Name: Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 24 s
Description: Öğrenin, tütün yapraklarında geçici protein ifadesi için deneysel tasarım yaklaşımını. Bu yöntem, monoklonal antikor üretiminde parametre etkileşimlerini belirleyerek verimliliği artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar bu çalışmada kullanılan tütün bitkileri yetiştirilmesi için ppam bitki ekspresyon vektörü ve İbrahim Al Amed sağlamak için Dr Thomas Rademacher minnettarız. Biz el yazması düzenleme ile yaptığı yardım için Dr Richard M. Twyman teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Avrupa Araştırma Konseyi İleri Hibe &quot;Future-Pharma&quot; tarafından finanse edildi, öneri sayısı 269.110 ve Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer Gelecek Vakfı).

<ol><li>Fischer, R., Emans, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+farming+of+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+research%22%5BJournal%5D)">Molecular farming of pharmaceutical proteins.</a> Transgenic research. 9, 277-299 (2000).</li>
<li>Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosafety+of+molecular+farming+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22AgBiotechNet%22%5BJournal%5D)">The biosafety of molecular farming in plants.</a> AgBiotechNet. 5, 9 (2003).</li>
<li>Shoji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plant-based+system+for+rapid+production+of+influenza+vaccine+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Influenza+Other+Resp%22%5BJournal%5D)">A plant-based system for rapid production of influenza vaccine antigens.</a> Influenza Other Resp. 6, 204-210 (2012).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+Its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe In. 21, 1015-1026 (2008).</li>
<li>Berg, R. H., Beachy, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+applications+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein applications in plants.</a> Method Cell Biol. 85, 153 (2008).</li>
<li>Chung, S. M., Vaidya, M., Tzfira, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+is+not+alone%3A+gene+transfer+to+plants+by+viruses+and+other+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+plant+science%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria.</a> Trends in plant science. 11, 1-4 (2006).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).</li>
<li>Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+transient+Agrobacterium-mediated+gene+expression+system+in+leaves+of+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana.</a> Acta Biochimica Polonica. 53, 289-298 (2006).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+heterogeneous+biomass%3A+Overcoming+the+hurdles+in+model+building%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Processing heterogeneous biomass: Overcoming the hurdles in model building.</a> Bioengineered. 4, (2013).</li>
<li>Fischer, R., Schillberg, S., Hellwig, S., Twyman, R. M., Drossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMP+issues+for+recombinant+plant-derived+pharmaceutical+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins.</a> Biotechnol Adv. 30, 434-439 (2012).</li>
<li>Daniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-at-a-time+plans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Statistical+Association%22%5BJournal%5D)">One-at-a-time plans.</a> Journal of the American Statistical Association. 68, 353-360 (1973).</li>
<li>Czitrom, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Factor-at-a-Time+versus+Designed+Experiments+The+American+Statistician%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">One-Factor-at-a-Time versus Designed Experiments The American Statistician.</a> 53, 6 (1999).</li>
<li>Anderson, M. J., Kraber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keys+to+successful+designed+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ASQ+-+The+global+voice+of+quality%22%5BJournal%5D)">Keys to successful designed experiments.</a> ASQ - The global voice of quality. 6, 6 (1999).</li>
<li>Montgomery, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMontgomery%2C+DC+%22Design+and+Analysis+of+Experiments%22">Design and Analysis of Experiments</a>. , John Wiley & Sons Inc. (2007).</li>
<li>Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMyers%2C+RH+%22Response+Surface+Methodology%3A+Process+and+Product+Optimization+Using+Designed+Experiments%22">Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments</a>. , Wiley. (2009).</li>
<li>Piepel, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programs+for+generating+extreme+vertices+and+centroids+of+linearly+constrained+experimental+regions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Qual+Technol%22%5BJournal%5D)">Programs for generating extreme vertices and centroids of linearly constrained experimental regions.</a> J Qual Technol. 20, 15 (1988).</li>
<li>FDA. , U.S. Department of Health and Human Services. Rockville, MD, USA. (2009).</li>
<li>Shivhare, M., McCreath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Considerations+for+DoE+Implementation+in+Quality+By+Design%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Practical Considerations for DoE Implementation in Quality By Design.</a> BioProcess International. 8, 9 (2010).</li>
<li>Buyel, J. F., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+models+for+transient+protein+expression+in+tobacco+%28Nicotiana+tabacum+L.%29+can+optimize+process+time%2C+yield%2C+and+downstream+costs%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs.</a> Biotechnology and bioengineering. 109, 2575-2588 (2012).</li>
<li>Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+models+for+the+accumulation+of+a+fluorescent+marker+protein+in+tobacco+leaves+according+to+the+promoter%2F5%27UTR+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination.</a> Biotechnology and bioengineering. 110, 471-482 (2013).</li>
<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22DOE+Simplified%3A+Practical+Tools+for+Effective+Experimentation%22">DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation</a>. , Productivity Inc. (2000).</li>
<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+MJ+%22Response+Surface+Methods+Simplified%22">Response Surface Methods Simplified</a>. , Productivity Press. (2005).</li>
<li>De Gryze, S., Langhans, I., Vandebroek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+correct+intervals+for+prediction%3A+A+tutorial+on+tolerance+intervals+for+ordinary+least-squares+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometr+Intell+Lab%22%5BJournal%5D)">Using the correct intervals for prediction: A tutorial on tolerance intervals for ordinary least-squares regression.</a> Chemometr Intell Lab. 87, 147-154 (2007).</li>
<li> Plasmid DNA purification User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).</li>
<li> PCR clean-up Gel extraction User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).</li>
<li>Quick Ligation Protocol. 4, NewEnglandBiolabs. Ipswich. (2009).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Efficiency+Transformation+of+Escherichia-Coli+with+Plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High-Efficiency Transformation of Escherichia-Coli with Plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li>
<li>Main, G. D., Reynolds, S., Gartland, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+protocols+for+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Electroporation protocols for Agrobacterium.</a> Methods in Molecular Biology. 44, 405-412 (1995).</li>
<li>Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vienna+RNA+websuite%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The Vienna RNA websuite.</a> Nucleic acids research. 36, 70-74 (2008).</li>
<li>Howell, S., Kenmore, M., Kirkland, M., Badley, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+immobilization+of+an+antibody+fragment+to+a+carboxymethylated+dextran-linked+biosensor+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Recognit%22%5BJournal%5D)">High-density immobilization of an antibody fragment to a carboxymethylated dextran-linked biosensor surface.</a> J Mol Recognit. 11, 200-203 (1998).</li>
<li>Newcombe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+biosensor+assay+to+quantify+polyclonal+IgG+in+ovine+serum+used+for+the+production+of+biotherapeutic+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a biosensor assay to quantify polyclonal IgG in ovine serum used for the production of biotherapeutic antibody fragments.</a> Process Biochem. 41, 842-847 (2006).</li>
<li>Peixoto, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+Variable+Selection+in+Polynomial+Regression-Models%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Stat%22%5BJournal%5D)">Hierarchical Variable Selection in Polynomial Regression-Models.</a> Am Stat. 41, 311-313 (1987).</li>
<li>Peixoto, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Property+of+Well-Formulated+Polynomial+Regression-Models%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Stat%22%5BJournal%5D)">A Property of Well-Formulated Polynomial Regression-Models.</a> Am Stat. 44, 26-30 (1990).</li>
<li>Sanders, P. R., Winter, J. A., Barnason, A. R., Rogers, S. G., Fraley, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cauliflower+mosaic+virus+35S+and+nopaline+synthase+promoters+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants.</a> Nucleic acids research. 15, 1543-1558 (1987).</li>
<li>Ma, J. K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+Assembly+of+Secretory+Antibodies+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation and Assembly of Secretory Antibodies in Plants.</a> Science. 268, 716-719 (1995).</li>
<li>Wycoff, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+IgA+antibodies+from+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Design%22%5BJournal%5D)">Secretory IgA antibodies from plants.</a> Curr Pharm Design. 11, 2429-2437 (2005).</li>
<li>Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+measure+and+predict+the+molar+absorption+coefficient+of+a+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein.</a> Protein Sci. 4, 2411-2423 (1995).</li>
</ol>

