Yeni Nesil Sıralama için Manyetik Boncuk Bazlı Sivrisinek DNA Ekstraksiyon Protokolü
15 Nisan 2021
Burada, sivrisineklerden yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonları üretmek için manyetik boncuklar kullanan bir DNA ekstraksiyon protokolü açıklanmıştır. Bu ekstraksiyonlar, aşağı akış yeni nesil sıralama yaklaşımı için uygundur.
Bu bütçe dostu manyetik boncuk bazlı DNA ekstraksiyon protokolü, yüksek verim sıralamasını kaynak sınırlı laboratuvarları ve çalışmaları için erişilebilir hale getirir. Bu protokol, yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonu için pahalı ekipman gerektirmez ve yüksek verim sıralaması için kaliteli yeterli miktarda DNA elde etmenin zor olduğu belirli tanı veya araştırma durumlarında yardımcı olabilir. Bu protokolün tek seferlik bir gösterimle çoğaltılması kolaydır.
İş akışını tanımak için önce az sayıda örnekle denenmelidir. Başlamak için, 100 mikrolitre PCR sınıfı su ekleyerek ve dokuyu yumuşatmak için dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırarak% 70'ten fazla alkolde depolanan sivrisinek dokusu örneklerini nemlendirin. Kuluçkadan sonra, suyu atın ve 100 mikrolitre Proteinaz K tampon enzim karışımı ekleyin.
Daha sonra dokuyu homojenize etmek için bir mikrosantrifüj tüp pestle kullanın. Homojenizasyondan sonra, doku lisatını santrifüj edin ve 56 santigrat derecede iki ila üç saat kuluçkaya yatırın. DNA'yı çıkarmak için, pipet 100 mikrolitre doku yeni bir temiz mikrosantrifüj tüpüne dökülür.
Ardından manyetik boncuk ana karışımının 215 mikrolitresini ekleyin. Bir pipet kullanarak, lisat ve manyetik boncuk karışımını 10 ila 20 saniye karıştırın, ardından oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Kuluçka sırasında, DNA'nın manyetik boncuklara bağlanmasını en üst düzeye çıkarmak için tüpü ara sıra hafifçe sallayın.
Daha sonra, çözelti netleşene kadar tüpü manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin. Daha sonra bir pipet kullanarak, DNA'yı tutan manyetik boncukları bozmadan sıvıyı tüpten hafifçe emiş edin. Tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve 325 mikrolitre yıkama tamponu ekleyerek boncukları yıkayın.
Pipetleme ile iyice karıştırın ve oda sıcaklığında bir dakika kuluçkaya yatırarak karıştırın. Kuluçkadan sonra, tüpü manyetik boncuk ayırıcıya yerleştirin ve daha önce gösterildiği gibi süpernatantı çıkarın, ardından tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve boncukları bir kez yıkama tamponu ile yıkayın. Tampon bir ile ikinci yıkamadan sonra, boncukları aynı şekilde 250 mikrolitre yıkama tamponu iki ile iki kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, tüpü manyetik boncuk ayırıcıdan uzaklaştırın ve 100 mikrolitre elüasyon tamponu ekleyin. Pipetleme ile iyice karıştırın ve ardından tüpü manyetik ayırıcıya geri yerleştirmeden önce oda sıcaklığında iki dakika kuluçkaya yatırın. Çözelti netleştiğinde, süpernatantı yeni, temiz 0,5 mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve uygun şekilde saklayın.
Burada, 0,5 milimolar EDTA içeren bir elüasyon tamponunda sivrisinek DNA'sının tipik bir mikrovolum florometre okuması olarak gösterilmiştir. Ortalama 260 ila 280 nanometre absorbans oranı 2,3'dür. Bu tabloda, farklı ayıklama yöntemleri için bir iş gününde işlenen maliyetler ve numune sayısı gösterilmiştir.
Bu protokolle bir ekstraksiyon için tipik reaktif ve sarf malzemesi maliyeti örnek başına yaklaşık 9,50'dir. Bu maliyet, tipik manyetik boncuk bazlı ekstraksiyon yöntemine eşdeğerdir. Bu protokolün en büyük maliyet avantajı, otomatik DNA çıkarma cihazı gerektirmemekten kaynaklanır.
Birden fazla örnekle çalışırken DNA'nın çapraz kirlenmesini önlemek için numuneler arasındaki pipet uçlarını değiştirdiğinizi unutmayın. Bu yöntem kullanılarak çıkarılan yüksek kaliteli DNA'yı tüm genom dizilimleri için kullanıyoruz. Şu anda insektisit direncindeki yeni mutasyonları veya halk sağlığı ve hastalık kontrolünde endişe verici bağışıklık genlerini tanımlamak için sıralama verilerini kullanıyoruz.
Yüksek verimli dizileme için uygun fiyatlı çözümlere sahip olmak, birçok yeni genetik kontrol stratejisinin başarısını etkileyen sivrisinek dağılımını ve gen akışını anlamayı amaçlayan popülasyon genomikleri ve peyzaj genomikleri için heyecan verici kapılar açar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, tekil Aedes aegypti sivrisinekleri için maliyet etkin, manyetik boncuk tabanlı bir DNA ekstraksiyon protokolü sunmaktadır. Bu yöntem, pahalı otomatik cihazlara olan ihtiyacı ortadan kaldırarak yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonunu kaynakları sınırlı laboratuvarlar için erişilebilir hale getirmekte ve tüm genom dizileme gibi alt uygulamalara olanak sağlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Moleküler biyoloji
- Genomik
- Vektör biyolojisi
Arka Plan
- Yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonu, genomik çalışmalar ve tanı yöntemleri için esastır.
