Name: DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü Anofel Spp. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Öğrenin, Anopheles sivrisineklerinden ve sıtma parazitlerinden hızlı DNA ekstraksiyonu için basit Chelex protokolünü. Bu yöntem, moleküler tanımlama ve genotipleme için yüksek kaliteli DNA sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar şefleri, muhtarları ve sivrisinek alanında örnek koleksiyonları sırasında işbirliği onların unwaveing ​​için Macha toplulukları borçluyuz. Dr Doug Norris ve Rebekah Kent üzerinden tuzlama protokol biçilmez bir uzmanlık sundu. Bu çalışma, Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü pilotu hibe sistemi tarafından finanse edildi. Sivrisinek ve parazit DNA laboratuvarında standartlara nazik MR4, Amerikan Tip Kültür &amp; Koleksiyon tarafından bağışlandı.

1. Sivrisinek Örneklerinin Hazırlık Diseksiyon <ol><li> Mikroskop diseksiyon üzerine parafilm ve montaj küçük bir kesim üzerinde yer sivrisinek. </li><li> Doku yumuşatmak için deiyonize su damla kaplayın. </li><li> Böylece karın kısmından baş ve toraks kapalı nicking, toraks ve abdomen arasındaki eklem tam sivrisinek karkas kesilirken. </li><li> Sivrisinek kimlik numarası bilgilerini ve uygun gövde bölümünde (; kafa ve göğüs bölümü için &quot;ht&quot; mid-gut bölüm için örnek: &quot;m&quot;) belirtmek için işaretlenmiş olan prelabeled temiz otoklava 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içine her disseke sivrisinek bölüm aktarın. </li><li> Parafilm atın ve dikkatlice sonraki sivrisinek işlemeden önce% 70 alkol nemlendirilmiş Kimwipe ile mikroskop sahne silin. </li></ol> 2. Sivrisinek örneklerden DNA Ekstraksiyonu <ol><li> Örnek tüpü ve bir un içine daldırılmış sivrisinek bölümüne öğütmek için kullanıma pipet içine deiyonize su Pipet 20 uliform süspansiyon. </li><li> Otoklavlanmış 1X PBS / nazik anlık vorteks tarafından numune Homojenat ve karıştırmak için 1% saponin çözeltisinden 100 ul ekleyin. </li><li> 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> 2 dakika boyunca 20.000 xg&#39;de santrifüjleyin ve supernatant atın. </li><li> 100 ul 1X PBS içinde yeniden süspanse pelet. </li><li> 2 dakika boyunca 20.000 xg&#39;de tekrar santrifüj ve supernatant atın. </li><li> Yumuşak vorteks (5 sn), 75 ul steril deiyonize su içinde tekrar süspansiyon pelet ve deiyonize su içinde% 20 w / v Chelex-100 reçine süspansiyon 25 ul ile. </li><li> Bunsen beki de Alevli steril 23G derialtı iğne kullanılarak örnek tüpünün kapağını Pierce delik. </li><li> 10 dakika boyunca kayan raf üzerindeki su banyosu içinde kaynatılır örnek süspansiyon (veya ısıtma bloğu). </li><li> PCR uygulamalarında şablon olarak kullanmak için prelabeled saklama kabı içine 1 dk ve transfer eden DNA çözümü için, 20,000 x g&#39;de santrifüjleyin. </li></ol> 3. Plasmodium falciparum genotipleme ve Anofelspp. Moleküler Tanımlanması <ol><li> Anofel türleri 10 belirlemek ve genotip P., DNA kalitesi 11 kontrol etmek için 25 ul PCR reaksiyonlarında Chelex DNA ekstraktı 2.5 ul ekleyin falciparum 12 orta bağırsak ve tükürük bezi enfeksiyonları. </li><li> Özellikle P. için Amplikon verimi maksimize etmek için falciparum algılama, PCR in (BSA), 1.5x bovin serum albümin yer alır. Aşağıdaki reaksiyon bileşim tavsiye edilmektedir: (2.5 ul şablon, 0.25 uM primerler, 1.5 mM magnezyum klorid, 200 uM dNTP, 1X PCR Tamponu, 1.5x BSA ve 1.0U Taq DNA polimeraz, 25 ul hacim içinde). </li><li> Özü DNA kalite kontrol etmek için, eklembacaklı mitokondriyal nikotinamid adenin dinükleotid dehidrogenaz (NADH) altbirim 4 (ND4) gen (primerleri ND4FW [5&#39;-GTD YAT TTA TGA TTR SKK AA-3 &#39;] ve ND4RV [5&#39; bölgesi amplifiye -CTT ÇGD CTT CCW ADW CGT TC-3 &#39;]; ürünün 400bp) 11,13 bekliyoruz. </li><li> Anofel gambia ayırt etmeke sl. türler (An. gambiae ss ve An. arabiensis sadece), intergenik boşluk (IGS) bölgesinde, (SNP sınırdaş bölgede yükseltmek primerler BM [5&#39;-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 &#39;], GA [5&#39;-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 &#39;], AR [5&#39;-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3&#39;]; ürün 390bp bir gambiae ss, 315bp bir arabiensis) 10,11 beklenmektedir. </li><li> Yazarak P. için falciparum antifolate ilaç direnci polimorfizmleri, amino asit, kodonlar 108, 51, 59, parazit dihidrofolat redüktaz (DHFR) geni içinde 16 ve 164 komşu bölgeyi büyütmek için iç içe PCR işlemi gerçekleştirmek: Birincil yuvarlak primerler: M1 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 &#39;] ve M5 [5&#39;-AGTATATACATCGCTAACAGA-3&#39;] İkincil yuvarlak primerler: M3 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 &#39;] F / ile [5&#39;-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3&#39;] Veya F [5&#39;-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] M4 [5&#39;-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 &#39;]). Ayrıca amino asit kodon 436, 437, 540, 581 bir içeren bölge amplifiyeP. nd 613 falciparum Dihidropteroat sentaz (DHPS) geni: Birincil yuvarlak primerler R2 [5&#39;-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 &#39;] R / [5&#39;-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3&#39;]; İkincil yuvarlak primerler J: [5&#39;-&#39;TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3&#39;] K / [5&#39;-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 &#39;] ile Veya K: K / [5&#39;-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 &#39;], Veya L [5&#39;-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 &#39;] L / [5&#39;-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3&#39;] 12. </li><li> Üreticinin talimatları izleyerek 30 ul reaksiyon allel-spesifik restriksiyon enzim sindirim, Konu 4 ul Amplikon antifolate ilaç direnci ile ilişkili polimorfizmleri 12 algılamak için. </li><li> Konu 5 elektroforez etidyum bromür ile boyalı% 2&#39;lik agaroz jel (100 - 120V) ve her kulvar için PCR amplikon (veya kısıtlama sindirmek 15 ul) ul ve UV transillüminasyon altında bantları görselleştirmek. </li></ol>