Yayın ücreti kısmen el yazması veya içeriğinin herhangi bir sorumlu hazırlanmasında dahil rol almayan şirketlerin Statease, Inc (ABD) ve Statcon (Almanya), sponsor oldu.

Kaynaklar genellikle kıt ve pahalı olduğu için her deneme dikkatli bir planlama gerektirir. Planlama aşamasında (örneğin tüm önemli faktör etkileşimleri kapsamaz bir baz model seçerek) esnasında hataları büyük ölçüde çıkan modellerin tahmin gücünü azaltmak ve böylece tüm deney devalüasyon olabilir, çünkü bu DoE stratejileri için özellikle doğrudur. Ancak, bu hataları kolayca temel prosedürleri takip ederek önlenebilir. DoE planlama sırasında Hususlar İlk ol...

Bitkiler büyümeye ucuzdur çünkü bitkilerde biofarmasötik proteinlerin üretimi avantajlıdır, platformu sadece daha fazla büyüyen bitkiler tarafından büyütülüyor olabilir, ve insan patojenler 1,2 çoğaltmak mümkün değildir. DNA teslimat ve arıtılmış bir ürün teslimat noktası arasındaki süre yaşındaki az 2 ay 3 azaltılır, çünkü Agrobacterium tumefaciens ile yaprakların infiltrasyonu örneğin göre geçici sentezleme stratejileri, ek faydalar sağlar. Geçici sentezleme aynı zamanda zarar fonksiyon-mutantları tamamlamak için veya protein etkileşimlerini incelemek 4-6 etme kabiliyetleri açısından test etmek için genlerin fonksiyonel analiz için, örneğin kullanılır. Bununla birlikte, geçici ekspresyon düzeyi transjenik bitkilerde 7-9 ifade seviyelerinde daha büyük partiden partiye farklılıklar gösterir eğilimindedir. Bu biyofarmasötik üretim süreçleri geçici ifade wi göre olasılığını azaltıruyarlık bir kritik kalite nitelik ve risk değerlendirmesi 10 tabi olduğu için iyi üretim uygulamaları (GMP) kapsamında onaylanmış olacak. Böyle bir varyasyon da araştırmacılar araştırmak niyetinde herhangi etkileşimleri maskeleyebilir. Bu nedenle, bitkiler geçici ekspresyon düzeylerini etkileyen ve yüksek kaliteli bir nicel öngörü modeli oluşturmak için önemli faktörleri belirlemek için yola çıktı. Tek-faktör-at-a-time (OFAT) yaklaşım, genellikle bir deney 11 sonucuna belirli parametreler (faktörler) etkisi (etkisi) (tepki) karakterize etmek için kullanılır. Bir soruşturma (deney) sırasında bireysel testler (ishal) (tasarım alanı) test edilir faktörler tarafından yayılmış potansiyel alan boyunca bir dize inci gibi hizalanmış olacaktır çünkü ancak bu suboptimaldir. Tasarım alanı ve deneyden elde edilen bilgilerin dolayısıyla derecesi kapsamıdüşük, Şekil 1A, 12 &#39;de gösterildiği gibi. Şekil 1B 13 gösterildiği gibi Dahası, farklı faktörlerin (faktör etkileşimleri) arasında karşılıklı bağımlılık, kötü modeller ve / veya yanlış optima tahmin sonuçlanan gizli kalabilir. Yukarıda tarif edilen dezavantajları birden fazla faktör iki çalışan 14 arasında değişmiştir olduğunu, yani bir denemenin çalışır tasarım alanı boyunca daha eşit bir şekilde dağılmış olduğu deneyde (DOE) yaklaşımı bir tasarım kullanılarak önlenebilir. Faktörler (faktöryel tasarımlar) ve yanıtları faktör etkilerinin kantitatif (yanıt yüzey yöntemleri, RSM s) 15 tarama karışımları için özel tasarımları vardır. Ayrıca, RSMS merkezi kompozit tasarım olarak fark edilebilir ama aynı zamanda ishal seçimi için farklı kriterler uygulayabilirsiniz özel yazılımı kullanılarak etkili bir şekilde gerçekleşebilir. Örneğin, bu şekilde adlandırılan D-optimality kriter IV-optimalite kriter tasarım alanı 15,16 boyunca düşük tahmin varyansını elde çalışır seçer oysa bu yüzden, elde edilen modelin katsayıları hatayı en aza indirmek için çalışır seçecektir. Biz burada açıklamak RSM bitkilerde geçici protein ifade hassas kantitatif verir, ancak kolayca (5-8 ~) çeşitli içeren herhangi bir sistem transfer edilebilir sayısal faktörler (örneğin sıcaklık, zaman, konsantrasyon) ve birkaç (~ 2 - 4) mekanik bir açıklama modeli kullanılamaz veya çok karmaşık kategorik faktörler (örneğin organizatörü, renkli) olan. DoE yaklaşım tarımsal bilimler kökenli ama bu güvenilir veri elde etmek için gerekli çalışan sayısını azaltmak ve karmaşık işlemler için açıklayıcı modeller üretmek için yararlı olan herhangi bir duruma devredilemez çünkü diğer alanlara yayıldı. Bu da için &quot;Rehberlik Doe dahil yol açmıştırSanayi, Beşeri İlaçların (İSK) 17 Ruhsatlandırma Teknik Gereksinimleri Uyumu Uluslararası Konferansı tarafından yayınlanan S8 (R2) İlaç Geliştirme &quot;. DoE artık bilimsel araştırma ve sanayi 18 yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bakım sırasında alınmalıdır çoklu lineer regresyon modeli (baz model) için uygunsuz bir polinom derecesi seçerek çünkü planlama ve deney yürütme doğru tüm faktör etkilerini modellemek için ek çalışmalar için bir ihtiyaç tanıtabilirsiniz. Ayrıca, bozuk veya eksik veriler yanlış modeller ve kusurlu oluşturmak tahminler, ve hatta protokol ve tartışma bölümlerinde 18 anlatıldığı gibi herhangi bir model kurma girişimi engelleyebilir. protokol bölümünde, başlangıçta RSM-tabanlı bir deney için en önemli planlama adımları belirlemek ve daha sonra DOE dayalı tasarım açıklayacağız yazılım DesignExpert v8.1. Fakat benzer tasarımlar diğer yazılım includi ile inşa edilebilirng JMP, MODDE ve İSTATİKSEL. Deneysel prosedürler veri analizi ve değerlendirilmesi için talimatlar tarafından takip edilmektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51216/51216fig1.jpg" /> Şekil 1. OFAT ve DoE. A&#39;nın karşılaştırılması. Bir deneyde (siyah, kırmızı ve mavi daireler) bir süre (OFAT) az bir faktör Sıralı varyasyon tasarım alanı (taralı bölgeler) düşük bir kapsama alanı sağlar. Buna karşılık, deney (DOE) stratejisi (yeşil daireler) tasarımını kullanarak aynı anda birden fazla faktörü varyasyon kapsamını ve elde edilen modeller. B böylece hassas artırır. Önyargılı tasarım alanı kapsama OFAT deneyler (siyah daireler) aynı zamanda, optimum işletme bölgeleri (kırmızı) belirlemek ve alt-optimal çözümleri (büyük siyah daire) tahmin başarısız demektir oysa DoE şires (siyah yıldız) tercih koşulları (büyük siyah yıldız) tanımlamak için daha olasıdır.

