DNA ekstraksiyonu için A Simple Chelex Protokolü Anofel Spp.
9 Ocak 2013
Sivrisinek örneklerden kalitesi sıtma parazit ve vektör DNA ayıklamak için bir hızlı ve ekonomik bir şekilde açıklanmıştır. Basit bir yöntem sivrisinek orta bağırsak ve tükürük bezi aşamalarında sıtma parazitlerinin genotipleme yanı sıra moleküler tanımlanması, Chelex reçine çelatlama özelliklerine etkinleştirir sermaye Anofel PCR ile türlerin kardeş.
Bu prosedürün genel amacı, sıtma, parazit ve sivrisinek DNA'sını anomalilerin, örneklerin orta bağırsak ve tükürük bezi bölümlerinden çıkarmaktır. Bu, önce sivrisineğin tam olarak karın ve göğüs kafesi arasındaki eklemden kesilmesi ve böylece orta bağırsağın tükürük bezi bölümünden ayrılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, her bölüm deiyonize suda ayrı ayrı öğütülür.
Daha sonra doku süspansiyonu yatar ve yıkanır ve hücre peleti geri kazanılır. Son olarak, hücre peleti sulandırılır ve kaynatılır ve DNA ekstrakte edilir. Sonuç olarak, PCR ve alele özgü kısıtlama enzim sindirimi yoluyla anomalileri, vektör türlerini ve genotip sıtma enfeksiyonlarını tanımlamak için şablon olarak kullanılmaya uygun yüksek kaliteli sivrisinek ve sıtma paraziti, DNA'yı gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Dolayısıyla, bu çok basit tekniğin organik ekstraksiyon ve ayıklama yöntemleri gibi mevcut olanlara göre ana avantajı, çok az sayıda güvenli ve hazır reaktif kullanması ve çok daha az işlem süresi kullanmasıdır. Sivrisineği diseksiyona başlamak için, küçük bir paraform parçasına yerleştirin ve bir diseksiyon mikroskobuna monte edin. Bir damla deiyonize su ile kaplayın.
Dokuyu boyut olarak yumuşatmak için, sivrisinek karkası tam olarak göğüs kafesi ve karın arasındaki eklemde bulunur. Böylece karın bölgesinden baş ve göğüs kafesi koparılır. Diseke edilmiş her sivrisinek bölümünü temiz bir otoklava, sivrisinek kimlik numarası ve vücut bölümü ile önceden etiketlenmiş 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın, para filmi atın ve% 70 alkolle nemlendirilmiş bir Kim mendili kullanarak, sivrisinek DNA'sını çıkarmak için bir sonraki sivrisineğe işlemeden önce mikroskop aşamasını dikkatlice silin, önce 20 mikrolitre deiyonize suyu numune tüpüne pipetleyin.
Ve batık sivrisinek bölümünü düzgün bir süspansiyon haline getirmek için pipet ucunu kullanın. Numune homojenatına 100 mikrolitre otoklav, bir XPBS %1 saponin çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için hafifçe girdap yapın. Numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
Daha sonra iki dakika boyunca 20.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peleti 100 mikrolitre bir XPBS'de yeniden süspanse edin. Ardından dönüşü tekrarlayın.
Hacim başına 75 mikrolitre steril deiyonize su ve 25 mikrolitre %20 ağırlık ekleyin. Deiyonize suda Cellex 100 reçine süspansiyonu ve bunsen brülöründe alevli steril 23 gauge hipodermik iğne kullanarak peleti yeniden süspanse etmek için hafifçe girdap. Numune tüpünün kapağında bir delik açın.
Numune süspansiyonunu bir ısıtma bloğunda 10 dakika kaynatın. Bir dakika boyunca 20.000 G'de santrifüjleyin ve DNA çözeltisini, ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini kontrol etmek için PCR reaksiyonlarında şablon olarak kullanılmak üzere önceden etiketlenmiş bir saklama şişesine aktarın, eklembacaklı mi mitokondriyal nikotinamid adenin dinükleotid dehidrojenaz alt biriminin bir bölgesini çoğaltın 400 baz çifti fragmanı üretmesi beklenen dört gen. Ananais Gambia türleri arasında ayrım yapmanın ardından, Ananais Gambia Sens Stricto için 390 baz çifti ve ananais api için 315 baz çifti boyutları üretmesi beklenen intergenik aralayıcı bölgede SNP'leri çevreleyen bir bölgeyi yükseltin.
Ansis daha sonra genotipe p falciparum anti folat ilaç direnci polimorfizmleri. 16, 51, 59, 108 ve 164 amino asit kodonlarını çevreleyen bölgeyi yükseltmek için iç içe PCR gerçekleştirin. Parazitlerde, dihidro folat redüktaz geni, anti folat ilaç direncini tespit etmek için amplikonun alele özgü sindirimini gerçekleştirir.
İlişkili polimorfizmler. %2 AROS jel muayenesinde reaksiyonları kontrol edin. Sivrisinek DNA özütü kalitesi analis RABIS moleküler tanımlaması ve p falciparum genotiplemesi için PCR testlerinden elde edilen sonuç örnekleri, basitleştirilmiş Kelex yönteminin, ilgili ekstraktlarda karşılaştırılabilir DNA kalitesi ile daha az adıma ve zamanın dörtte birinden daha azına rağmen standart tuzlama protokolüne benzer sonuçlar verdiğini göstermektedir, anomalilere göre numune pozitiflik oranlarının şaşırtıcı olmaması şaşırtıcı değildir, Gambiya'daki kardeş türler ve parazit enfeksiyon oranları McNear'ın ki-kare testine göre istatistiksel olarak farklı değildi.
