Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, bitki yapraklarındaki proteinlerin geçici ekspresyonu için tahmine dayalı modeller oluşturmaktır. Bu, geçici ekspresyon için en önemli parametreleri tanımlamak ve bunların protein birikimi üzerindeki etkilerini ölçmek için deneysel bir tasarım oluşturularak elde edilir. İkinci adım olarak, genler klonlanır ve agro bakterilere aktarılır, bunlar daha sonra yapraklara enjekte edilir ve bu da geçici protein ekspresyonu ile sonuçlanır.

Sonraki yaprak numuneleri, protein ekspresyon seviyelerini belirlemek için analiz edilir. Farklı yaşlardaki yapraklarda ve farklı inkübasyon koşulları için geçici protein ekspresyon seviyelerinin modelini gösteren sonuçlar, deney modeli değerlendirmesine dayalı olarak elde edilmiştir. Bu tekniğin, her seferinde bir faktör gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, izin yaşı veya konumsal yaprak gibi farklı parametreler arasındaki etkileşimlerin tespit edilebilmesi ve ölçülebilmesidir.

Belirli faktörlerin bir deneyin sonucu üzerindeki etkisini karakterize etmek için sıklıkla kullanılan bir seferde bir faktör yaklaşımı, bir deney sırasındaki bireysel çalıştırmalar bir ip üzerindeki inciler gibi hizalanacağı ve böylece tasarım alanının düşük bir kapsama alanı elde edeceği için optimal değildir. DOE stratejisinin deneylerinin tasarımının aksine, bir seferde birden fazla faktörün varyasyonu, elde edilen modellerin kapsamını ve dolayısıyla kesinliğini arttırır. Ayrıca, önyargılı tasarım alanı her seferinde bir faktörde kapsama alanıdır.

Deneyler ayrıca optimal çalışma bölgelerini belirlemede ve optimal olmayan çözümleri tahmin etmede başarısız olabilirken, DOE stratejilerinin tercih edilen koşulları belirleme olasılığı daha yüksektir. Bu akış şeması, bir DOE stratejisi planlama sürecini göstermektedir. İlk adım, tasarıma dahil edilmek için ilgili faktörleri ve yanıtları belirlemektir.

Bu gösteride, bir model anti HIV monoklonal antikoru iki G 12 ve bir floresan markör, protein DS kırmızısının ekspresyon seviyeleri önceki deneylere dayanarak ölçülecektir. İlgili olarak kabul edilen minimum tespit edilebilir fark, iki G 10 için mililitre başına 12 mikrogram ve DS kırmızısı için mililitre başına 20 mikrogram olacaktır. Ek olarak, iki G 12 ve DS kırmızısı için sistemin tahmini standart sapması için yaklaşık değerler sırasıyla mililitre başına dört ve sekiz mikrogram olacaktır.

Bu DOE stratejisini planlamak için kalan adımlar burada tartışılmayacaktır, ancak ayrıntılar ekteki makalede bulunabilir. İki G 12 ve DS kırmızısı, tütün bitkilerinde geçici olarak ifade edilecektir. Bitki yetiştirme prosedürüne başlamak için, artık kimyasalları gidermek için deiyonize su ile yoğun bir şekilde yanıp sönerek 10'a 10'a sekiz santimetre kaya duvar blokları hazırlayın.

Bundan sonra, her bir kaya duvar bloğuna bir ila iki tütün tohumu yerleştirerek blokları taze hazırlanmış bir gübre tohumu tütün bitkileri çözeltisi ile dengeleyin ve ardından gübre ile kısa bir yıkama yapın. Tütün bitkilerini 42 gün boyunca uygun koşullarda bir serada tohumları yıkamaktan kaçınmaya, çimlendirmeye ve yetiştirmeye dikkat edin. Bir kültürü OD 600 nanometre 5.0'a kadar büyüterek AUM SSBF'yi hazırlayın.

Enjeksiyondan önce enjeksiyon için gerekli olan OD 600 nanometreye uyacak şekilde kültürü su ve iki kat infiltrasyon ortamı ile seyreltin. Yaprakları enjeksiyona hazırlamak için fasion süspansiyonunun atumunun OD 600 nanometresini onaylayın. AUM Fasion solüsyonunun akışını kolaylaştırmak için enjeksiyon bölgesindeki epidermisi bir pipet ucuyla nazikçe çizin.

Bunu yaparken yaprak bıçağını yırtmaktan kaçının. AUM fasion süspansiyonunu içeren şırıngayı yaprak bıçağına dik tutun, namluyu tedavi edilecek interkostal alana dokundurun, çıkışı yavaşça yaprağın alt tarafına itin. Aynı zamanda, yaprak bıçağının kaymasını veya yırtılmasını önlemek için yaprağın üst tarafına hafifçe bastırın.