<table><tbody><tr><td>Tasarım Uzmanı (R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.DoE</td> <td>yazılımı</td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8952.2</td><td>Ortam bileşeni</td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2363.2</td><td>Ortam bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>Ortam bileşeni</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K029.2</td><td>Antibiyotik</td></tr><tr><td>Agar-Agar</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5210.2</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>Escherichia coli K12 DH5a</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>18263-012</td><td>Mikroorganizma</td></tr><tr><td>pPAM</td><td>GenBank</td><td>AY027531</td><td>Klonlama/ekspresyon vektörü; &nbsp;</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plazmid&nbsp;</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740588.250</td><td>Plazmid DNA izolasyon kiti</td></tr><tr><td>NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme</td><td>MACHEREY-NAGEL GmbH</td><td>740609.250</td><td>Plazmid DNA saflaştırma kiti</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>n.a.Spektrofotometre</td><td></td></tr> <tr><td>NcoI</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>R3193L</td><td>Kısıtlamaendonükleaz</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R3101L</td><td>Kısıtlamaendonükleaz</td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>R0558L</td><td>Kısıtlamaendonükleaz</td></tr><tr><td>NEB 4</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>B7004S</td><td>Kısıtlamaendonükleaz tamponu</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>Ortam bileşeni</td></tr><tr><td>Disodyum tetraborat</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4403.3</td><td>Ortam bileşeni</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8040.2</td><td>Ortam bileşeni</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6352.4</td><td>Ortam bileşeni</td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A512.1</td><td>Renk göstergesi</td></tr><tr><td>Ksilen siyanol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A513.1</td><td>Renk göstergesi</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>7530.2</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Cell</td><td>BioRad</td><td>170-4406</td><td>Jel elektroforez odası</td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens suşu GV3101:pMP90RK</td><td>DSMZ</td><td>12365</td><td>Mikroorganizma</td></tr><tr><td>Electroporator 2510</td><td>Eppendorf</td><td>4307000.658</td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>Sığır eti özü</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X975.2</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2365.2</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.2</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>0261.3</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>Karbenisilin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6344.2</td><td>Antibiyotik</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>T832.3</td><td>Antibiyotik</td></tr><tr><td>Rifampisin</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4163.2</td><td>Antibiyotik</td></tr><tr><td>FWD astar</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.CCT</td> <td>CAG GAA GAG CAA TAC</td></tr><tr><td>REV astar</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>n.a.CCA</td> <td>AAG CGA GTA CAC AAC</td></tr><tr><td>2720 Termal döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>4359659</td><td>Thermocycler</td></tr><tr><td>RNAfold web sunucusu</td><td>Viyana Üniversitesi</td><td>n.a.Software</td><td></td></tr> <tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>Gübre</td></tr><tr><td>Grodan Taşyünü Küpleri 10 x10 cm</td><td>Grodan</td><td>n.a.Taşyünü</td> <td>blok</td></tr><tr><td>Sera</td> n.a.n.a.Bitki <td></td><td></td><td>yetiştiriciliği için</td></tr><tr><td>Phytotron</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.Bitki</td> <td>yetiştiriciliği için</td></tr><tr><td>Omnifix-F Solo</td><td>B. Braun</td><td>6064204</td><td>Şırınga</td></tr><tr><td>Murashige ve Skoog tuzları</td><td>Duchefa</td><td>M 0222.0010</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6780.2</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>Asetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406-5G</td><td>Fitohormon analogu</td></tr><tr><td>&nbsp; BioPhotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td>6132 000.008</td><td>Fotometre</td></tr><tr><td>Osram soğuk beyaz 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>Işık kaynağı</td></tr><tr><td>Disodyum fosfat</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4984.3</td><td>Ortam bileşeni</td></tr><tr><td>Santrifüj 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>Santrifüj</td></tr><tr><td>Forma -86C ULT dondurucu</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>Dondurucu</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>Floresan plaka okuyucu</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>n.a.SPR</td> <td>cihazı</td></tr><tr><td>Protein A</td><td>Life Technologies</td><td>10-1006</td><td>Antikor bağlayıcı protein</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>Medya bileşeni</td></tr><tr><td>2G12 antikoru</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>Referans antikoru</td></tr></tbody></table>

bir vaka Çalışması olarak tütün geçici protein expression: deneyler yaklaşımı tasarım kullanma karmaşık sistemler karakterizasyonu

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Bitkiler düşük maliyet, ölçeklenebilirlik ve güvenlik dahil biyofarmösetiklerinin üretimi için birden çok yarar sağlar. Geçici sentezleme, kısa geliştirme ve üretim kez ek bir avantaj sunar, ancak ekspresyon seviyeleri böylece iyi üretim uygulamaları bağlamında düzenleyici endişelere yol açan gruplar arasında önemli ölçüde değişebilir. Biz böyle partiler arasındaki ifade değişkenliğine ifadesi sırasında düzenleyici ifade yapı elemanları, bitki büyüme ve gelişme parametreleri ve inkübasyon koşulları gibi önemli faktörlerin etkisini belirlemek için deneyler (DOE) yaklaşımın bir tasarım kullanılmış. Bu model, anti-HIV monoklonal antikoru (2G12) ve bir flüoresan işaret proteini (DsRed) ifade eden bitkiler test edilmiştir. Biz modelin bazı özellikleri seçmek için gerekçe tartışmak ve potansiyel sınırlamaları belirlemek. Genel yaklaşım kolayca diğer sorunlara transfer edilebilir çünkü bu model ilkelerigeniş yeniden uygulanabilir: küçük modüller, optimum deney kombinasyonlar Yazılım destekli kurulum ve adım adım tasarım büyütme içine ilk sorunu bölerek bilgi-tabanlı parametre seçimi, karmaşıklığı azaltma. Bu nedenle, yöntem, sadece bitkilerde protein ekspresyonu karakterize etmek için değil, aynı zamanda mekanik bir açıklama eksik diğer karmaşık sistemlerin araştırılması için yararlıdır. Parametreler arasındaki birleştiricisi tarif akıllı denklem diğer sistemler için karmaşık mekanik modelleri oluşturmak için kullanılabilir.

