Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Genetik araştırmalar, insan genom dizisinin serbest bırakılmasından büyük ölçüde yararlanmıştır. Pyro dizileme, genetik varyasyonun yanı sıra RNA Alelik dengesizliği, DNA, metilasyon durumu ve gen kopya sayısının analizine izin veren benzersiz bir sistemdir. Bu videoda, genetik analiz için temel bir pyro dizileme reaksiyonu gösteriyoruz.

Merhaba, ben Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Bölümü'nde Dr.Charles Eby ve Dr.Brian Gage'in laboratuvarından Kristy King. Bugün size pyro dizilimi için bir prosedür göstereceğiz. Bu prosedür yararlıdır çünkü SNP'leri analiz etmek için kullanılan en kapsamlı ancak basit yöntemlerden biridir.

Piro dizilimi, bir nükleotid açık üç asal DNA zincirine dahil edildiğinde pirofosfat salınımından yararlanarak sentez yoluyla dizilemeye dayanır. Bir plaka yüklendikten sonra, nükleotidler, yazılım tarafından sağlanan bir diziye dayalı olarak dahil edilir: Bir kez serbest bırakıldıktan sonra, pirofosfat, lusiferaz tarafından Lucifer'i oksi Lucifer'e dönüştürmek için kullanılan ve ışığın yayılmasıyla sonuçlanan bir TP'nin salınmasıyla sonuçlanan bir reaksiyonda kullanılır. Kabul edilen ışık bir CCD kamera tarafından toplanır ve piros olarak da bilinen tepe noktaları olarak kaydedilir.

DNA zincirine dahil edilmeyen herhangi bir nükleotid, arka plan gürültüsünü önlemek için AP pira tarafından bozunur. Bu prosedür aşağıdaki adımları içerir. Test tasarımı, kalite kontrol için PCR jel elektroforezi ve piro dizilimi.

Öyleyse pyro dizilimi ile başlayalım. Pyro dizileme yapabilmek için öncelikle bir PCR ürünü hazırlanmalıdır. Piro dizilimi için PCR, tüm primerin kabaca 50 döngü boyunca kullanılmasını sağlamak için çoğu PCR'den daha fazla döngü gerektirir.

Pyro dizilimi ayrıca PCR primerlerinden birinin biyotinile edilmesini gerektirir. Son olarak, dahili bir astarın da gerekli olduğuna dikkat etmek önemlidir. Kontaminasyonun mevcut olmadığından emin olmak için pyro dizileme yoluyla sağlanan yazılımla verimli tahlil tasarımı gerçekleştirilebilir.

Ve PCR ürününün mevcut olduğunu doğrulamak için, negatif kontrolün yanı sıra birkaç numune üzerinde bir jel çalıştırılmalıdır. Piro sıralama plakasını yapmak için, 96 kuyulu piro sıralama plakasına 12 mikrolitre piro sıralama astar karışımı ekleyin. Bu, 43.2 mikrolitre iç astarın bir karışımını ve 1396.8 mikrolitre diz çökmüş bir tamponun piro sıralama plakasını yapışkan film ile kaplamasını gerektirir.

Kurulum, 96 kuyulu PCR ürününün her bir oyuğuna 50 dakikadan uzun sürecekse, 240 mikrolitre streptavidin kaplı sero hızları içeren 70 mikrolitre SRO hız karışımı ekleyin. Triss sodyum klorür, EDTA ve 20 ve 3, 600 mikrolitre sudan yapılmış 4, 560 mikrolitre bağlayıcı tampon ve kapağı güvenli bir şekilde değiştirin. 96 kuyulu PCR ürün plakasını boncuk karışımıyla birlikte oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin.

Kuyular arasında herhangi bir çapraz kontaminasyonu önlemek için kapağın sabitlendiğinden emin olun. Bu adım, strep ENC'nin, kaplanmış sferos boncuklarının PCR astarı üzerinde bulunan biyotin etiketine tamamen diz çökmesine izin verecektir. Plakaları hazırlamak için bir iş istasyonu kurun.

