Genetik Olarak Kodlanmış Biyosensör Tasarım Alanının Verimli Örneklenmesi, Deney Tasarımı ve Otomasyon İş Akışı ile Etkinleştirildi

Biyosensörlerin biyoteknolojik uygulamalara yönelik geliştirilmesi ve optimizasyonu araştırmamızın kapsamıdır. Spesifik olarak, genetik elemanlarının modülasyonu yoluyla biyosensörlerin nasıl optimize edileceğini ve tasarlanacağını anlamayı amaçlıyoruz. Klasik promotör mühendisliği ve floresan aktive edici hücre sıralaması gibi sezgiye dayalı tasarım seçenekleri, biyosensörlerin karakterizasyonunda ve tasarımında rutin olarak uygulanan tekniklerdir.

Deney metodolojilerinin tasarımı, genetik devre tasarımında henüz yaygın olarak benimsenmemiştir. Bu protokol aracılığıyla, genetik devre ve biyosensör tasarımında bu tür tekniklerin alımını artırmayı amaçlıyoruz. Başlamak için, teorik kitaplık boyutunu belirleyin ve %95'ten fazla kitaplık kapsamı sağlamak için gereken bireysel varyantların sayısını hesaplayın.

Taranacak koloni sayısına göre gerekli antibiyotik takviyeli lizojeni suyu ortamı hacmini hesaplayın. Sıvı işleme yazılımını açın ve MTP sıvı transfer programının yanındaki çalıştır'a tıklayın. Hazırlanan ortamı ilgili rezervuar konumuna yerleştirin.

Ardından güverteyi düzene göre boş mikrotitre plakaları ile doldurun. Programı 200 mikrolitre ortam dağıtacak şekilde ayarlayın. Programın başladığını onaylamak için Tamam'ı tıklayın.

Şimdi, doldurulmuş mikrotitre plaka kuyularını bir koloni seçici platformuna aktarın ve plazmit varyant kitaplığı DNA'sı ile dönüştürülmüş Pseudomonas putida'nın kare burgu plakalarını açın ve koloni seçici platformuna aktarın. Önceden doldurulmuş her kuyucuğu dönüştürücü plakalardan tek bir koloni ile aşılamak için koloni seçiciyi kullanın. Aşılanmış plakaları tekrar kapatın ve çevrimdışı çalkalama inkübatörüne aktarın.

İnkübasyondan sonra, büyütülmüş plakaları sıvı işleme platformuna geri koyun ve mührü açın. MTP protokolüne gliserol ekle'nin yanındaki çalıştır'ı tıklayın. Ekrandaki plaka düzeninin sıvı işleme yuvasınınkiyle eşleştiğinden emin olun.

Ve sırayla, protokolün çalışması için tamam'a tıklayın. Bittiğinde, plakaları kapatın ve beş dakika boyunca dakikada 800 devirde çevrimdışı çalkalayan bir inkübatörde kısaca karıştırın. Plakaları barkodlayın ve ihtiyaç duyulana kadar 80 santigrat derecede saklayın.

Derin kuyu blokları için gerekli antibiyotik takviyeli ortam hacmini hesaplayın. DWB sıvı transfer programının yanındaki çalıştır'a tıklayın. Ortamın doğru hazneye eklendiğinden emin olun.

Boş derin kuyu blokları doğru yerleşim konumlarındadır ve yeterli miktarda uç mevcuttur. Programı 495 mikrolitre ortam dağıtacak şekilde ayarlayın. Hazır olduğunuzda, programı başlatmak için sırayla tamam'a tıklayın.

Şimdi, doldurulmuş derin kuyu bloklarını nefes alabilen membranla kapatın ve 4 santigrat derecede geçici depoya aktarın. Ardından, çözülmüş MTP programından aşının yanındaki çalıştır'a tıklayın. MTP kriyo stoklarının ve dolgu derin kuyu bloklarının yerleşim başına platforma aktarıldığından ve yeterli ucun yüklendiğinden emin olun.

Sırayla, başlatmak için tamam'ı tıklayın. Program bittiğinde, gece boyunca aşılanmış derin kuyu bloklarını nefes alabilen membranla kapatın. Bunları 30 santigrat derecede, dakikada 800 devirde ve %75 nemde 16 saat boyunca ayarlanmış çevrimdışı bir plaka çalkalayıcı inkübatörüne aktarın.