Farklı destekleyiciler ve 5&#39;UTRs kullanarak geçici ifadesi sırasında DsRed birikimi için bir açıklayıcı bir model Yaprak ekstreleri içinde DsRed floresan rekombinant protein ekspresyon seviyesini gösterir ve bu nedenle DoE stratejisinde tepki olarak kullanılmıştır kullanılmıştır. Alakalı olarak en az algılanabilir bir fark 20 ug / ml oldu ve sistemin tahmin edilen standart sapma ilk deneylere göre 8 ug / ml idi. Geçici ifade modele dahil faktörler literatür verileri ile ...

Bu bitkilerde monoklonal antikorlar ve raportör proteinlerin geçici transgen ifadesi üzerindeki düzenleyici elemanlar, bitki büyüme ve gelişme parametreleri ve inkübasyon koşullarının etkisini belirlemek ve modellemek için kullanılabilecek deneyler yaklaşımın bir tasarımını tarif eder.

Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bitki yapraklarındaki proteinlerin geçici ekspresyonu için tahmine dayalı modeller oluşturmaktır. Bu, geçici ekspresyon için en önemli parametreleri tanımlamak ve bunların protein birikimi üzerindeki etkilerini ölçmek için deneysel bir tasarım oluşturularak elde edilir. İkinci adım olarak, genler klonlanır ve agro bakterilere aktarılır, bunlar daha sonra yapraklara enjekte edilir ve bu da geçici protein ekspresyonu ile sonuçlanır.Sonraki yaprak numuneleri, protein ekspresyon seviyelerini belirlemek için analiz edilir. Farklı yaşlardaki yapraklarda ve farklı inkübasyon koşulları için geçici protein ekspresyon seviyelerinin modelini gösteren sonuçlar, deney modeli değerlendirmesine dayalı olarak elde edilmiştir. Bu tekniğin, her seferinde bir faktör gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, izin yaşı veya konumsal yaprak gibi farklı parametreler arasındaki etkileşimlerin tespit edilebilmesi ve ölçülebilmesidir.Belirli faktörlerin bir deneyin sonucu üzerindeki etkisini karakterize etmek için sıklıkla kullanılan bir seferde bir faktör yaklaşımı, bir deney sırasındaki bireysel çalıştırmalar bir ip üzerindeki inciler gibi hizalanacağı ve böylece tasarım alanının düşük bir kapsama alanı elde edeceği için optimal değildir. DOE stratejisinin deneylerinin tasarımının aksine, bir seferde birden fazla faktörün varyasyonu, elde edilen modellerin kapsamını ve dolayısıyla kesinliğini arttırır. Ayrıca, önyargılı tasarım alanı her seferinde bir faktörde kapsama alanıdır.Deneyler ayrıca optimal çalışma bölgelerini belirlemede ve optimal olmayan çözümleri tahmin etmede başarısız olabilirken, DOE stratejilerinin tercih edilen koşulları belirleme olasılığı daha yüksektir. Bu akış şeması, bir DOE stratejisi planlama sürecini göstermektedir. İlk adım, tasarıma dahil edilmek için ilgili faktörleri ve yanıtları belirlemektir.Bu gösteride, bir model anti HIV monoklonal antikoru iki G 12 ve bir floresan markör, protein DS kırmızısının ekspresyon seviyeleri önceki deneylere dayanarak ölçülecektir. İlgili olarak kabul edilen minimum tespit edilebilir fark, iki G 10 için mililitre başına 12 mikrogram ve DS kırmızısı için mililitre başına 20 mikrogram olacaktır. Ek olarak, iki G 12 ve DS kırmızısı için sistemin tahmini standart sapması için yaklaşık değerler sırasıyla mililitre başına dört ve sekiz mikrogram olacaktır.Bu DOE stratejisini planlamak için kalan adımlar burada tartışılmayacaktır, ancak ayrıntılar ekteki makalede bulunabilir. İki G 12 ve DS kırmızısı, tütün bitkilerinde geçici olarak ifade edilecektir. Bitki yetiştirme prosedürüne başlamak için, artık kimyasalları gidermek için deiyonize su ile yoğun bir şekilde yanıp sönerek 10'a 10'a sekiz santimetre kaya duvar blokları hazırlayın.Bundan sonra, her bir kaya duvar bloğuna bir ila iki tütün tohumu yerleştirerek blokları taze hazırlanmış bir gübre tohumu tütün bitkileri çözeltisi ile dengeleyin ve ardından gübre ile kısa bir yıkama yapın. Tütün bitkilerini 42 gün boyunca uygun koşullarda bir serada tohumları yıkamaktan kaçınmaya, çimlendirmeye ve yetiştirmeye dikkat edin. Bir kültürü OD 600 nanometre 5.0'a kadar büyüterek AUM SSBF'yi hazırlayın.Enjeksiyondan önce enjeksiyon için gerekli