İnsan Blastoidlerinin Modellenmesi Blastosist Gelişimi ve İmplantasyonu için Protokol

İnsan embriyoları üzerine yapılan araştırmalar, düşük mevcudiyeti ve etik kaygıları ile sınırlıdır, bu nedenle erken insan gelişimini sadık bir şekilde kopyalayan bireysel modeller elde etmek, bilimsel ve tıbbi ilerlemeyi destekleyecektir. Bu tekniğin insan gelişimini tahmin etme yeteneği, blastosist hücresel tayini ve morfogenez dizilerini, gelişimsel sekansa ve hıza göre etkili bir şekilde çoğaltma yeteneğine bağlıdır ve bu modelleme, blastosist aşamasını gerçekten yansıtan hücrelerin oluşumunu sağlayacaktır. Gelecekte, insan blastoidleri terapötik hedefleri tanımlamak ve klinik öncesi modellemeye katkıda bulunmak, örneğin in vitro fertilizasyon ortamını iyileştirmek veya hormonal olmayan kontraseptifler geliştirmek için kullanılabilir.

Prosedürü gösterenler Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer ve Giovanni Sestini olacak. Başlamak için PXGL ortamını, N2B27 bazal ortamı, yıkama arabelleğini, PBS'yi ve toplama ortamını hazırlayın ve önceden ısıtın. Blastoid oluşturmak için MEF'leri hPSC süspansiyonundan hariç tutun.

MEF hariç tutmak için, altı delikli bir plakanın kuyucuğuna bir mililitre% 0.1 jelatin ekleyerek jelatin kaplı bir plaka hazırlayın. Plakaları 30 ila 90 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri hasat etmek için ortamı çıkarın ve hücreleri bir milimetre PBS ile yıkayın.

Altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 500 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Kolonilerin tek hücrelere ayrışmasını takip etmek için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin. Hücre ayrılma çözeltisini bir mililitre yıkama tamponu ile seyreltin.

Hücreleri plakadan beş ila 10 kez hafifçe pipetleyerek toplayın. Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri dört dakika boyunca 200 RCF'de döndürün.

Süpernatanı çıkarın ve hücreleri her bir kuyucukta 1,5 mililitre PXGL ortamında yeniden askıya alın. MEF dışlaması için jelatin kaplı plakalardaki hücreleri tohumlayın ve plakaları 60 ila 90 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Naif hücreler MEF dışlaması için tohumlandıktan sonra, PBS'yi MicroWells'ten çıkarın ve kuyucukları her MicroWell çipi için 200 mikrolitre bazal N2B27 ortamı ile dengeleyin ve 37 santigrat derecede 60 dakika boyunca inkübe edin.

Bağlanmamış naif hücreleri içeren süpernatantı toplayın. 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve hücreleri dört dakika boyunca 200 RCF'de döndürün. Medyayı atın ve hücreleri bir mililitre N2B27 bazal ortamda yeniden askıya alın.

Hücre sayma slaytlarını kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri dört dakika boyunca 200 RCF'de döndürün. Ortamı atın ve 50 mikrolitre başına 30.000 hücrelik bir hücre yoğunluğu elde etmek için 10 mikromolar Y27632 içeren uygun miktarda N2B27 ortamı ekleyin.

Ortamı dengeli MicroWell dizilerinden çıkarın ve 10 mikromolar Y27632 ile 25 mikrolitre N2B27 ortamı ekleyin. 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve hücrelerin MicroWell'in dibine düşmesine izin vermek için 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, 10 mikromolar Y27632 ile desteklenmiş 125 mikrolitre N2B27 ortamı ekleyin.

24 saat içinde, MicroWell çipinde naif hPSC'lerin agregaları gözlemlenecektir. PALY ortamını hazırlayarak blastoid oluşumunu başlatın. 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede önceden ısıtın.

Toplama ortamını çıkarın ve MicroWells'e 200 mikrolitre önceden ısıtılmış PALY ortamı ekleyin. Hücre kültürü plakasını 37 santigrat derecede hipoksik bir inkübatöre geri yerleştirin. Medya değişikliğini ilk gün tekrarlayın.

İkinci günde, PALY ortamını çıkarın ve LPA ve 10 mikromolar Y27632 ile desteklenmiş 200 mikrolitre N2B27 ortamı ekleyin. Üçüncü günde medya değişikliğini tekrarlayın. Tam blastoid oluşumu dördüncü günde gerçekleşir.

Daha önce açıklandığı gibi blastoid oluşumu için naif hPSC hücre süspansiyonu hazırlayın. Ortamı atın ve ortamın 100 mikrolitresi başına 70 hücrenin hücre yoğunluğunu elde etmek için 10 mikromolar Y27632 içeren uygun miktarda N2B27 ortamı ekleyin. Kuyucukların dibindeki hücreleri kümelemek için, plakayı oda sıcaklığında iki dakika boyunca 200 RCF'de santrifüj yapın.