<ol><li>Bonnet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+antimalarial+treatment+in+Guinea%3A+in+vivo+study+of+two+artemisinin+combination+therapies+in+Dabola+and+molecular+markers+of+resistance+to+sulphadoxine-pyrimethamine+in+N%27Zerekore%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore.</a> Malar. J. 6, 54(2007).</li>
<li>Nsimba, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sulphadoxine%2Fpyrimethamine+versus+amodiaquine+for+treating+uncomplicated+childhood+malaria+in+Gabon%3A+a+randomized+trial+to+guide+national+policy%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy.</a> Malar. J. 7, 31(2008).</li>
<li>Oyewole, I. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behaviour+and+population+dynamics+of+the+major+anopheline+vectors+in+a+malaria+endemic+area+in+southern+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vector+Borne+Dis%22%5BJournal%5D)">Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria.</a> J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).</li>
<li>Harris, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+proportion+of+asymptomatic+Plasmodium+infections+with+low+and+sub-microscopic+parasite+densities+in+the+low+transmission+setting+of+Temotu+Province%2C+Solomon+Islands%3A+challenges+for+malaria+diagnostics+in+an+elimination+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J.+%22%5BJournal%5D)">A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting.</a> Malar. J. . 9, 254(2010).</li>
<li>Ouedraogo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substantial+contribution+of+submicroscopical+Plasmodium+falciparum+gametocyte+carriage+to+the+infectious+reservoir+in+an+area+of+seasonal+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission.</a> PLoS ONE. 4, e8410(2009).</li>
<li>Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+challenges+in+the+scaling+up+of+HIV%2C+TB%2C+and+malaria+programs%3A+The+interaction+of+health+and+laboratory+systems%2C+clinical+research%2C+and+service+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery.</a> Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).</li>
<li>Ishengoma, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+laboratories+in+the+Tanga+region+of+Tanzania%3A+the+quality+of+diagnostic+services+for+malaria+and+other+communicable+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Trop.+Med.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases.</a> Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).</li>
<li>Alonso, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+research+agenda+for+malaria+eradication%3A+vector+control%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">A research agenda for malaria eradication: vector control.</a> PLoS Med. 8, e1000401(2011).</li>
<li>Grimberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+efficient+non-organic+procedure+for+the+isolation+of+genomic+DNA+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood.</a> Nucleic Acids Res. 17, 8390(1989).</li>
<li>Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indentification+of+single+specimens+of+the+Anopheles+gambiae+complex+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction.</a> American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).</li>
<li>Kent, R. J., Norris, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mammalian+blood+meals+in+mosquitoes+by+a+multiplexed+polymerase+chain+reaction+targeting+cytochrome+B%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).</li>
<li>Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum%3A+detection+of+polymorphisms+in+the+dihydrofolate+reductase+and+dihydropteroate+synthetase+genes+by+PCR+and+restriction+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion.</a> Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).</li>
<li>Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+by+distance+among+Aedes+aegypti+populations+along+the+northeastern+coast+of+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).</li>
<li>Kreader, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relief+of+amplification+inhibition+in+PCR+with+bovine+serum+albumin+or+T4+gene+32+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).</li>
<li>Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsatellite+DNA+polymorphism+and+heterozygosity+among+field+and+laboratory+populations+of+Anopheles+gambiae+ss+%28Diptera+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae).</a> J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).</li>
<li>Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+polymerase+chain+reaction-amplified+malarial+DNA+in+infected+blood+and+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes.</a> Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).</li>
<li>Al-Soud, W. A., Radstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+PCR-inhibitory+components+in+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li>
<li>Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inhibitory+effect+of+pentobarbitone+on+reverse+transcription-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan basitleştirilmiş Chelex yöntemi kalitesi Anopheles spp ve P. çıkarılması sağlar farklı PCR uygulamaları mükellef sivrisinek örneklerden falciparum DNA. Bu teknik, ilaca dirençli P. moleküler sıtma vektör sivrisinek tespiti ve gözetim için istihdam edilebilir ulusal sıtma kontrol programları için sivrisinekler falciparum allel. Basitleştirilmiş Chelex tekniğin avantajları basitlik, daha az reaktif ve dolayısıyla maliyet, güvenlik ve bu yöntemi 10 salting out (2 saat 47 dakika ve bir gecede adım, Tablo 1) gibi standart protokolleri daha kısa işlem süresi (37 dakika) bulunmaktadır. Söz konusu avantajlar ve minimal reaktif gereksinimleri (3 reaktifler) mevcut standart protokol (10 reaktifleri, Tablo 1) 11,15 karşılaştırıldığında, sabit reaktif endemik ülke laboratuvarları basitleştirilmiş Chelex protokolü özellikle kolay haletedarik zinciri çoğu kez sağlamak zordur. Yöntemin özel bir sınırlama standart protokol gibi, aynı zamanda sivrisinek zar 16 meydana geldiği bilinmektedir PCR inhibitörleri tabi olmasıdır. Bununla birlikte, bu kolayca deneylerinde BSA dahil edilmesi ile rahatlatılır. BSA de başarıyla diğer PCR uygulamaları 17,18 inhibitörleri karşı bir amplifikasyon artırıcı olarak istihdam edilmiştir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> Chelex-100, 50-100 kuru örgü </td><td> BioRad </td><td> # 143-2832 </td><td></td></tr><tr><td> Saponin </td><td> SIGMA </td><td> 142-7425 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> New England Biolabs </td><td> B9001S </td><td></td></tr></tbody></table>