olan OD 600 nanometreye uyacak şekilde kültürü su ve iki kat infiltrasyon ortamı ile seyreltin. Yaprakları enjeksiyona hazırlamak için fasion süspansiyonunun atumunun OD 600 nanometresini onaylayın. AUM Fasion solüsyonunun akışını kolaylaştırmak için enjeksiyon bölgesindeki epidermisi bir pipet ucuyla nazikçe çizin.Bunu yaparken yaprak bıçağını yırtmaktan kaçının. AUM fasion süspansiyonunu içeren şırıngayı yaprak bıçağına dik tutun, namluyu tedavi edilecek interkostal alana dokundurun, çıkışı yavaşça yaprağın alt tarafına itin. Aynı zamanda, yaprak bıçağının kaymasını veya yırtılmasını önlemek için yaprağın üst tarafına hafifçe bastırın.Şırınga pistonunu yavaşça aşağı doğru itin. AUM moda çözümü, tedavi edilen alanların daha koyu, yeşil ve nemli görünmesiyle belirtildiği gibi yaprak bıçağı içindeki hücreler arası boşluklara girecektir. Enjeksiyon sırasında şırınganın yaprağa dik kaldığından emin olun.Aksi takdirde, bakteriyel süspansiyon yüksek basınç altında dışarı çıkabilir. Tüm interkostal alana aum, aum, fass ile sızana kadar bu işlemi birkaç pozisyonda tekrarlayın. Daha sonra enjeksiyondan sonra bir sonraki interkostal alanla devam edin, kuluçka süresi tamamlandığında bitkileri DOE tarafından belirlenen koşullar altında inkübe edin.Örneklemeye başlayın. Yaprağı elde tutulan bir kağıt havluyla stabilize edin ve DOE tarafından belirtilen konum ve zamanlarda tedavi edilen interkostal alanlardan dört ila beş yaprak diskini çıkarmak için bir mantar ödünç alan kullanın. Numune alma sırasında bitkiden yaprağın tamamını çıkarmayın.Her numunenin kütlesini belirleyin ve numune adı ve kütlesi ile etiketlenmiş 1.5 mililitrelik bir plastik reaksiyon tüpüne yerleştirin. Protein kantitasyonundan önce numuneleri eksi 20 santigrat derece veya eksi 80 santigrat derecede saklayın. İşlem, numune stabilitesine ve yaprak disk numunelerinden proteinleri çıkarmak için depolama sıcaklığına bağlı olarak bu aşamada birkaç ay duraklatılabilir.Numune kütlesinin miligramı başına üç mililitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve yaprak disklerini büyük parçalar kalmayana kadar elektrikli bir havaneli kullanarak reaksiyon tüpünde öğütün. Numunenin aşırı ısınmasını önlemek için, santrifüjlemeden sonra tüp ısındığında tüpü buzun üzerine yerleştirin. Dağılmış katıları çıkarmak için, süpernatanı temiz bir 1.5 milimetre reaksiyon tüpüne aktarın.DS kırmızı floresansını sırayla iki kez ölçün. Her numune için 530 25 nanometre uyarma ve 590 35 nanometre emisyon filtresi ile donatılmış 96 iyi oynanan bir okuyucuda. İki okuma ve üç teknik kopya üzerindeki floresansın ortalamasını alın ve mililitre DS kırmızısı başına sıfır mikrogram içeren boş kontrol için kaydedilen değeri çıkarın.Ayrıca bu değeri standart seyreltmelerin sazlarından çıkarın ve bu boş düzeltilmiş değerleri, bir referans eğrisi veren doğrusal bir regresyon için kullanın. Referans eğrisinin eğimi daha sonra numuneler için ölçülen floresanı DS kırmızı konsantrasyonlarına dönüştürmek için kullanılır. İki G 12 antikorunun konsantrasyonunu belirleme prosedürü burada gösterilmeyecektir, ancak beraberindeki el yazmasında ayrıntılı olarak açıklanmıştır.Analiz düğümünde veri analizi ve değerlendirmesi için Design Expert yazılımı kullanılır. Analiz edilecek yanıtı seçin ve başlangıçta dönüştürme sekmesinde hiçbiri'ni seçin. İncelenen sistem için önemli olan faktörler hakkında genel bilgiler sağlayan uygun özet sekmesine devam edin.Yazılım, model sekmesindeki önemine göre bir başlangıç modeli önerecektir. Uyum özeti sonuçlarına göre bir başlangıç modeli önceden seçilir. Bu modeli Innova sekmesinde düzenlemek için otomatik modu kullanın.