DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü Anofel Spp.

Bu prosedürün genel amacı, sıtma, parazit ve sivrisinek DNA'sını anomalilerin, örneklerin orta bağırsak ve tükürük bezi bölümlerinden çıkarmaktır. Bu, önce sivrisineğin tam olarak karın ve göğüs kafesi arasındaki eklemden kesilmesi ve böylece orta bağırsağın tükürük bezi bölümünden ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, her bölüm deiyonize suda ayrı ayrı öğütülür.

Daha sonra doku süspansiyonu yatar ve yıkanır ve hücre peleti geri kazanılır. Son olarak, hücre peleti sulandırılır ve kaynatılır ve DNA ekstrakte edilir. Sonuç olarak, PCR ve alele özgü kısıtlama enzim sindirimi yoluyla anomalileri, vektör türlerini ve genotip sıtma enfeksiyonlarını tanımlamak için şablon olarak kullanılmaya uygun yüksek kaliteli sivrisinek ve sıtma paraziti, DNA'yı gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Dolayısıyla, bu çok basit tekniğin organik ekstraksiyon ve ayıklama yöntemleri gibi mevcut olanlara göre ana avantajı, çok az sayıda güvenli ve hazır reaktif kullanması ve çok daha az işlem süresi kullanmasıdır. Sivrisineği diseksiyona başlamak için, küçük bir paraform parçasına yerleştirin ve bir diseksiyon mikroskobuna monte edin. Bir damla deiyonize su ile kaplayın.

Dokuyu boyut olarak yumuşatmak için, sivrisinek karkası tam olarak göğüs kafesi ve karın arasındaki eklemde bulunur. Böylece karın bölgesinden baş ve göğüs kafesi koparılır. Diseke edilmiş her sivrisinek bölümünü temiz bir otoklava, sivrisinek kimlik numarası ve vücut bölümü ile önceden etiketlenmiş 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın, para filmi atın ve% 70 alkolle nemlendirilmiş bir Kim mendili kullanarak, sivrisinek DNA'sını çıkarmak için bir sonraki sivrisineğe işlemeden önce mikroskop aşamasını dikkatlice silin, önce 20 mikrolitre deiyonize suyu numune tüpüne pipetleyin.

Ve batık sivrisinek bölümünü düzgün bir süspansiyon haline getirmek için pipet ucunu kullanın. Numune homojenatına 100 mikrolitre otoklav, bir XPBS %1 saponin çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için hafifçe girdap yapın. Numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Daha sonra iki dakika boyunca 20.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peleti 100 mikrolitre bir XPBS'de yeniden süspanse edin. Ardından dönüşü tekrarlayın.

Hacim başına 75 mikrolitre steril deiyonize su ve 25 mikrolitre %20 ağırlık ekleyin. Deiyonize suda Cellex 100 reçine süspansiyonu ve bunsen brülöründe alevli steril 23 gauge hipodermik iğne kullanarak peleti yeniden süspanse etmek için hafifçe girdap. Numune tüpünün kapağında bir delik açın.

Numune süspansiyonunu bir ısıtma bloğunda 10 dakika kaynatın. Bir dakika boyunca 20.000 G'de santrifüjleyin ve DNA çözeltisini, ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini kontrol etmek için PCR reaksiyonlarında şablon olarak kullanılmak üzere önceden etiketlenmiş bir saklama şişesine aktarın, eklembacaklı mi mitokondriyal nikotinamid adenin dinükleotid dehidrojenaz alt biriminin bir bölgesini çoğaltın 400 baz çifti fragmanı üretmesi beklenen dört gen. Ananais Gambia türleri arasında ayrım yapmanın ardından, Ananais Gambia Sens Stricto için 390 baz çifti ve ananais api için 315 baz çifti boyutları üretmesi beklenen intergenik aralayıcı bölgede SNP'leri çevreleyen bir bölgeyi yükseltin.

Ansis daha sonra genotipe p falciparum anti folat ilaç direnci polimorfizmleri. 16, 51, 59, 108 ve 164 amino asit kodonlarını çevreleyen bölgeyi yükseltmek için iç içe PCR gerçekleştirin. Parazitlerde, dihidro folat redüktaz geni, anti folat ilaç direncini tespit etmek için amplikonun alele özgü sindirimini gerçekleştirir.

İlişkili polimorfizmler. %2 AROS jel muayenesinde reaksiyonları kontrol edin. Sivrisinek DNA özütü kalitesi analis RABIS moleküler tanımlaması ve p falciparum genotiplemesi için PCR testlerinden elde edilen sonuç örnekleri, basitleştirilmiş Kelex yönteminin, ilgili ekstraktlarda karşılaştırılabilir DNA kalitesi ile daha az adıma ve zamanın dörtte birinden daha azına rağmen standart tuzlama protokolüne benzer sonuçlar verdiğini göstermektedir, anomalilere göre numune pozitiflik oranlarının şaşırtıcı olmaması şaşırtıcı değildir, Gambiya'daki kardeş türler ve parazit enfeksiyon oranları McNear'ın ki-kare testine göre istatistiksel olarak farklı değildi.

Reaksiyon karışımlarına BSA'nın eklenmesi, hem basitleştirilmiş kelex hem de düzenli tuzlama protokolü için PCR inhibitörlerinin çıkarılmasına bağlı olarak PCR pozitiflerinde genel bir artışa neden olur. Bununla birlikte, bu artış, kelex ekstraktları üzerindeki DNA kalitesi dışında istatistiksel olarak anlamlı değildi. P falciparum amplicon'un alele özgü kısıtlama enzimi sindirimi, ilaç direnci alelleri için orta bağırsak ve tükürük bezi sıtma enfeksiyonlarının genotiplenmesini sağlar Bir kez ustalaştı.

Bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık 37 dakika içinde gerçekleştirilebilmelidir.