dna ekstraksiyonu için a simple chelex protokolü<em&gt; anofel</em&gt; spp.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemik ülkede giderek kontrol programlarının 1,2,3,4,5 ayrılmaz bir parçası olarak, verimli yazarak, tanımlama ve sıtma parazitleri ve vektör sivrisineklere karşı gözetim için moleküler araçlar benimsiyor. Işlemleri bu doğru yaklaşımların sürdürülebilir kurulması için sıtma ve hasis reaktif ve ekipman ihtiyaçları ile eleme çabaları, basit ve ekonomik yöntem, güçlendirmek için araştırma 6,7,8 gereklidir. Burada alanda toplanan sivrisinek örneklerden sıtma parazit ve vektör DNA ayıklamak için basit bir Chelex tabanlı tekniğinin sunulması. Biz morfolojik 72 Anofel gambiae sl belirlenmiştir. Piretrum sprey Macha de Sıtma Enstitüsü 2.000 km 2 civarı içinde evlerin odalarında uyku yakalar tarafından yakalanan 156 sivrisinek. Diseksiyonu 72 Anofel gam için karından baş ve toraks ayırmak için sonrabiae sl. sivrisinekler, iki ayrı bölümden 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine yerleştirilir ve deiyonize su içinde 20 ul batık edildi. Steril bir pipet ucu kullanarak, her bölüm ayrı ayrı sivrisinek deiyonize su içinde homojen bir süspansiyon ile homojenize edildi. 10 ul başka bir ayrı otoklavlanmış 1.5 ml tüpüne nakledilir iken her bir sivrisinek bölümünden sonraki Homojenat, 10 ul muhafaza edildi. Ayrı alikotları ekstraksiyon protokolü 9,10 salting out basitleştirilmiş Chelex veya standart ya tarafından DNA ekstraksiyonu tabi tutuldu. Bu DNA ekstraksiyon 9 sırasında protein çökeltme adımı için zararlı organik çözücüler (örneğin, fenol ve kloroform gibi) yerine yüksek tuz konsantrasyonları kullanır çünkü dışarı tuzlama protokol olarak adlandırılan ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Özler eklembacaklı mitokondriyal nikotinamid adenin dinükleotid dehidrojenaz hedefleme primerler kullanılarak PCR amplifikasyonu için şablon olarak kullanıldıKaraburun (NADH) altbirim 4 gen (ND4) Plasmodium falciparum enfeksiyonu 12 yazmak için DNA kalitesi 11, Anofel gambiae türler 10 tespiti için PCR ve nested PCR kontrol etmek. DNA kalitesi (ND4) kullanarak Karşılaştırma PCR kurulan dışarı tuzlama protokolü göreli Chelex yaklaşım için% 93 duyarlılık ve% 82 özgüllük gösterdi. Duyarlılık ve özgüllük Sorumlu değerleri P. için sırasıyla, türler tanımlama PCR ve% 92 ve% 80 ile, sırasıyla,% 100 ve% 78 idi falciparum tespiti PCR. Chelex veya düzenli her üç PCR uygulamalarında protokolü üzerinden tuzlama ile Amplikon sinyal vererek örneklerin oranları arasında anlamlı farklılık saptanmadı. Chelex yaklaşım üç basit reaktifler ve tamamlamak için 37 dakika gerekli iken bir gecede adım dahil, 10 farklı reaktifler ve 2 saat ve 47 dk &#39;işlem süresi gerektirdiği protokol üzerinde tuzlama. Bizim sonuçlarımız th gösterChelex yöntem de mevcut tuzlama dışarı çıkarma ile karşılaştırılabilir ve sabit bir reaktif tedarik zinciri çoğu kez muhafaza edilmesi güçtür kaynak sınırlı olduğu ortam içinde basit ve sürdürülebilir bir yaklaşım olarak ikame edilebilir.