Önerilen modeli ve gerekirse dahil edilen faktörleri araştırın. Model sekmesine geri dönerek, seçimi manuel olarak değiştirerek ve modelden uygun faktörleri ortadan kaldırarak, önceden tanımlanmış bir eşiğin üzerinde P değerlerine sahip veya mekanik değerlendirmeye dayalı olarak olası olmayan faktörleri manuel olarak kaldırın. Modelin kalitesini onaylamak ve veri kümesinde model üzerinde güçlü bir etkiye sahip olan olası aykırı değerleri algılamak için tanılama sekmesine devam edin.Tanılama aracındaki tüm sekmeleri inceleyerek, Cox grafiği kutusu tarafından öneriliyorsa ilgili sekmede dönüştürme türünü ayarlayın ve model grafikleri sekmesindeki analiz prosedürünü yeniden başlatın. Değerlendirilen modeli, üç gibi sınırlı sayıda sayısal faktör için görselleştirin. Yanıt yüzeyi gösterimi, optimal özellikleri değerlendirmek için kullanışlıdır.El ile yanıt yüzeyleri yalnızca iki faktörün incelenen yanıt üzerindeki etkisini gösterir. Herhangi bir ek faktörün yanıt üzerindeki etkisi, faktörler araç penceresinde değeri veya düzeyi değiştirilerek ortaya çıkar. Alternatif olarak, faktörler araç penceresinde sağ tıklanarak ve istenen bağımsız değişken ekseni seçilerek faktörler çizim eksenine atanabilir.Faktör seviyelerini manipüle edin ve faktörler aracını kullanarak bunları grafik koordinatlarına atayın. Dosya sekmesindeki grafiği dosyaya aktar komutunu kullanarak grafikleri dışa aktarın. Ölçüt sekmesi aracılığıyla belirli kısıtlamaların uygulanabileceği model faktörlerine bağlı olarak, istenen yanıtı sayısal olarak optimize etmek için optimizasyon düğümündeki sayısal alt düğümü kullanın.Ölçütler sekmesinde sağlanan girdiye dayalı olarak çözümler sekmesindeki sayısal çözümleri hesaplayın ve inceleyin. Bu çözümleri, yüksek veya düşük yanıt değerleriyle ilişkili faktör ayarlarını ortaya çıkaran daha fazla analiz için elektronik tablo gibi diğer yazılımlara aktarın. Bu, üçten fazla sayısal faktör araştırılırsa ve bu temsili çalışmada 3D gösterim zorsa yararlıdır.DOE stratejisi, farklı promotörlerin ve beş asal RS'nin ds'nin geçici ekspresyonu üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıldı. Geçici ifade modeline dahil edilen kırmızı faktörler ve araştırılan aralıklar bu tabloda gösterilmiştir. Kalın yazılan faktörler bu deneye özgüdür.İtalik olarak yazılan faktörler, daha sonra açıklanacak olan başka bir deney içindir. İkinci dereceden bir temel modelin hesaplanmasına izin vermek için tüm gizli sayısal faktörler için en az üç seviye seçildi. Regresyon modelinin katsayıları için en doğru tahminleri elde etmek için DOE çalıştırmalarının seçimi için optimal bir seçim algoritması seçilmiştir.Başlangıçta tasarım uzmanı tarafından önerilen tasarım 90 çalışmadan oluşuyordu, ancak FDS %1'lik standart bir tahmin hatası elde etmek için yetersizdi. Tasarımın toplam 210 çalıştırmaya en uygun şekilde büyütülmesi bu sorunu çözdü ve düz eğri ile gösterilen tasarım alanı boyunca daha düzgün tahmin doğruluğu ile %100'lük bir FDS ile sonuçlandı, 210 çalıştırmanın tümü için DS kırmızı konsantrasyonları belirlendi ve veriler log 10 dönüştürüldü. Model faktörleri, alfa seviyesi 0.100 olan kübik bir modelden otomatik geriye doğru seçim ile seçilmiştir.Bu, çoklu korelasyon katsayıları için önemsiz uyum eksikliği ve yüksek değerlere sahip anlamlı bir model ile sonuçlandı. Tüm model faktörlerinin P değeri 0,05'ten düşüktü ve bu nedenle modelin daha fazla manuel manipülasyonuna gerek yoktu. Model, FDS grafiğinin ilk ikinci dereceden temel model yeniden değerlendirmesinin bir parçası olmayan, kalın harflerle vurgulanan üç faktör etkileşimini içeriyordu.Nihai tahmin modelinde yer alan tüm faktörlerin kullanılması, standart tahmin hatası için FDS'nin, ek üç faktör etkileşimlerinin dahil edilmesiyle önemli ölçüde azalmadığını ortaya koydu. Tasarım uzmanındaki model kalitesi tanılama araçları, veri dönüşümünün yararlı olduğunu ve modelde eksik faktör olmadığını, çünkü normal kalıntı grafiğinin doğrusal davranış gösterdiğini ve kalıntılara karşı tahmin edilen grafiği karşılaştıran belirli bir örüntü gözlenmediğini göstermiştir. Deney boyunca gizli bir zamana bağlı değişkeni gösteren bir eğilim de yoktu.Bunun yerine, model tahminleri, tüm noktalar köşegene yakın olduğu için gözlemlenen Diaz kırmızı floresan ile çok iyi bir uyum içindeydi. Bu nedenle, seçilen modelin, sekiz gün süren bir infiltrasyon sonrası inkübasyon periyodu sırasında