Şırınga pistonunu yavaşça aşağı doğru itin. AUM moda çözümü, tedavi edilen alanların daha koyu, yeşil ve nemli görünmesiyle belirtildiği gibi yaprak bıçağı içindeki hücreler arası boşluklara girecektir. Enjeksiyon sırasında şırınganın yaprağa dik kaldığından emin olun.

Aksi takdirde, bakteriyel süspansiyon yüksek basınç altında dışarı çıkabilir. Tüm interkostal alana aum, aum, fass ile sızana kadar bu işlemi birkaç pozisyonda tekrarlayın. Daha sonra enjeksiyondan sonra bir sonraki interkostal alanla devam edin, kuluçka süresi tamamlandığında bitkileri DOE tarafından belirlenen koşullar altında inkübe edin.

Örneklemeye başlayın. Yaprağı elde tutulan bir kağıt havluyla stabilize edin ve DOE tarafından belirtilen konum ve zamanlarda tedavi edilen interkostal alanlardan dört ila beş yaprak diskini çıkarmak için bir mantar ödünç alan kullanın. Numune alma sırasında bitkiden yaprağın tamamını çıkarmayın.

Her numunenin kütlesini belirleyin ve numune adı ve kütlesi ile etiketlenmiş 1.5 mililitrelik bir plastik reaksiyon tüpüne yerleştirin. Protein kantitasyonundan önce numuneleri eksi 20 santigrat derece veya eksi 80 santigrat derecede saklayın. İşlem, numune stabilitesine ve yaprak disk numunelerinden proteinleri çıkarmak için depolama sıcaklığına bağlı olarak bu aşamada birkaç ay duraklatılabilir.

Numune kütlesinin miligramı başına üç mililitre ekstraksiyon tamponu ekleyin ve yaprak disklerini büyük parçalar kalmayana kadar elektrikli bir havaneli kullanarak reaksiyon tüpünde öğütün. Numunenin aşırı ısınmasını önlemek için, santrifüjlemeden sonra tüp ısındığında tüpü buzun üzerine yerleştirin. Dağılmış katıları çıkarmak için, süpernatanı temiz bir 1.5 milimetre reaksiyon tüpüne aktarın.

DS kırmızı floresansını sırayla iki kez ölçün. Her numune için 530 25 nanometre uyarma ve 590 35 nanometre emisyon filtresi ile donatılmış 96 iyi oynanan bir okuyucuda. İki okuma ve üç teknik kopya üzerindeki floresansın ortalamasını alın ve mililitre DS kırmızısı başına sıfır mikrogram içeren boş kontrol için kaydedilen değeri çıkarın.

Ayrıca bu değeri standart seyreltmelerin sazlarından çıkarın ve bu boş düzeltilmiş değerleri, bir referans eğrisi veren doğrusal bir regresyon için kullanın. Referans eğrisinin eğimi daha sonra numuneler için ölçülen floresanı DS kırmızı konsantrasyonlarına dönüştürmek için kullanılır. İki G 12 antikorunun konsantrasyonunu belirleme prosedürü burada gösterilmeyecektir, ancak beraberindeki el yazmasında ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Analiz düğümünde veri analizi ve değerlendirmesi için Design Expert yazılımı kullanılır. Analiz edilecek yanıtı seçin ve başlangıçta dönüştürme sekmesinde hiçbiri'ni seçin. İncelenen sistem için önemli olan faktörler hakkında genel bilgiler sağlayan uygun özet sekmesine devam edin.

Yazılım, model sekmesindeki önemine göre bir başlangıç modeli önerecektir. Uyum özeti sonuçlarına göre bir başlangıç modeli önceden seçilir. Bu modeli Innova sekmesinde düzenlemek için otomatik modu kullanın.

Önerilen modeli ve gerekirse dahil edilen faktörleri araştırın. Model sekmesine geri dönerek, seçimi manuel olarak değiştirerek ve modelden uygun faktörleri ortadan kaldırarak, önceden tanımlanmış bir eşiğin üzerinde P değerlerine sahip veya mekanik değerlendirmeye dayalı olarak olası olmayan faktörleri manuel olarak kaldırın. Modelin kalitesini onaylamak ve veri kümesinde model üzerinde güçlü bir etkiye sahip olan olası aykırı değerleri algılamak için tanılama sekmesine devam edin.

Tanılama aracındaki tüm sekmeleri inceleyerek, Cox grafiği kutusu tarafından öneriliyorsa ilgili sekmede dönüştürme türünü ayarlayın ve model grafikleri sekmesindeki analiz prosedürünü yeniden başlatın. Değerlendirilen modeli, üç gibi sınırlı sayıda sayısal faktör için görselleştirin. Yanıt yüzeyi gösterimi, optimal özellikleri değerlendirmek için kullanışlıdır.

