Fare derisi yara iyileşmesinin tek hücreli transkriptomik veri kümesini analiz etmek için R, Seurat ve CellChat'i kullanma

Laboratuvarımızda, diferansiyel iyileşme sonuçlarının uzamsal zamansal hücresel dinamiklerini araştırmak için sistem biyolojisi ve biyoinformatik yaklaşımlarıyla tek hücreli ve uzamsal transkriptomik gibi yeni ortaya çıkan araçları kullanıyoruz. Son yıllarda, insanlarda ve fareler gibi model organizmalarda yara iyileşmesi çalışmalarında tek hücreli transkriptomiklerin hızlı bir şekilde benimsendiğini gördük. Tek hücreli veri setlerinin tam analizi, biyoinformatik konusunda çok az deneyimi olan veya hiç deneyimi olmayan tezgah bilim adamları için engelleyicidir. Bu, çoğu zaman tek hücreli veri kümelerinin yara iyileşmesi alanındaki bilim adamları tarafından yeterince kullanılmadığı anlamına gelir. Bu, biyoinformatik konusunda önceden deneyim sahibi olmadığını varsayan ilk kapsamlı protokoldür ve kullanıcıyı veri kümesinin indirilmesinden yara iyileşmesi araştırması bağlamında ilgili analizlerin çıktısına kadar götürür. Protokolümüz, yara iyileşmesi araştırmacılarının kendi tek hücreli veri setlerini daha kapsamlı bir şekilde analiz etmeleri ve halka açık veri setlerinden yeni içgörüler çıkarabilmeleri için bir şablon görevi görmelidir.

[Shalyn] Başlamak için, GSE204777 erişim numarasını kullanarak gen ifadesi omnibus deposundaki veri kümesi dosyalarına gidin. GSM6190913 başlıklı ilk veri kümesine tıklayın. GSM6190913 sayfasının en altına gidin ve FTP veya HTML bağlantılarını kullanarak listelenen üç dosyayı indirin. Bilgisayarın dosya gezginini kullanarak indirilen dosyaları b1 adlı dizine taşıyın ve çalışma dizininde bulunduğundan emin olun. İndirilen tek hücreli sıralama dosyaları için dizin yolu bilgilerini alın. Şimdi, tek hücreli sıralama dosyalarını çalışma ortamına yükleyin. Ardından, gen ekspresyonunu ve çoğullama HTO verilerini çalışan veri kümesinden ayırın. Beşten az hücrede ve 200'den az gene sahip hücrelerde tespit edilen genleri filtrelerken gen ekspresyon verilerini kullanarak bir Seurat nesnesi oluşturun. HTO verisi olmayan veri kümeleri için, aynı filtreleme parametreleriyle Seurat nesnesini oluşturun ve gen ekspresyonu testine geçin. Her hücredeki mitokondriyal gen yüzdesini hesaplayın ve bu değeri bir meta veri değişkeni olarak atayın. Tüm hücrelerde gen sayılarının, toplam RNA'nın ve mitokondriyal gen yüzdesinin dağılımını görselleştirin. Bir eşik kullanarak mitokondriyal içeriği %25'i aşan hücreleri çıkarın ve bu düşük kaliteli hücreleri filtreledikten sonra güncellenmiş dağılımları görselleştirin. SC ikili bulucu yöntemini kullanarak olası çiftleri tespit edin. Komutları kullanarak SC ikili bulucu ardışık düzenini çalıştırın ve elde edilen ikili puanlarını yeni bir meta veri değişkeni olarak atayın. Şimdi, ikili puanların tüm hücrelerdeki dağılımını görselleştirin. Çift puanı 0,25'in üzerinde olan tüm hücreleri kaldırın ve temizlenen Seurat nesnesini çalışma dizinine bir RDS dosyası olarak kaydedin. Veri normalleştirme, ölçeklendirme ve temel bileşen analizi gerçekleştirin. İlk 50 temel bileşendeki varyans katkısını görselleştirin. İlk 13 temel bileşeni ve 0,1 kümeleme çözünürlüğünü kullanarak hücreleri kümeleyin. İlk 13 temel bileşeni kullanarak tek tip manifold yaklaşımı ve projeksiyonu veya komşu analizinde UMAP azaltımı gerçekleştirin ve tohum numarasını 123 olarak ayarlayın. Şimdi, bir UMAP grafiğinde hücre kümelenmesini ve ardından bir UMAP grafiğinde yara zamanı ve uzay açıklamalarını görselleştirin. Ardından, hücre kümelerini yara zamanı ve uzay açıklamalarıyla ilişkilendiren bir tablo oluşturun. Tüm kümeler arasında diferansiyel olarak eksprese edilen genleri hesapladıktan sonra ana hücre tipi kimliklerini belirleyin ve elde