Hipoksik kültür koşulları altında plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat içinde, kuyularda naif hPSC'lerin agregaları gözlenecektir. Kuyucuklara 100 mikrolitre taze hazırlanmış ve iki kez önceden ısıtılmış PALY ortamı ekleyin.

Hücre kültürü plakasını 37 santigrat derecede hipoksik bir inkübatöre geri yerleştirin. 24 saat sonra, ortamın yarısını atın ve 100 mikrolitre önceden ısıtılmış PALY ortamı ile değiştirin. Adımı dördüncü güne kadar tekrarlayın.

Daha önce açıklandığı gibi troposfer oluşumu için naif HPSC hücre süspansiyonunu hazırlayın. Naif HPSC'lerin agregaları 24 saat sonra oluştuktan sonra, erken trofektodermi temsil eden trofosferler oluşturmak için üç mikromolar SC144 ile desteklenmiş LIF'siz PALY ile agregasyon ortamını değiştirin. Olgun trofektodermi temsil eden trofosferler oluşturmak için, agregasyon ortamını iki mikromolar XMUMP1 ile desteklenmiş PALY ile değiştirin.

Ortamı günlük olarak yenileyin. Tam trofosfer oluşumu dördüncü günde gerçekleşir. Hücre durumlarını değerlendirmek için, blastoid ve trofosferlerden gelen transkriptomik verileri, implantasyon sonrası insan trofoblast kök hücreleri de dahil olmak üzere uygun kontrollerle karşılaştırın.

PXGL'de kültürlenen naif hPSC'ler, PALY indüksiyonundan 48 ila 72 saat sonra ortaya çıkan ve 96 saat içinde 150 ila 250 mikrometre çapa ulaşan toplanmış ve kavitlenmiş yapılardı. Morfometrik parametrelere ve üç soyun varlığına dayanarak, indüksiyon verimliliği% 70 ila% 80'e ulaştı Trofosferler, indüksiyondan sonraki 96 saat içinde% 50 ila% 60 verimlilikte oluşturuldu. Blastoid oluşumu, optimize edilmiş indüksiyon koşulları altında ticari olarak temin edilebilen ultra düşük ataşmanlı 96 delikli plakalarda başarılı olmuştur.

Tek hücreli RNA dizileme teknolojisi, blastoid hücre durumunu daha da karakterize etmek için kullanıldı. Hücreler, verilerin kümelenmesini ve görselleştirilmesini gerçekleştirmek için kullanılan parametrelerden bağımsız olarak, üç blastosist soyunun güvenle ayırt edilmesini sağlayan belirgin şekilde tekrarlanabilir şekilde farklı kümeleme profilleri görüntüler. 24 ila 60 saat arasında, PXGL pluripotent kök hücreler epiblastın ve trofektodermin analoglarını oluşturur.

Daha sonra 60 ila 96 saat arasında, polar trofektodermin ve ilkel endodermin analogları oluşur. Bu, blastosist içindeki spesifikasyon dizisidir, bu nedenle blastoidler soy spesifikasyonunun gelişimsel dizisini özetler. Blastoid veri setlerinin, gelişimin farklı aşamalarında embriyolardan izole edilen hücrelerin referans veri seti ile birleştirilmesi, blastoidlerden elde edilen hücrelerin% 97'sinin blastosist hücreleriyle kümelendiğini, ancak implantasyon sonrası embriyolardan gelen hücrelerle kümelenmediğini göstermiştir.

Bağımsız analiz, zamanla, kök hücrelerin beşinci gün ile 7.5. gün arasında insan embriyolarının hücreleriyle transkripsiyonel olarak eşleşen hücreler oluşturduğunu doğruladı. Bu gerçekten de insan blastosistinin oluştuğu gelişim aşamasıdır. Ayrıca, blastoidler içindeki hücrelerin% 95'inden fazlasının, blastosistlerin üç hücre soyuna uyan bir transkriptoma sahip olduğunu, hücrelerin% 3'ünün hedef dışı olduğunu ve implantasyon sonrası aşamalarla eşleştiğini doğruladılar.

Not olarak, ilk 2D kültürlerimizin de hedef hücrelerin yaklaşık% 5'ini oluşturduğunu gözlemledik. Eşdeğer gelişim aşaması, blastosist trofektodermi için CDX2 ve blastosist epiblastı için PRMD14 gibi spesifik belirteçlerin ekspresyon paternlerine bakarak da görselleştirilebilir. İlk PXGL kültürünün kalitesi kesinlikle çok önemlidir ve ilk agrega içindeki hücre sayısı da kritiktir ve MicroWells kullanılarak kontrol edilebilir.

24 saat sonra hücresel agreganın toplam büyüklüğü yaklaşık 50 ila 70 mikrometre olmalıdır. Faz full blastoidlerin verimli oluşumu, insan embriyosunun implantasyon ve implantasyon sonrası gelişim süreçlerini incelemenin yolunu açmaktadır.