El ile yanıt yüzeyleri yalnızca iki faktörün incelenen yanıt üzerindeki etkisini gösterir. Herhangi bir ek faktörün yanıt üzerindeki etkisi, faktörler araç penceresinde değeri veya düzeyi değiştirilerek ortaya çıkar. Alternatif olarak, faktörler araç penceresinde sağ tıklanarak ve istenen bağımsız değişken ekseni seçilerek faktörler çizim eksenine atanabilir.

Faktör seviyelerini manipüle edin ve faktörler aracını kullanarak bunları grafik koordinatlarına atayın. Dosya sekmesindeki grafiği dosyaya aktar komutunu kullanarak grafikleri dışa aktarın. Ölçüt sekmesi aracılığıyla belirli kısıtlamaların uygulanabileceği model faktörlerine bağlı olarak, istenen yanıtı sayısal olarak optimize etmek için optimizasyon düğümündeki sayısal alt düğümü kullanın.

Ölçütler sekmesinde sağlanan girdiye dayalı olarak çözümler sekmesindeki sayısal çözümleri hesaplayın ve inceleyin. Bu çözümleri, yüksek veya düşük yanıt değerleriyle ilişkili faktör ayarlarını ortaya çıkaran daha fazla analiz için elektronik tablo gibi diğer yazılımlara aktarın. Bu, üçten fazla sayısal faktör araştırılırsa ve bu temsili çalışmada 3D gösterim zorsa yararlıdır.

DOE stratejisi, farklı promotörlerin ve beş asal RS'nin ds'nin geçici ekspresyonu üzerindeki etkilerini incelemek için kullanıldı. Geçici ifade modeline dahil edilen kırmızı faktörler ve araştırılan aralıklar bu tabloda gösterilmiştir. Kalın yazılan faktörler bu deneye özgüdür.

İtalik olarak yazılan faktörler, daha sonra açıklanacak olan başka bir deney içindir. İkinci dereceden bir temel modelin hesaplanmasına izin vermek için tüm gizli sayısal faktörler için en az üç seviye seçildi. Regresyon modelinin katsayıları için en doğru tahminleri elde etmek için DOE çalıştırmalarının seçimi için optimal bir seçim algoritması seçilmiştir.

Başlangıçta tasarım uzmanı tarafından önerilen tasarım 90 çalışmadan oluşuyordu, ancak FDS %1'lik standart bir tahmin hatası elde etmek için yetersizdi. Tasarımın toplam 210 çalıştırmaya en uygun şekilde büyütülmesi bu sorunu çözdü ve düz eğri ile gösterilen tasarım alanı boyunca daha düzgün tahmin doğruluğu ile %100'lük bir FDS ile sonuçlandı, 210 çalıştırmanın tümü için DS kırmızı konsantrasyonları belirlendi ve veriler log 10 dönüştürüldü. Model faktörleri, alfa seviyesi 0.100 olan kübik bir modelden otomatik geriye doğru seçim ile seçilmiştir.

Bu, çoklu korelasyon katsayıları için önemsiz uyum eksikliği ve yüksek değerlere sahip anlamlı bir model ile sonuçlandı. Tüm model faktörlerinin P değeri 0,05'ten düşüktü ve bu nedenle modelin daha fazla manuel manipülasyonuna gerek yoktu. Model, FDS grafiğinin ilk ikinci dereceden temel model yeniden değerlendirmesinin bir parçası olmayan, kalın harflerle vurgulanan üç faktör etkileşimini içeriyordu.

Nihai tahmin modelinde yer alan tüm faktörlerin kullanılması, standart tahmin hatası için FDS'nin, ek üç faktör etkileşimlerinin dahil edilmesiyle önemli ölçüde azalmadığını ortaya koydu. Tasarım uzmanındaki model kalitesi tanılama araçları, veri dönüşümünün yararlı olduğunu ve modelde eksik faktör olmadığını, çünkü normal kalıntı grafiğinin doğrusal davranış gösterdiğini ve kalıntılara karşı tahmin edilen grafiği karşılaştıran belirli bir örüntü gözlenmediğini göstermiştir. Deney boyunca gizli bir zamana bağlı değişkeni gösteren bir eğilim de yoktu.

Bunun yerine, model tahminleri, tüm noktalar köşegene yakın olduğu için gözlemlenen Diaz kırmızı floresan ile çok iyi bir uyum içindeydi. Bu nedenle, seçilen modelin, sekiz gün süren bir infiltrasyon sonrası inkübasyon periyodu sırasında farklı promotör beş asal UTR kombinasyonu tarafından türetilen kurşunsuz tütün yapraklarında DS kırmızısının geçici ekspresyonunu tahmin etmek için yararlı olduğu varsayılmıştır ve yanlış faktör seçimi ve dönüşümünün sonuçlarını göstermek için veri dönüşümü olmayan yapay doğrusal regresyon modeli de seçilmiştir. Burada açıkça görüldüğü gibi, kalıntıların normal grafiği beklenen doğrusal davranıştan saparlar ve artıklara karşı tahmin edilen çizimde rastgele bir dağılım yerine V şeklinde bir model vardır.