Reaksiyon karışımlarına BSA'nın eklenmesi, hem basitleştirilmiş kelex hem de düzenli tuzlama protokolü için PCR inhibitörlerinin çıkarılmasına bağlı olarak PCR pozitiflerinde genel bir artışa neden olur. Bununla birlikte, bu artış, kelex ekstraktları üzerindeki DNA kalitesi dışında istatistiksel olarak anlamlı değildi. P falciparum amplicon'un alele özgü kısıtlama enzimi sindirimi, ilaç direnci alelleri için orta bağırsak ve tükürük bezi sıtma enfeksiyonlarının genotiplenmesini sağlar Bir kez ustalaştı.
Bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık 37 dakika içinde gerçekleştirilebilmelidir.
Genel Bakış
Bu makale, sıtma parazitlerinden ve sivrisinek vektörlerinden yüksek kaliteli DNA çıkarmanın hızlı ve uygun maliyetli bir yöntemini açıklamaktadır. Chelex reçinesi kullanarak, bu teknik sıtma parazitlerin etkili genotiplenmesi ve Anopheles türlerinin moleküler tanımlanmasına olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyoloji
- Genomik
Arka Plan
- Sıtma, Anopheles sivrisinekleri tarafından bulaşan önemli bir küresel sağlık sorunudur.
- Geleneksel DNA çıkarma yöntemleri zaman alıcı olabilir ve tehlikeli reaktifler gerektirebilir.
- DNA çıkarma için daha basit, daha güvenli ve daha verimli tekniklere ihtiyaç vardır.
- Bu çalışma, Chelex reçinesi kullanarak bu ihtiyaçları karşılayan bir yöntem sunar.
Çalışmanın Amacı
- Sıtma parazitlerinden ve sivrisinek vektörlerinden DNA çıkarmak için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem geliştirmek.
- Sıtma parazitlerin genotiplenmesi ve Anopheles türlerinin tanımlanmasını sağlamak.
- Yeni yöntemin verimliliğini ve etkinliğini geleneksel protokollere karşı karşılaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Sivrisinek örneklerinin orta bağırsak ve tükürük bezi bölümlerini ayırmak için diseksiyonu.
- Süspansiyon oluşturmak için iyonlaşmamış suda dokunun öğütülmesi.
- DNA çıkarmak için Chelex reçinesinin kullanımı.
- Genotiplenme ve tür tanımlama için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR).
Ana Sonuçlar
- Chelex yöntemi, PCR için uygun yüksek kaliteli DNA sağlar.
- Sonuçlar, işlem süresinde önemli ölçüde azalma ile geleneksel yöntemlere benzerdir.
- Tür tanımlama ve parazit enfeksiyonları için örnek pozitiflik oranları, yöntemler arasında istatistiksel olarak benzerdi.
- BSA'nın eklenmesi, inhibitörleri azaltarak PCR sonuçlarını iyileştirdi.
Sonuçlar
- Basitleştirilmiş Chelex yöntemi, sıtma vektörlerinden DNA çıkarmak için etkilidir.
- Bu teknik 40 dakikadan daha kısa sürede gerçekleştirilebilir, bu da onu rutin kullanım için pratik kılar.
- Bu, geleneksel DNA çıkarma yöntemlerine göre daha güvenli ve daha verimli bir alternatif sunar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
In resource-limited settings, sustainable molecular surveillance of malaria vectors and parasites requires DNA extraction methods that balance performance with operational simplicity. The Chelex-based protocol delivers comparable DNA quality to established salting-out methods while reducing reagent complexity and processing time from nearly three hours to under 40 minutes. This positions the method as a practical tool for enabling scalable, cost-effective genotyping and species identification workflows in endemic region research and control programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vector-parasite interactions by providing DNA templates for species confirmation and infection status assessment.
- Operational Value: Reduces hands-on time and reagent burden, supporting higher throughput in field-collected sample processing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces DNA suitable for PCR-based assays targeting vector species discrimination and parasite genotyping.
- Operational Value: Uses only three reagents (deionized water, saponin, Chelex resin), enhancing assay standardization and reducing variability in resource-constrained labs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports continuity from vector collection to downstream applications like drug resistance genotyping via nested PCR and restriction digestion.
- Operational Value: Eliminates need for hazardous organic solvents, improving safety and accessibility in field laboratories.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from specimen processing to genetic analysis, enabling reliable input for PCR-based identification and genotyping assays.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on vector species distribution and Plasmodium falciparum infection rates in field settings.
- Screening: Delivers DNA extracts with sufficient quality and yield for multiplex PCR applications, supporting assay readiness.
- Analytics: Enables quantitative assessment via PCR amplification of ND4, species-specific SNPs, and drug resistance loci, allowing comparison across sample groups.
- Translational Research: Connects entomological surveillance to parasite genotyping, supporting risk-adjusted decisions in malaria control strategies.
- Enterprise Reuse: Protocol simplicity and minimal equipment needs (microcentrifuge, heating block) allow adoption across multiple field sites and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in vector species identification and parasite detection through comparable sensitivity and specificity to benchmark methods.
- Operational Value: Achieves high reproducibility with minimal reagent dependency, reducing supply chain vulnerability in remote settings.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in surveillance programs by shortening time-to-result for molecular confirmation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of interventions by delivering timely, accurate data on vector competence and parasite prevalence.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology training for tissue dissection, homogenization, and PCR setup.
- Needs access to a microcentrifuge capable of 20,000 × g and a heating block for boiling step.
- Standardization across teams benefits from consistent vortexing and pipetting techniques during homogenization and resin resuspension.
- Adaptation to other mosquito species or sample types may require validation of lysis efficiency and inhibitor removal.
- Practical limitation: The method includes a manual grinding step that may limit ultra-high-throughput automation without modification.