edilen DEG listelerini çalışma dizininde sınırlandırılmış bir metin dosyası olarak kaydetmeden önce bir değişkene atayın. Şimdi, veri kümesi küme işaretçileri dosyasını bir elektronik tablo uygulamasında açın. Virgülü sınırlayıcı olarak ayarlamak için Metin İçe Aktarma Sihirbazı'nı kullanın ve gen adlarının otomatik olarak tarihlere dönüştürülmesini önlemek için gen adı sütunlarını metin olarak biçimlendirin. Bir elektronik tabloda, günlük iki kat değişiklik değerlerini azaltarak satırları sıralamak için ortalama günlük iki FC sütununu büyükten küçüğe doğru sıralayın ve ardından küme sütununu en küçükten en büyüğe doğru sıralayın. Satırları Seurat küme numaralarını artırarak sıralamak için, ortalama günlük iki FC sütununu yalnızca 2,5'ten büyük veya 2,5'e eşit değerleri içerecek şekilde filtreleyin ve ardından PCT 1 sütununu 0,4'ten büyük veya 0,4'e eşit değerleri içerecek şekilde filtreleyin. Ardından, PCT 2 sütununu 0,2'den küçük veya 0,2'ye eşit değerleri içerecek şekilde filtreleyin. Son olarak, P değeri ayarlanmış sütununu 0,01'den küçük veya 0,01'e eşit değerleri içerecek şekilde filtreleyin. Şimdi Enrichr web tabanlı zenginleştirme analiz aracını açın. Her küme için, diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin listesini ayrı bir Enrichr penceresine kopyalayın ve analiz et'e tıklayın. Ardından, analiz çıktısının üzerindeki hücre türleri sekmesine tıklayın ve seçilmiş üç hücre işaretçisi veritabanındaki ilk beş zenginleştirmeye odaklanın. Enrichr analizinden elde edilen en iyi zenginleştirmelere dayanarak, sekiz kümeye olası kimlikler atayın. İki ve altı kümeyi fibroblastlar etiketli tek bir açıklamada birleştirin ve bu açıklamaları hücre türleri adlı yeni bir meta veri değişkeni olarak atayın. Ardından, açıklamalı hücre tiplerini bir UMAP grafiği üzerinde görselleştirin ve kalın harflerle yazılmış üst küme işaretleyici genlerinin lokalizasyonunu bir dizi UMAP grafiği üzerinde görüntüleyin. Üst küme işaretleyicisini, orijinal küme numaralarına göre gruplandırılmış bir nokta grafiği üzerinde diferansiyel olarak ifade edilen genleri ve ardından en üstteki işaretleyici genleri, bu sefer açıklamalı hücre tiplerine göre gruplandırılmış bir nokta grafiğinde görselleştirin. Zaman serisi analizine hazırlanmak için uzamsal ek açıklamayı kaldırın ve veri kümesini basitleştirin. Yara süresi ve alanı meta verilerini, Yaralamadan Sonra Günler için DPW adlı yeni bir değişkene yeniden atayın. Yeni DPW zaman seyri gruplamalarını bir UMAP grafiği üzerinde görselleştirin ve her DPW grubu içindeki her türden hücre sayısını gösteren tablolar oluşturun. Daha sonra, iyileşme sırasında hücre tipi bileşimindeki nispi değişiklikleri değerlendirmek için hücre sayımlarını oranlara dönüştürün ve her hücre tipi içindeki her DPW kategorisinin oranını görselleştirin. Son olarak, her DPW grubundaki her hücre türünün oranını görselleştirin ve tüm ek açıklamaları ve filtreleri içeren son Seurat nesnesini bir RDS dosyası olarak çalışma dizinine kaydedin. Veri kümesindeki tüm hücreler, UMAP grafiğinde ana renk kodlu hücre türleri halinde ayrı ayrı kümelendi ve zenginleştirilmiş hücre türü imzalarına dayalı başarılı açıklamayı onayladı. Üst küme işaretleyici genlerinin yüksek ekspresyonu, UMAP grafiklerinde ilgili hücre tipi kümeleri içinde lokalize edildi. Nokta grafiği görselleştirmesi, küme işaretleyici genlerin en yüksek ekspresyon seviyelerinin, açıklamalı ana hücre tipleriyle sınırlı olduğunu doğruladı. Yığılmış çubuk grafiği, nötrofillerin ve makrofajların yaralanmadan sonraki ilk günde baskın olduğunu, fibroblastların, epitelyal ve endotel hücrelerinin ise daha sonraki zaman noktalarında daha yaygın hale geldiğini ve bilinen hücresel yara iyileşmesi kaskadını yansıttığını ortaya koydu.