- Otomatik DNA ekstraksiyon cihazları maliyetlidir ve tüm laboratuvarlar için erişilebilir olmayabilir.
- Manyetik boncuk tabanlı protokoller, geleneksel ekstraksiyon yöntemlerine alternatif sunar.
- Ekonomik protokoller, sivrisinek araştırmalarında yüksek verimli sekanslama kullanımını artırabilir.
Çalışmanın Amacı
- Manyetik boncuklar kullanarak bütçe dostu bir DNA ekstraksiyon protokolü geliştirmek.
- Pahalı ekipmanlar gerektirmeyen, düşük ila orta ölçekli işleme kapasitesine uygun bir yöntem sunmak.
- Protokolü, bireysel Aedes aegypti sivrisinek örnekleri kullanarak doğrulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Sivrisinek dokusunun PCR kalitesinde su ile hidratasyonu.
- Proteinaz K tamponu ve enzim karışımı ile homojenizasyon.
- Dokunun 56°C'de inkübasyonu ve lizis işlemi.
- DNA'nın manyetik boncuklara bağlanması, ardından ardışık yıkama ve elüsyon.
- Mikrohacim florometrisi ve absorbans oranları kullanılarak DNA kantifikasyonu.
Ana Sonuçlar
- Protokol, tüm genom dizileme için uygun yüksek kaliteli DNA sağlar.
- Ortalama 260/280 nm absorbans oranı 2,3'tür ve bu durum iyi bir saflığa işaret eder.
- Reaktif ve sarf malzemesi maliyeti örnek başına yaklaşık 9,50 $'dır.
- Yöntem, maliyet açısından diğer manyetik boncuk tabanlı protokollerle kıyaslanabilir niteliktedir ancak otomatik cihaz ihtiyacını ortadan kaldırır.
Sonuçlar
- Bu protokol, tekil sivrisineklerden uygun maliyetli ve yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonuna olanak tanır.
- Kısıtlı kaynaklara sahip ortamlarda yüksek verimli sekanslamayı destekler.
- Bu yaklaşım, vektör kontrolü ve halk sağlığı ile ilgili popülasyon ve peyzaj genomiği çalışmalarını kolaylaştırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Maliyet etkin ve ölçeklenebilir DNA ekstraksiyonu, özellikle kaynakların kısıtlı olduğu ortamlarda, vektör biyolojisi ve genomikte yüksek çıktıya sahip sekanslamayı mümkün kılmak için kritik öneme sahiptir. Manyetik boncuk tabanlı bu protokol, pahalı otomasyon sistemlerine olan ihtiyacı ortadan kaldırarak popülasyon ve peyzaj genomiği için genomik verilere daha geniş erişimi destekler. Yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonunun önündeki engelleri azaltan bu protokol, biyofarma ve halk sağlığı Ar-Ge çalışmalarında portföy genelindeki keşif ve sürveyans kapasitelerini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Hastalık kontrolü araştırmalarında hedef doğrulaması için vektör popülasyonlarının kapsamlı genomik incelemesine olanak tanır.
- Direnç ve bağışıklık yollarıyla ilgili genetik mutasyonların tanımlanmasını destekler.
- Alt analizler için yüksek kaliteli DNA sağlayarak biyolojik risklerin azaltılmasını kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Dizileme tabanlı tarama iş akışları için valide edilmiş DNA örnekleri hazırlar.
- Analiz standardizasyonuna uygun, tekrarlanabilir ve kantitatif DNA verimleri sağlar.
- Popülasyon düzeyindeki çalışmalar için ölçeklenebilir örnek işlemeyi destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Vektör kontrol stratejileriyle ilgili gen akışı ve yayılım çalışmalarını destekleyerek translasyonel genomiğe olanak tanır.
- Saha örneklemesi ile preklinik genetik analiz arasında süreklilik sağlar.
- Translasyonel araştırma süreçlerinde genomik uygulamaların önündeki operasyonel engelleri azaltır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu protokol, saha örneği toplama aşamasından sekanslama tabanlı analize kadar olan iş akışlarını destekleyerek, erken keşiften preklinik araştırmalara kadar olan sürece uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Bireysel vektörlerden yüksek kaliteli DNA'ya erişim sağlayarak hipotez testlerini ve yolak analizlerini kolaylaştırır.
- Tarama: Sekanslama hazırlığı ve assay geliştirme için tekrarlanabilir DNA ekstraksiyonu sunar.
- Analitikler: Güvenilir downstream karşılaştırmaları için kantitatif DNA kalite metrikleri (örneğin, 260/280 oranı) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Vektör kaynaklı hastalık araştırmalarındaki biyobelirteç ve gen akış çalışmalarıyla uyumludur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler ve ekipler arasında uyarlanabilir, standartlaştırılmış ve maliyet etkin bir ekstraksiyon iş akışı sunar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Genomik analizlerde ve hedef doğrulamada öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Ekipman maliyetlerini düşürür; tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir DNA ekstraksiyonuna olanak tanır.
- Stratejik Değer: Çeşitli araştırma portföyleri için yüksek kapasiteli sekanslamaya erişimi genişletir.
- Portföy Etkisi: Vektör kontrolü ve genomik girişimlerin risk ayarlı önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Temel moleküler biyoloji uzmanlığı ve standart laboratuvar ekipmanı gereklidir.
- DNA kantifikasyonu için manyetik boncuk ayırıcılarına ve mikrohacim florometrelere erişim gereklidir.
- Örnekler arası çapraz kontaminasyonu önlemek için titiz pipetleme tekniği gereklidir.
- Otomasyon olmaksızın düşük ve orta hacimli iş akışlarına uyarlanabilir.
- İş akışı optimizasyonu için küçük bir örnek seti ile başlangıç aşamasında aşinalık kazanılması önerilir.