farklı promotör beş asal UTR kombinasyonu tarafından türetilen kurşunsuz tütün yapraklarında DS kırmızısının geçici ekspresyonunu tahmin etmek için yararlı olduğu varsayılmıştır ve yanlış faktör seçimi ve dönüşümünün sonuçlarını göstermek için veri dönüşümü olmayan yapay doğrusal regresyon modeli de seçilmiştir. Burada açıkça görüldüğü gibi, kalıntıların normal grafiği beklenen doğrusal davranıştan saparlar ve artıklara karşı tahmin edilen çizimde rastgele bir dağılım yerine V şeklinde bir model vardır.Ek olarak, kalıntılara karşı çalıştırma grafiği iki uç değeri vurgular. Köşegenden sapan hem küçük hem de yüksek değerler için tahminler zayıf olsa da, tütün yapraklarında geçici DS kırmızı ekspresyonu için en uygun model yanıt yüzeyleri burada gösterilmektedir. Model, yaprak yaşının yaşlı yapraklarda daha düşük ifade seviyeleri ile önemli bir faktör olduğunu öngördü, örneğin, parsel A ve parsel B'deki ikinci yaprak, parsel C ve parseldeki altıncı yaprak gibi genç yapraklara kıyasla.CAMV 35 SS promotörü ile beş ana UTR kombinasyonu, NOS promotörü ile kombinasyonlardan daha güçlü DS kırmızı ifadesi ile sonuçlandı. Beş asal UTR, TL ve CHS arasındaki karşılaştırmada gösterildiği gibi DS sağ ifadesi üzerinde de önemli bir etkiye sahip olsa da, ifade gücü eşlik eden promotöre bağlıydı. Öngörücü model ayrıca, nas CHS ve CAMV 35 SS CHS gibi belirli promotör beş asal UTR kombinasyonu çiftinin, tüm yapraklar ve iki günden uzun inkübasyon süreleri boyunca tanımlanmış bir orandan %30'dan daha az farklılık gösteren dengeli ekspresyon seviyeleri ile sonuçlandığını göstermiştir.Bu tür dengeli bir ifade, tanımlanmış bir stokiyometri ile multimerik proteinlerin ekspresyonu için faydalı olacaktır. DOE yaklaşımı, tütünde iki G 12 ve DS kırmızısının aynı anda üretimi için kuluçka koşullarını ve hasat şemalarını optimize etmek için de kullanıldı. Bu deneye dahil edilen geçici ekspresyonunu etkileyen faktörler italik olarak ve 600 nanometre ve inkübasyon süresidir.Farklı yaşlardaki bitkilerde her bir proteinin ekspresyonu için bir öngörücü model oluşturulmuştur. Genç yapraklar ekimden 40 gün sonra hasat edildi, eski yapraklar ekimden 47 gün sonra hasat edildi. Bu dört model daha sonra değerlendirildi ve bireysel modellerde önemli bulunan her bir faktörü içeren bir konsensüs modeli oluşturuldu.Daha sonra, konsensüs modelinin hala tüm ilk veri setlerinin iyi bir temsili olduğu doğrulandı. Konsensüs modeli daha sonra, genç ve yaşlı bitkilerde tüm yapraklardaki ve yaprak pozisyonlarındaki protein konsantrasyonlarını tahmin etmek için her iki protein için optimal inkübasyon sıcaklıklarını ve bakteriyel OD 600 nanometrelerini belirlemek için kullanıldı. Konsantrasyon profillerinin biyokütle verileriyle entegrasyonu daha sonra mutlak protein verimi ile sonuçlandı.Mutlak protein miktarları daha sonra ilişkili aşağı akış maliyetleriyle ilişkilendirildi ve bu da bitki yaşı başına her bir yaprağın işlenmesi için bir maliyet fayda analizine izin verdi. Genç bitkilerde daha yüksek spesifik protein ekspresyonunu yansıtan yaklaşık %50 daha düşük ortalama biyokütleye rağmen, aynı miktarda DS kırmızısı ve iki G 12'nin yaklaşık %65'i genç bitkilerde yaşlılara göre bulunmuştur. Bu, genç bitkilerin geçici ekspresyon için avantajlı olduğunu ortaya koydu, çünkü proteinler, yaşlı bitkilere kıyasla daha düşük toplam biyokütleye rağmen daha kısa büyüme dönemlerinde daha yüksek konsantrasyonlara ulaştı.Son olarak, eski bitkilerden elde edilen tüm yaprakların işlenmesinin, yaprakların birden üçe atılmasından ve bunun yerine parti başına bitki sayısının arttırılmasından daha pahalı olduğu da bulundu. Bu nedenle, DOE tabanlı modeller yalnızca bir deneyin son adımını işaretlemek için değil, aynı zamanda süreç analizinin daha karmaşık yönlerini kolaylaştırmak için diğer verilerle kombinasyon için de uygundur. Bu videoyu izledikten sonra, bitkilerde geçici protein ekspresyonunu araştırmak için bir DOE'nin nasıl kurulacağı, yürütüleceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