Sivrisinek DNA ekstraktı kalitesi için PCR (Şekil 1), Anofel arabiensis moleküler tanımlama (Şekil 2) ve P. sonuçları örnekleri basitleştirilmiş Chelex yöntem çok daha az adımda (Tablo 1) rağmen, protokol 10 salting out standart benzer sonuçlar verdiğini falciparum algılama (Şekil 3) göstermektedir. Ilgili özler karşılaştırılabilir DNA kalitesi sayesinde şaşırtıcı olmadığını An ile ilgili örnek pozitiflik oranları. gambiae türler gibi parazit enfeksiyon oranları McNemar ki-kare testi (Şekil 3) göre istatistiksel olarak farklı değildi. Duyarlılık (%) olarak hesaplanmıştır TP / (TP + FN) TP gerçek pozitifler gösterir ve FN yanlış negatifler gösterir * 100,. Özgünlük (%) TN / olarak saptandı (TN + FP) TN gerçek negatifler gösterir ve FP yanlış pozitiflerin gösterir * 100,. DNA kalitesi (ND4) PCR kurulmuş olarak protokolü üzerinden tuzlama altın standardına göre Chelex yaklaşım için% 93 duyarlılık ve% 82 özgüllük gösterdi. Duyarlılık ve özgüllük Sorumlu değerleri P. için sırasıyla, türler tanımlama PCR ve% 92 ve% 80 ile, sırasıyla,% 100 ve% 78 idi falciparum tespiti PCR. Reaksiyon karışımları BSA ek protokolü üzerinden tuzlama basitleştirilmiş Chelex ve düzenli hem nedeniyle PCR inhibitörleri 14 dindirilmesi için PCR pozitif genel bir artış (Şekil 3) sonuçlandı. Ancak bu artış Chelex özler (p = 0.039) üzerinde DNA kalitesi (ND4 PCR) haricinde istatistiksel olarak anlamlı değildi. P. üzerinde Allel özel sınırlama enzimi özümlemesi falciparum DHFR (ya da diğer hedef gen) Amplikon ilaç direnci allelleri (; tükürük bezi veriler gösterilmemiştir Şekil 4) için orta-bağırsak ve tükürük bezi sıtma enfeksiyonu genotipleme sağlar. <table boorder='"1"&gt;'><tr><td colspan="2"> Basit Chelex Prosedürü </td><td colspan="2"> Standart Prosedür üzerinden Tuzlama </td></tr><tr><td> Adımlar </td><td> Reaktifler </td><td> Adımlar </td><td> Reaktifler </td></tr><tr><td><ol><li> 1.5 ml mikrofuge'de tüp numune ekleyin ve 1X PBS /% 1 Saponin solüsyonu (2 dak) 100 ul içerisinde homojenize. </li><li> 20 dakika için oda sıcaklığında bırakın. </li><li> 2 dakika boyunca 20.000 xg'de Spin ve supernatant atın. </li><li> 1X PBS 100 ul ekleyin ve anlık (3 sn) vorteks tarafından yavaşça karıştırın. </li><li> 2 dakika boyunca 20.000 xg'de Spin ve supernatant atın. </li><li> Deiyonize su ve 75 ul steril deiyonize su içinde% 20 w / v Chelex 25 ul ekle. </li><li> 10 dakika sıcak, steril 23G derialtı iğne kaynatın ve tüp içeriğini kullanarak örnek tüpünün kapağını Pierce delik. </li><li> 2 at mikrofuge'de tüp Spin1 dakika için 0,000 xg. </li><li> Kullanılıncaya kadar -20 ° C (25 ul PCR reaksiyonunda 2.5 ul) steril prelabeled flakon ve mağaza DNA çözeltisi içine supernatant aktarın. </li></ol></td><td> PBS Saponin Chelex-100 boncuk </td><td><ol><li> 1.5 ml mikrofuge'de tüp numune ekleyin ve 1% DEPC (2 dak) 100 ul Bender tampon * içerisinde homojenize. </li><li> 1 saat boyunca 65 ° C'de inkübe edin. </li><li> 15 ul soğuk 8 M potasyum asetat ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 45 dakika buz üzerinde inkübe edin. </li><li> Yeni bir 1.5 ml tüp supernatant 10 dk ve transferi için 20.000 xg'de mikrofuge'de tüpler örnek Spin. </li><li> % 100 etanol 250 ul ekleyin ve tersini tüp ile iyice karıştırın. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında numune inkübe edin. </li><li> 15 dakika boyunca 20.000 xg'de örnekleri Spin. </li><li> Aspire ve (30 m tüp pelet tamamen kurumasını bırakarak, supernatant atın) içinde. </li><li> 4 gecede 0,1 X SSC + RNAse (10 ug / ml) 20 ul içinde süspanse pelet ° C. </li><li> Kullanıma kadar -20 ° C'de 80 ul DEPC su ve mağaza ekleyin. </li></ol></td><td> Diethylpyrocarbonate (DEPC) * Bender Tampon: 0.1 M NaCl 0.2 M Sakkaroz 0.1 M Tris-HCL 0.05 M EDTA, pH 9.1 ' DEPC su içinde% 0.5 SDS 8 M Potasyum asetat Etanol 0,1 X Tuzlu sodyum sitrat (SSC) tampon RNAse (10 ug / ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> TOPLAM SÜRE: 37 dk </td><td colspan="2"> TOPLAM SÜRE: 2 saat 47 dk, artı gecede </td></tr></table> Tablo 1. Basit Chelex protokolü için reaktifler ve zaman gereksinimleri adım karşılaştırma adım ve standard sivrisinek örneklerinden DNA ekstraksiyonu için yöntemi tuzlama. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. ND4 mitokondriyal PCR basitleştirilmiş Chelex "C" DNA kalitesinin karşılaştırılması ve Anofel arabiensis alan numuneler üzerinde "M" özler dışarı tuzlama standart. NC, negatif kontrol; M1 ve C1, M2 ve C2, M3 ve C3, ve M4 ve C4 üzerinden tuzlama ve aynı bir araba Chelex özler eşleştirilir. arabiensis sivrisinek örnekleri. L, 100 bp DNA ladder. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2,"> Şekil 2 Anofel arabiensis için Moleküler tanımlama PCR C1 ve M1, C2 ve M2, C3 ve M3, C4 ve M4 "M" salting out ve aynı sivrisinek numuneler için Chelex "C" DNA ekstraktları basitleştirilmiş itibaren ilgili Amplikon temsil eder;.. AR, Anofel arabiensisPozitif kontrol, L, 100 bp DNA ladder. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Chelex ve Anofel arabiensis (AR) 10, artropod NADH dehidrogenaz geninin 4 (ND4) DNA kalitesi testi 11 ve antifolate ilaç direnci P moleküler tespiti için PCR ile, sivrisinek alan örnekleri DNA özü dışarı Tuzlanmaya pozitiflerin Algılama . falciparum DHFR genotipleme 12 (F-M4). Reaksiyon karışımı BSA ile veya olmadan çalıştırabilirsiniz deneyleri için gösterilen sonuçlar. McNemar ki-kare testi DNA pozitif PCR yüzde arasındaki farklılıklar basitleştirilmiş Chelex çıkarılan ve protokolleri tuzlama standart istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4,"> P. basitleştirilmiş Chelex protokolünün uygulanması ilaç direnci alleller için sivrisinekler falciparum enfeksiyonlar (orta-gut veriler gösterilmemiştir). P. kodon 108 sınırdaş Amplikon ilgili BstN Ben sindirim falciparum DHFR gen 12 sivrisinek örnekleri (; mid-gut veriler gösterilmemiştir M1-M5) in cycloguanil dayanıklı S108T mutantlar gösterir. U, sindirilmemiş 522 bp amplikon; FCR3, laboratuvar standart P. S108T taşıyan falciparum pozitif kontrol klonu; K1, P. falciparum laboratuvar standart cycloguanil duyarlı S108N taşıyan klon negatif kontrol; L, 100 bp DNA ladder.