Ek olarak, kalıntılara karşı çalıştırma grafiği iki uç değeri vurgular. Köşegenden sapan hem küçük hem de yüksek değerler için tahminler zayıf olsa da, tütün yapraklarında geçici DS kırmızı ekspresyonu için en uygun model yanıt yüzeyleri burada gösterilmektedir. Model, yaprak yaşının yaşlı yapraklarda daha düşük ifade seviyeleri ile önemli bir faktör olduğunu öngördü, örneğin, parsel A ve parsel B'deki ikinci yaprak, parsel C ve parseldeki altıncı yaprak gibi genç yapraklara kıyasla.

CAMV 35 SS promotörü ile beş ana UTR kombinasyonu, NOS promotörü ile kombinasyonlardan daha güçlü DS kırmızı ifadesi ile sonuçlandı. Beş asal UTR, TL ve CHS arasındaki karşılaştırmada gösterildiği gibi DS sağ ifadesi üzerinde de önemli bir etkiye sahip olsa da, ifade gücü eşlik eden promotöre bağlıydı. Öngörücü model ayrıca, nas CHS ve CAMV 35 SS CHS gibi belirli promotör beş asal UTR kombinasyonu çiftinin, tüm yapraklar ve iki günden uzun inkübasyon süreleri boyunca tanımlanmış bir orandan %30'dan daha az farklılık gösteren dengeli ekspresyon seviyeleri ile sonuçlandığını göstermiştir.

Bu tür dengeli bir ifade, tanımlanmış bir stokiyometri ile multimerik proteinlerin ekspresyonu için faydalı olacaktır. DOE yaklaşımı, tütünde iki G 12 ve DS kırmızısının aynı anda üretimi için kuluçka koşullarını ve hasat şemalarını optimize etmek için de kullanıldı. Bu deneye dahil edilen geçici ekspresyonunu etkileyen faktörler italik olarak ve 600 nanometre ve inkübasyon süresidir.

Farklı yaşlardaki bitkilerde her bir proteinin ekspresyonu için bir öngörücü model oluşturulmuştur. Genç yapraklar ekimden 40 gün sonra hasat edildi, eski yapraklar ekimden 47 gün sonra hasat edildi. Bu dört model daha sonra değerlendirildi ve bireysel modellerde önemli bulunan her bir faktörü içeren bir konsensüs modeli oluşturuldu.

Daha sonra, konsensüs modelinin hala tüm ilk veri setlerinin iyi bir temsili olduğu doğrulandı. Konsensüs modeli daha sonra, genç ve yaşlı bitkilerde tüm yapraklardaki ve yaprak pozisyonlarındaki protein konsantrasyonlarını tahmin etmek için her iki protein için optimal inkübasyon sıcaklıklarını ve bakteriyel OD 600 nanometrelerini belirlemek için kullanıldı. Konsantrasyon profillerinin biyokütle verileriyle entegrasyonu daha sonra mutlak protein verimi ile sonuçlandı.

Mutlak protein miktarları daha sonra ilişkili aşağı akış maliyetleriyle ilişkilendirildi ve bu da bitki yaşı başına her bir yaprağın işlenmesi için bir maliyet fayda analizine izin verdi. Genç bitkilerde daha yüksek spesifik protein ekspresyonunu yansıtan yaklaşık %50 daha düşük ortalama biyokütleye rağmen, aynı miktarda DS kırmızısı ve iki G 12'nin yaklaşık %65'i genç bitkilerde yaşlılara göre bulunmuştur. Bu, genç bitkilerin geçici ekspresyon için avantajlı olduğunu ortaya koydu, çünkü proteinler, yaşlı bitkilere kıyasla daha düşük toplam biyokütleye rağmen daha kısa büyüme dönemlerinde daha yüksek konsantrasyonlara ulaştı.

Son olarak, eski bitkilerden elde edilen tüm yaprakların işlenmesinin, yaprakların birden üçe atılmasından ve bunun yerine parti başına bitki sayısının arttırılmasından daha pahalı olduğu da bulundu. Bu nedenle, DOE tabanlı modeller yalnızca bir deneyin son adımını işaretlemek için değil, aynı zamanda süreç analizinin daha karmaşık yönlerini kolaylaştırmak için diğer verilerle kombinasyon için de uygundur. Bu videoyu izledikten sonra, bitkilerde geçici protein ekspresyonunu araştırmak için bir DOE'nin nasıl kurulacağı, yürütüleceği ve analiz edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.