Cryostock mikrotitre plakalarını yeniden kapatın, karıştırın ve 80 santigrat derece dondurucuya geri koyun. Şimdi, taranacak gece boyunca derin kuyu blokları için çeşitli efektör ve antibiyotik konsantrasyonları ile desteklenmiş gerekli ortam hacmini hesaplayın. DWB sıvı transfer programının yanındaki çalıştır'a tıklayın.

Ardından efektör takviyeli ortam rezervuarlarının doğru yerleştirildiğinden emin olun. Sıvı işleyici platformuna boş derin kuyu blokları ekleyin. Yeterli ipucu mevcut olduğunda, tahlil derin kuyu blokları oluşturmak üzere protokolü başlatmak için sırayla tamam'a tıklayın.

Doldurduktan sonra, tahlil derin kuyu bloklarını nefes alabilen membran ile kapatın. Sıvı taşıyıcıyı boş plakalarla doldurun. Tüm tahlil blokları dolana kadar aşılamayı tekrarlayın.

Ardından, tahlil DWB programına transferin yanındaki çalıştır'a tıklayın. Efektör takviyeli ortama sahip mühürsüz tahlil derin kuyulu bloklar doğru bir şekilde yerleştirildikten sonra, düzen başına büyütülmüş P.putida içeren gece boyunca derin kuyulu blokları aktarın ve açın. Protokolü başlatmak için sırayla tamam'a tıklayın.

Program bittiğinde, transfer tahlil plakalarını çevrimdışı inkübatöre kapatın. Aşılamadan sonra gece boyunca derin kuyu bloklarını atın. Ardından, derin kuyu bloklarını bir santrifüje aktarın.

Pelet hücreleri 4.000 G'de buz kontrollü bir rotorda 18 santigrat derecede beş dakika boyunca. Süpernatanı attıktan sonra, santrifüj bloklarını sıvı işleme platformuna yerleştirin. Taranacak derin kuyu bloklarının sayısına bağlı olarak gereken PBS'nin bir katı hacmini hesaplayın.

PBS yeniden süspansiyon DWB programını kuran tahlilin yanındaki çalıştır'a tıklayın ve dağıtım hacmini 500 mikrolitreye ayarlayın. Ardından PBS'nin doğru rezervuara eklendiğinden emin olun ve santrifüjlenmiş plakaları düzene göre sıralayın. Uç kullanılabilirliğini onayladıktan sonra programı başlatmak için tamam'a tıklayın.

Yeniden askıya alınan derin kuyu bloklarını sıvı işleyiciden yeniden kapatın ve çıkarın. Peletlerin tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olmak için plakanın alt tarafını kontrol edin. Tahlil kurulum hücrelerinin ve PBS sürümü MTP programının yanındaki çalıştır'a tıklayın.

Ardından, yeniden süspanse edilmiş derin kuyu bloklarını düzene göre sıvı işleyiciye aktarın. Boş mikrotitre plakalarını düzene göre yükleyin ve tamam'a tıklamadan önce dağıtım hacmini 200 mikrolitreye ayarlayın. Doldurulmuş mikrotitre plakalarını çevrimdışı çok modlu bir plaka okuyucuya aktarın ve bağıl floresan ve OD600'ü ölçün.

5.000 promotör varyantının otomatik olarak taranması, 3,6 kattan fazla aktivasyon gösteren en iyi adayları belirledi. Duyarlılık dağılımını görselleştirmek ve sağlam adayları belirlemek için 100 benzersiz varyant için EC 50 değerleri çizildi. EC 50 değerleri, 226 zenginleştirilmiş varyant için hesaplandı ve duyarlılık ölçekli bir kitaplık oluşturmak için Lin-log dönüşümü kullanılarak sıralandı.

Dört modülden 1, 0 ve 1 seviye varyans kullanılarak kesin bir tarama tasarımı oluşturuldu. Taşıma, Düzenleyici, P-çıkışı ve Çıkış Ribozom Bağlama Bölgesi model profilleri, dört modülün ekspresyon seviyelerindeki değişikliklerin EC 50 ve Hill katsayısını doğrusal olmayan bir şekilde nasıl etkilediğini ortaya çıkardı. RBS-Out ile optimal ekspresyon kombinasyonlarının belirlenmesi, hem hassasiyet hem de eğim üzerinde güçlü bir pozitif etki göstermek.

İdeal modül güçlerini içeren küresel olarak optimize edilmiş biyosensör varyantı, hem ebeveyn hem de DSD için optimize edilmiş versiyonlarla karşılaştırıldığında gelişmiş hassasiyet ve Hill katsayısı gösterdi.