Sivrisinek örneklerden kalitesi sıtma parazit ve vektör DNA ayıklamak için bir hızlı ve ekonomik bir şekilde açıklanmıştır. Basit bir yöntem sivrisinek orta bağırsak ve tükürük bezi aşamalarında sıtma parazitlerinin genotipleme yanı sıra moleküler tanımlanması, Chelex reçine çelatlama özelliklerine etkinleştirir sermaye<em&gt; Anofel</em&gt; PCR ile türlerin kardeş.

DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü<em&gt; Anofel</em&gt; Spp.

Endemik ülkeler, sıtma parazitleri ve vektörlerine karşı etkin tiplendirme, tanımlama ve sürveyans için moleküler araçları giderek daha fazla benimsemektedir...

Bu prosedürün genel amacı, anomali gösteren örneklerin orta bağırsak ve tükürük bezi bölümlerinden sıtma, parazit ve sivrisinek DNA'sı ekstre etmektir. Bu işlem, öncelikle sivrisineğin karın ve göğüs arasındaki eklemden tam olarak kesilerek orta bağsızın tükürük bezi bölümünden ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, her bir bölüm deiyonize su içinde ayrı ayrı öğütülür.Ardından doku süspansiyonuna lye işlemi uygulanıp yıkanır ve hücre peleti geri kazanılır. Son olarak, hücre peleti yeniden süspande edilip kaynatılır ve DNA ekstre edilir. Nihayetinde, PCR ve alele özgü restriksiyun enzimi sindirimi yoluyla anomalilerin, vektör türlerinin ve malarya enfeksiyonlarının genotiplerinin belirlenmesinde kalıp olarak kullanılmaya uygun, yüksek kaliteli sivrisinek ve malarya paraziti DNA'sı gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu oldukça basit tekniğin, organik ekstraksiyon ve ayıklama yöntemleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, çok az miktarda güvenli ve kolayca temin edilebilen reaktifler kullanması ve işlem süresinin çok daha kısa olmasıdır. Sivrisineği diseke etmeye başlamak için, onu küçük bir paraform parçası üzerine yerleştirin ve bir diseksiyon mikroskobuna monte edin. Üzerini bir damla deiyonize su ile kaplayın.Dokuyu yumuşatmak için, sivrisinek gövdesini toraks ile abdomen arasındaki eklem noktasından tam olarak kesin. Böylece baş ve toraks kısımlarını abdomen bölümünden ayırmış olursunuz. Diseke edilen her bir sivrisinek bölümünü, sivrisinek kimlik numarası ve vücut bölümü ile önceden etiketlenmiş, temiz otoklavlı 1,5 milliliter mikrosantrifüj tüpüne aktarın; parafilmi atın ve bir sonraki sivrisineğe geçmeden önce mikroskop tablasını %70 alkol ile nemlendirilmiş bir Kim wipe ile dikkatlice silin. Sivrisinek DNA'sını ekstrakte etmek için, öncelikle numune tüpüne 20 microliters deiyonize su pipetleyin.Ardından, daldırılmış sivrisinek kesitini homojen bir süspansiyon haline getirmek için pipet ucunu kullanarak ezin. Örnek homojenatına 100 µL otoklavlanmış 1% saponin içeren XPBS çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için hafifçe vorteksleyin. Örneği oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.Ardından 20,000 G'de iki dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Peleti 100 µL 1X PBS içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra santrifüj işlemini tekrarlayın.75 µL steril deiyonize su ve deiyonize su içinde %20 ağırlık/hacim oranında Cellex 100 reçine süspansiyonundan 25 µL ekleyin ve bunsen beki ile sterilize edilmiş 23 gauge hipodermik iğne kullanarak pellet'i yeniden süspand etmek için nazikçe vorteksleyin. Örnek tüpünün kapağına bir delik açın.