Buna reaktif olukları, PCR ürünü ve boncuk karışım tepsisi ve piro sıralama astar tepsisi dahildir. PCR ürünü ve boncuk karışım plakasının yanı sıra pyro sıralama astar tepsisinin, negatifler aynı yönde olacak şekilde düzgün şekilde hizalandığından emin olun. Numuneleri aktarmadan önce, üzerinde olabilecek boncukları veya kalıntıları serbest bırakmak için temiz suyla kapatılan vakum aletini sallayın.

Kalan suyu atın, oluğu yeniden doldurun ve vakumu açın. Vakum aletini, yaklaşık 30 saniye olan tüm su çıkana kadar olukta bırakın. Vakum aletinin filtre uçlarını PCR boncuk karışım plakasının kuyularına yerleştirin ve plakadaki tüm sıvı çıkana kadar kalmasına izin verin.

Yüzey gerilimini önlemek için hafif sallanma kullanılabilir. Sıvı borudan akmaya başladığında vakumu %70 etanol oluğuna yerleştirin. Filtre uçlarının etanolü beş saniye emmesine izin verin.

DNA'yı tek sarmallı PCR'ye denatüre eden 0.2 molar sodyum hidroksit ve yıkama tamponu için tekrarlayın. PCR ürününü temizlemek ve nötralize etmek için. Vakum hortumunu vakum aletinden ayırın ve vakum aletini, diz çökmüş bir tampon karışımında pyro sıralama astarını içeren pyro sıralama plakasına yerleştirin.

Vakum hortumu hala bağlıysa, piro sıralama plakasına yerleştirildiğinde, astar karışımı emilir. PCR ürününüzü kaybetmenize neden olan ipuçları. PCR ürününüzü dağıtmak için pyro sıralama plakasının kuyularındaki vakumun uçlarını hafifçe sallayın veya sallayın.

Sallama veya sallanma tamamlandıktan sonra vakum aletini pyro sıralama plakasından çıkarın ve vakum aletini hortuma yeniden bağlayın ve bir sonraki plaka için temizlemek üzere aleti temiz suya koyun. Pyro sıralama plakasını 80 santigrat derecede iki dakika boyunca bir ısı bloğuna yerleştirin. İki dakika sonra, plakayı ısı bloğundan çıkarın ve serin bir yüzeye yerleştirin.

Soğuduktan sonra ve buharlaşmayı önlemek için plaka 15 dakika içinde çalıştırılmadıkça, plakayı kaplamak için yapışkan film kullanılabilir. Ve şimdi pyro Dizilemeye başlama zamanı. Pyro dizilemenin ilk adımı, tahlil detaylarının bilgisayara girilmesidir.

Simpleks girişi altında, yeni girişi seçin ve tahlil tasarım yazılımı tarafından sağlanan ve SNP artı kontrol tabanları etrafındaki diziyi sağlayan kalite kontrol seçme dağıtım sırasına izin veren bir kimlik adı ve analiz edilecek sıra dahil olmak üzere tahlil bilgilerini girin. Son olarak, pigramınızın nasıl görünmesi gerektiğine dair bir görsel sağlamak için histogramları seçin. Şimdi bir ekran alıntısı koşusuna girme zamanı.

Ekran alıntısı çalıştırmaları ve genel sekmesi altında, bir çalışma adı girin ve çalışma için araç parametrelerini seçin. Kurulum sekmesi altında, tahlil girişini seçin ve plakanın üzerine tıklayıp sürükleyin. Tercih edilen tahlili tabağınıza girmek için, analiz için farklı kuyucukları etkisiz hale getirebileceğiniz tüm plakanın kullanılması gerekmediğini ve aynı plaka üzerinde birçok farklı tahlilin yapılabileceğini unutmamak önemlidir.

Görünüm sekmesini tıklatın ve sonra seçin. Koşmak. Bu sayfa, çalışma için gereken uygun nükleotid, enzim ve substrat hacimlerini listeler. Kullanmadan önce hem nükleotidi hem de kılcal damar ve reaktif uçlarını temizleyin.

Uçları suyla doldurun ve herhangi bir uç tıkanıklığı olup olmadığını kontrol etmek için ucun üstüne baskı uygulayın. Ucun altından su fışkırmazsa, suyu zorlamaya çalışmak için birkaç kez boşaltın ve yeniden doldurun. Veya uç tıkalı kalırsa uçları sonikleştirebilirsiniz.

