing readiness and assay development.
- Analytics: Provides quantitative DNA quality metrics (e.g., 260/280 ratio) for reliable downstream comparison.
- Translational Research: Aligns with biomarker and gene flow studies in vector-borne disease research.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, cost-effective extraction workflow adaptable across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genomic analyses and target validation.
- Operational Value: Reduces equipment costs and enables reproducible, scalable DNA extraction.
- Strategic Value: Expands access to high-throughput sequencing for diverse research portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of vector control and genomics initiatives.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology expertise and standard laboratory equipment.
- Needs access to magnetic bead separators and microvolume fluorometers for DNA quantification.
- Demands strict pipetting technique to prevent cross-contamination between samples.
- Adaptable to low- and medium-throughput workflows without automation.
- Initial familiarization with a small sample set is recommended for workflow optimization.