Örnek süspansiyonunu bir ısıtma bloğunda 10 dakika boyunca kaynatın. 20,000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve DNA çözeltisini, ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini kontrol etmek için PCR reaksiyonlarında kalıp olarak kullanılmak üzere önceden etiketlenmiş bir saklama tüpüne aktarın; burada, eklem bacaklı mitokondriyal nikotinamid adenin dinükleotid dehidrojenaz alt birim dört geninin 400 baz çiftlik bir fragman üretmesi beklenen bölgesini amplifiye edin. Ardından, Ananais Gambia türlerini ayırt etmek için, Ananais Gambia Sens Stricto için 390 baz çifti ve Ananais api için 315 baz çifti boyutlarında ürünler üretmesi beklenen intergenik ara bölgedeki SNP'leri çevreleyen bir bölgeyi amplifiye edin.Ardından, p. falciparum antifolat ilaç direnci polimorfizmlerinin genotiplemesi yapılır. 16, 51, 59, 108 ve 164 numaralı amino asit kodonlarını çevreleyen bölgeyi çoğaltmak için nested PCR uygulanır. Parazitlerin dihidrofolat redüktaz genindeki amplikonun, antifolat ilaç direncini tespit etmek için alele özgü sindirimi gerçekleştirilir.İlişkili polimorfizmler. Reaksiyonları %2 AROS jel elektroforezi ile kontrol edin. Sivrisinek DNA ekstrakt kalitesi analizi, RABIS moleküler tanımlama ve p. falciparum genotiplemesi için yapılan PCR analizlerinden elde edilen sonuçlar, basitleştirilmiş Kelex yönteminin daha az adım ve standart tuz çöktürme protokolünün dörtte birinden daha kısa sürede, ilgili ekstraktlarda benzer DNA kalitesiyle benzer sonuçlar verdiğini göstermektedir; anomaliler, Gambiya kardeş türleri ve parazit enfeksiyon oranları açısından örnek pozitiflik oranlarının McNear ki-kare testine göre istatistiksel olarak farklı çıkmaması şaşırtıcı değildir.Hem basitleştirilmiş kelex hem de standart tuz çöktürme protokolü için PCR inhibitörlerinin uzaklaştırılması nedeniyle, reaksiyon karışımlarına BSA eklenmesi PCR pozitifliklerinde genel bir artışla sonuçlanmıştır. Ancak, kelex ekstraktlarındaki DNA kalitesi hariç, bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmamıştır. p falciparum amplikonunun alele özgü restriksiyon enzimi ile sindirimi, yöntem uzmanlaşıldıktan sonra orta bağırsak ve tükürük bezi sıtma enfeksiyonlarının ilaç direnç allelleri için genotiplendirilmesine olanak tanır.Bu teknik, uygun şekilde uygulandığında yaklaşık 37 dakikada tamamlanabilmelidir.

a-simple-chelex-protocol-for-dna-extraction-from-anopheles-spp

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Son zamanlarda yüksek verimlilik sıralama teknolojisi büyük ölçüde Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) deney duyarlılığı artmış ve saflaştırılmış hücreleri veya disseke doku kullanarak uygulama açtı. İşte biz ChIP tekniği kullanılacak bir yöntem...

