Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe'deki mitokondriyal solunum zinciri proteinlerinin ekspresyon ve kompleks montajının analizi

Araştırmamızın kapsamı mitokondriyal protein translasyonudur ve mitokondriyal solunum zinciri kompleksinin translasyonunu ve montajını etkileyen mekanizmaları aydınlatmaya çalışıyoruz. Araştırmamız, shy1'in karmaşık dört infüzyonun montajına katılarak mitokondriyalin düzenli fonksiyonunun sürdürülebilirliğinde rol oynadığını buldu. Laboratuvarımız M=metotreksat infüzyonunun mekanizmasını araştıracaktır.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, Schizosaccharomyces pombe'nin bir hücre peletinin ıslak ağırlığını ölçün. Hücreleri sekiz mililitre S tamponunda yeniden süspanse edin. 10 milimolar nihai konsantrasyona Dithiothreitol ve bir milimolar için fenilmetilsülfonil florür ekleyin ve her iki reaktifin de taze hazırlandığından emin olun. Schizosaccharomyces pombe'nin hücre duvarını sindirmek için hücre süspansiyonuna litik enzimler ekleyin. Tüpü, spesifik litik enzim için önerilen süre boyunca 30 santigrat derecede bir çalkalayıcı üzerinde döndürün. Sferoplast oluşumunu gözlemlemek için mikroskop kullanın. Daha sonra sferoplastları peletlemek için numuneyi 1.000 G'de, 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Peletleri sekiz mililitre buz gibi soğuk S tamponunda tekrar süspanse edin. İki yıkamadan sonra, sferoplastları proteaz inhibitörleri içeren sekiz mililitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Karışımı, bir havaneli ve bir test tüpü içeren önceden soğutulmuş bir cam aşağı homojenizatöre aktarın. Sıkıca oturan havaneli ile yukarı ve aşağı yaklaşık 15 vuruş yaparak hücreleri mekanik olarak homojenize edin. Daha sonra zar kırılmasını kontrol etmek için sferoplastları mikroskop altında inceleyin. Şimdi homojenize süspansiyonu santrifüj tüplerine aktarın. Kırılmamış hücreleri ve kalıntıları topaklamak için 4 santigrat derecede 1.000 G'de beş dakika santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı, çekirdeği peletlemek için 4 santigrat derecede 3.000 G'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından süpernatanı taze santrifüj tüplerine aktarın. Mitokondriyi ve diğer organelleri peletlemek için 4 santigrat derecede 15 dakika boyunca 12.000 G'de santrifüjleyin, süpernatanı boşalttıktan sonra peleti bir mililitre buz gibi soğuk sorbitol EDTA paspas tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra mitokondriyi yıkamak için 4 santigrat derecede 12.000 G'de 15 dakika tekrar santrifüjleyin. Son peleti bir mililitre buz gibi soğuk sorbitol EDTA paspas tamponunda yeniden askıya alın. Daha sonra saflaştırılmış mitokondriyi gelecekteki deneyler için saklama tüplerine ayırın. SDS sayfasında, 40 mikrolitre mitokondriyal toplam proteine tampon yükleniyor. Karışımı belirtilen süre boyunca uygun sıcaklıkta inkübe ederek proteinleri denatüre eder. İmmün lekelemeden önce yaklaşık 20 mikrogram veya dört mikrolitre mitokondriyal proteini% 12'lik bir SDS sayfa jeline yükleyin. Numuneyi BN sayfasına hazırlamak için, önce santrifüjleme ile önceki alikotlardan pelet mitokondri. Mitokondriyi 200 mikrolitre üç XBN sayfa jel tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, iki mikrolitre 100 X fenilmetilsülfonil florür ve bir mikrolitre bir molar magnezyum klorür pipetleyin. 4 santigrat derecede 12.000 G'de 15 dakika tekrar santrifüjleyin. Mitokondri peletini hacimce %5 ağırlığında 160 mikrolitre digitorum içinde yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin, her 10 dakikada bir hafifçe karıştırın. Süspansiyonu 4 santigrat derecede 20.000 G'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Digitorum ile muamele edilmiş numuneye 80 mikrolitre üç XBN sayfalık numune tamponu ekleyin. Veya DDM ile muamele edilmiş numuneye 32 mikrolitre. Şimdi prekast yerli Bis-Tris jellerini %3 ila %12 gradyanla birleştirin. Doğal Poliakrilamid jel elektroforezi için işlenmiş protein örneklerini yüksek moleküler ağırlıklı protein belirteçleri ile birlikte yükleyin. Jeli 80 voltluk sabit bir voltajda ve altı miliamperlik akımda% 0.02 Kumasi G250 içeren katot tamponu kullanarak 30 dakika boyunca çalıştırın. Tamponu Kumasi içermeyen katot tamponu ile değiştirin ve boya cephesi jel dibine ulaşana kadar üç saat boyunca 10 miliamperde çalışmaya devam edin. Protein işaretleyicisini içeren jel şeridini kesin. İşaretleyiciyi Kumasi R250 tamponu ile 15 dakika boyayın. Ardından bantlar görünür hale gelene kadar lekeyi çıkarın. Dengelemek için jelin kalan kısmını 30 dakika boyunca BN sayfa transfer tamponuna daldırın. 0.45 mikrometre PVDF leke membranını metanol ile durulayın ve transfer tamponunda 10 dakika dengeleyin. İki saat boyunca 300 miliamperlik sabit bir akım kullanarak proteinleri jelden PVDF membranına aktarın. Kumasi boyasını çıkarmak için PVDF membranını metanol ile durulayın. Daha sonra zarı% 5 yağsız süt içeren TBS bloke edici tamponda 25 santigrat derecede bir saat inkübe edin. PVDF membranını, Schizosaccharomyces pombe mitokondriyal solunum zinciri komplekslerine karşı belirtilen primer antikorlarla inkübe edin. Dört santigrat derecede bir gece inkübasyondan sonra, zarı TBST tamponu kullanarak yıkayın. Daha sonra zarı ikincil antikorda 25 santigrat derecede bir saat boyunca bir ila 10.000 seyreltmede inkübe edin. Membranı TBST tamponu ile yıkadıktan sonra, immünoleke sonuçlarını görselleştirmek için PVDF membranını açığa çıkarın ve tarayın. Shif1 geninin silinmesi, mitokondriyal DNA kodlu solunum zinciri proteinleri Cob1, Cox1, Cox2, Cox3 ve Atp6'nın kararlı durum seviyelerinde belirgin bir azalmaya yol açtı. Mavi yerel sayfa analizi, Delta shy1 hücrelerinde DG Çözündürülmüş solunum zinciri süper kompleksleri 3242 ve 324'ün bolluğunun azaldığını gösterdi. Süper komplekslerin seviyeleri 32.=, ve 55N etkilenmeden kaldı. DDM çözündürülmüş çap kompleksi 3 seviyesi Delta shy1 suşunda değişmedi.