Atın ve yeni ipuçları alın. Enzim ve substrat kullanımdan önce su ile yeniden süspanse edilmelidir. Çalkalanan hava kabarcıkları uç tıkanıklıklarına veya tutarsız dağıtıma neden olabilirse, kullanılmayan yeniden askıya alınmış enzim ve substrat eksi 20 santigrat derecede saklanabilir.

Bir mikro fuge tüpünde kılcal dağıtım uçları için ileride kullanmak üzere, nükleotidlerle bire bir seyreltme yapın ve P sekizi tamponlayın. Kullanmadan önce iyice karıştırın. Nükleotid ve reaktif uçlarını yazılımın önerdiği miktarlara göre uygun hacimlerle doldurun.

İçlerine hava kabarcıkları pipetlenmesini ve tıkanmalara neden olmasını önlemek için sıvıyı uçların yanlarından aşağı nazikçe dağıtın. Nükleotid dağıtım uçlarında herhangi bir hava kabarcığı olup olmadığını kontrol ettiğinizden emin olun. Herhangi bir hava kabarcığı varsa, hava kabarcıkları yüzeye çıkana kadar uçların kenarlarına hafifçe vurun veya temiz bir pipet ucuyla yerinden çıkarın.

Kartuşu doldurduktan sonra bir test plakası çalıştırın. Kartuşu pyro sıralama cihazına ve test plakasını 96 kuyulu plaka platformuna yerleştirin. Plakanın üzerine yapışkan bir film yerleştirmek, reaktif ve nükleotid dağıtımının kolayca görülmesini sağlar.

Ekranın sol tarafındaki enstrüman sekmesini seçin, ardından yönet'e tıklayın. Açılır menüden enstrümanı seçin. Test'e tıklayın, bir uyarı görünecektir.

Test plakasının cihaza yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol etmenizi istemek. Tamam'a tıklayın. Tamamlandıktan sonra, test plakasını çıkarın ve plakanın ortasında dört nükleotid, enzim ve substratı temsil eden altı kuyucuğun üzerinde sıvı noktalar bulunmalıdır.

Altıdan az küçük nokta varsa, bir tıkanıklık meydana gelmiştir ve uçlar kontrol edilmeli ve herhangi bir tıkanıklık olup olmadığı giderilmelidir. Plakayı pyro dizilimi 96 kuyulu plaka platformuna yerleştirin. Tüm kolları kapatın ve tek tek plaka üzerinde çalıştır'a tıklayın.

Enzim substratını çalıştırın ve nükleotidler önceden belirlenen sırayla dağıtılacaktır. Koşu, pyro sıralayıcı tarafından analiz edildikten sonra, koşuyu incelemenin zamanı geldi. Mavi kuyular geçen bir genotip ve piroyu temsil eder.

Portakal kuyuları insan müdahalesi gerektirir ve ilgilenilen kuyuya tıklanarak ve tahmin edilen histogram açılarak düzenlenebilir. Bir genotip geçilebilir, başarısız olabilir veya kontrol edilebilir, ayrıca genotipin kendisi de uygun şekilde değiştirilebilir. Bir kuyu düzenlendikten sonra, plaka haritasında koyu renkli bir daire görünecektir.

Negatif kontroller negatif olarak puanlanmalıdır. Negatif kuyucuklarda spesifik olmayan zirveler olabilir, ancak bu tipik olarak iç astarın döngüsünden kaynaklanır. Bu yüzden size insan genomiğinde bir polimorfizmi nasıl sıralayacağınızı gösterdik.

DNA Pyro dizilimi, çok çeşitli uygulamalara uyarlanabildiği için diğer dizileme prosedürlerine göre faydalıdır. Ayrıca, düşük konsantrasyon ve bozulmuş DNA dahil olmak üzere herhangi bir kaynaktan gelen DNA'yı işleyecek kadar sağlamdır. Bu prosedürü yaparken, iyi ve temiz bir PCR ürünü ile başlamayı unutmamak önemlidir.

Her tahlil için bir negatif kontrol ekleyin ve tüm reaktiflerinizin iyi olduğundan emin olun. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.