Kullanarak Kromatin immünopresipitasyon (ChIP) Drosophila Doku

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Biz primer T hücreleri kullanarak kromatin immunoprecipitation için bir sağlam bir yöntem tarif. Metodu standart yaklaşımlar üzerine kurulmuştur, ama hücrelerin sınırlı bir miktarda için verimliliği artırmak koşulları ve reaktifler belirli bir kümesi kullanır edilir. Önemli olarak, veriler analiz aşaması bölgesinin, bir ayrıntılı bir açıklama sunulmaktadır edilir.

Biyokütle Limit Tutarlar kullanarak Verimli Kromatin Immunoprecipitation

Kromozom boyama, hücre çekirdeğinin organizasyonunu ve karyotipin evrimini incelemek için yararlı bir yöntemdir. Burada, daha sonra iki ve üç boyutlu floresan in situ hibridizasyon (FISH) için kullanılan tek politen kromozomlarından belirli ilgi alanlarını izole etmek ve güçlendirmek için bir yaklaşım sergiliyoruz.

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Burada nicel PCR ile tespit tam kan HIV proviral DNA için basit ve hızlı bir kağıt bazlı DNA ekstraksiyon yöntemini tarif etmektedir. Bu protokol için diğer genetik işaretleyiciler saptanması veya alternatif yükseltme yöntemleri kullanılarak kullanılmak için uzatılabilir.

Nükleik Asitlerin süzülmesi İzolasyonu: basit ve hızlı DNA izolasyonu,

Burada iki iplikçikli DNA genleri ile bitki virüsleri tanımlamak için yeni bir yaklaşım mevcut. DNA ve RNA virüslü yaprakları ayıklamak ve yeni nesil sıralama dışarı taşımak için standart yöntemleri kullanın. Bioinformatic araçları dizileri contigs monte, virüs genleri temsil eden contigs tanımlamak ve genleri taksonomik gruplara atamak.

Ham Virion ayıklama DNA analizi yeni virüs genleri keşfetmek için virüslü yaprakları gelen RNA analizi ile birleştirerek

Burada, sivrisineklerden yüksek kaliteli DNA ekstraksiyonları üretmek için manyetik boncuklar kullanan bir DNA ekstraksiyon protokolü açıklanmıştır. Bu ekstraksiyonlar, aşağı akış yeni nesil sıralama yaklaşımı için uygundur.

Yeni Nesil Sıralama için Manyetik Boncuk Bazlı Sivrisinek DNA Ekstraksiyon Protokolü

Bu protokol, gRNA kaynaklı Cas9 bölünmesi ve DNA onarımının ardından hedef sahalarda homolog olmayan son birleştirme (NHEJ) olaylarının tanımlanması ve nicelleştirilmesi için analiz de dahil olmak üzere DNA ekstraksiyonundan dijital damlacık PCR (ddPCR) için deneysel kuruluma kadar adımları sağlar. Bu yöntemin diğer kullanımları arasında polimorfizm tespiti ve gen düzenleme varyant doğrulaması gibi uygulamalar yer almaktadır.

Genetiği Değiştirilmiş Anopheline Sivrisinek Popülasyonlarındaki Indels Mutasyonlarını Tespit Etmek için Dijital Damlacık PCR

Bu makalede, CRISPR/Cas9 tarafından indüklenen indellerin hızlı tanımlanması ve sivrisinek Aedes aegypti'deki mutant çizgilerinin yüksek çözünürlüklü eriyik analizi kullanılarak seçilmesi için bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Sivrisinek Aedes aegypti'de Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi Kullanarak CRISPR/Cas9 Mutagenesis'i Takip Eden Indel Tespiti

Bu protokol, sivrisineklerde tükürük bezi sporozoitlerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı bir immünosorbent testini tanımlar. Kolayca bulunabilen monoklonal antikorları kullanan yöntem, Plasmodium falciparum veya Plasmodium vivax taşıyan sivrisineklerin uygun maliyetli, yüksek verimli tespitini sağlar. Yöntem, vektör araştırmaları da dahil olmak üzere sıtma bulaşma araştırmaları için uygundur.

Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Anofel Sivrisineklerinde Plasmodium Sporozoitlerin Tespiti

Öğrenin, Anopheles sivrisineklerinden ve sıtma parazitlerinden hızlı DNA ekstraksiyonu için basit Chelex protokolünü. Bu yöntem, moleküler tanımlama ve genotipleme için yüksek kaliteli DNA sağlar.

DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü

Daha fazla video keşfet