characterization-complex-systems-using-design-experiments-approach

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Kaynak: Rufián, J. S. ve diğerleri. Bitki dokusunda Pseudomonas Syringae genlerinin tek hücreli analizi. J. Vis. Exp. (2022).Bu video, floresan etiketlenmiş transkripsiyon faktörü kullanılarak bitkiden ekstra edilmiş patojenik bakterilerde gen ifadesinin tek hücre düzeyinde analiz edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Konfokal görüntüleme, virülans gen ifadesinde heterojenliği ortaya koyarak klonal bakteri popülasyonundaki fonksiyonel çeşitliliği ortaya koyuyor.

Bitki Ekstraksiyonu Patojenlerinden Gen İfadesinin Tek Hücreli Analizi

Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım...

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Bu çalışma, seçici olarak BioRad Gene Gun kullanılarak tahlil, bitkilerde hücre-altı organel hedefleyen için yeni bir yöntem tarif eder.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Tütün bitkileri, bir geçici ekspresyon sistemi ile, bir fungal selülaz, TrCel5A üretmek için kullanıldı. Ekspresyon, bir floresan füzyon proteini kullanılarak takip edilebilir, ve protein aktivitesi post-ekspresyon karakterize edilmiştir.

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Tütün Bitkilerinde

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Bir yüksek verimlilik, otomatik, tütün protoplast üretim ve dönüşüm metodolojisi açıklanmıştır. Robotik sistem dışı bir model ürünlere çevrilebilir olmalıdır modeli BY-2 sistemde güçlü paralel gen ifadesi ve keşif sağlar.

Yüksek verim Protoplast İzolasyonu ve Dönüşüm için Robotik Platformu

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Öğrenin, tütün yapraklarında geçici protein ifadesi için deneysel tasarım yaklaşımını. Bu yöntem, monoklonal antikor üretiminde parametre etkileşimlerini belirleyerek verimliliği artırır.

Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal

Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet