Yaralı Zebra Balığı Larvalarında Kalıcı Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyonunun Modellenmesi

Pseudomonas aeruginosa bakterisinin neden olduğu kronik enfeksiyon antibiyotiklere toleranslıdır ve tedavisi çok zordur. Amacımız, etkili tedavilerin keşfini hızlandıracak bir in vivo model geliştirmektir. Antibakteriyel ilaçlar çoğunlukla in vitro olarak taranır ve kronik olarak enfekte olmuş farelerde ilaçları test etmek karmaşık bir zorluktur. Bu iki yaklaşım arasındaki boşluğu doldurmak için yaralı zebra balığı larvalarını kullanan alternatif bir klinik öncesi model öneriyoruz. Pseudomonas aeruginosa'nın klinik suşunun kullanımına dayanan zebra balıklarında kalıcı enfeksiyon modelimiz, antibiyotik toleransını yeniden üretir. Zebra balığı larvalarını enfekte etmek için mikro enjeksiyon yaygın olarak kullanılırken, yaralama yöntemimiz doğal bir enfeksiyon modunu yansıtır ve terapötik bileşiklerin taranması için çok uygundur.

[Anlatıcı] Başlamak için, kullanımı kolaylaştırmak amacıyla iki yemek çubuğunun üzerine 25 kalibrelik iğneler yerleştirin. Stereo mikroskop kullanarak anormal gelişim gösteren veya yaşayamayan embriyoları tanımlayın ve çıkarın. Kalan embriyoları merkezde toplamak için tabağı dairesel hareketlerle hareket ettirin. Şimdi, her embriyoyu izole etmek için dikey olarak yönlendirilmiş iki iğne kullanın ve vücudu düz tutmak için sol iğneyi kuyruğa konumlandırın. Sağ iğne ile yüzgeci çıkarmak için notokordun kenarında tek bir kesim yapın. Her kesimi hızlı bir şekilde tamamlayın ve tüm embriyoların 10 dakika içinde bakteri solüsyonuna daldırılmasını sağlayın. Enfeksiyon prosedürü için, Pseudomonas aeruginosa çözeltisini tip iki biyolojik güvenlik kabini altında vorteksleyin ve altı oyuklu bir plakaya mililitrede yedi koloni oluşturan birimin gücüne yaklaşık bir kez 10 oranında ekleyin. Yaralı embriyoları toplamak için tek kullanımlık bir cam Pasteur pipeti kullanın ve bunları bakteri solüsyonuna aktarın. Altı oyuklu plakayı 28 santigrat derecede 1,5 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, enfekte olmuş embriyoları alın ve yıkama için mikrobiyolojik güvenlik altına yerleştirin. Şimdi embriyoları cam pipetle metilen mavisi içermeyen 10 mililitre balık suyuna aktarın, transfer edilen hacmi en aza indirin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Daha sonra embriyoları tekrar bir cam pipetle metilen mavisi içermeyen dört mililitre balık suyuna aktarın ve kısa bir süre inkübe edin. Daha sonra, bir pipetle, enfekte embriyoları tek tek 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve her bir kuyucuğa metilen mavisi içermeyen bir mililitre balık suyu ekleyin. 24 oyuklu plakayı 28 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Enfekte olmuş her larva için 95 mikrolitre 1X PBS içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Planktonik bakterileri yıkamak ve uzaklaştırmak için larvaları metilen mavisi içermeyen dört mililitre balık suyu içeren altı oyuklu bir plakaya aktarın. Yıkanan her embriyoyu, mümkün olduğunca az sıvı aktararak PBS'li bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. Şimdi, her bir embriyoyu mikrosantrifüj tüpünün kenarına doğru ezmek için bir havan tokmağı kullanın ve daha sonra havan tokmağını tüpün içinde bırakın. Ardından, havan tokmağını kaldırın ve havan tokmağındaki kalan bakterileri durulamak için 100 mikrolitre %2 PBS Triton ekleyin ve %1'lik bir nihai konsantrasyon elde edin. Tüpü vorteksleyin ve 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, her embriyodan üç adet 10 mikrolitrelik seyreltilmemiş lizat damlasını LB agar plakalarına dağıtın. Her bir lizatı 96 oyuklu bir plakada eksi üç seyreltme gücüne 10'a kadar seri olarak seyreltmek için çok kanallı bir pipet kullanın. Son olarak, seyreltilmemiş lekelerin yanına üç adet 10 mikrolitrelik seyreltme damlası damlatın. Ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Dört kistik fibroz Pseudomonas aeruginosa izolatının tümü, PAO1 referans suşuna kıyasla yaralı embriyo modelinde önemli ölçüde daha az virülentti. İki izolatla enfekte olmuş embriyolarda, bakteri yükü üç gün içinde belirgin şekilde azaldı ve bu da bakteriyel eliminasyonu gösterdi. Buna karşılık, diğer iki izolat, B6513 ve RP73, ilk düşüşün ardından enfeksiyondan 18 ila 65 saat sonra nispeten stabil bir bakteri yükünü korudu ve bu da kalıcılığı düşündürdü. Enfeksiyondan 1,5 saat sonra tobramisin ile 30 dakikalık kısa bir tedavi, B6513 izolatları ile enfekte olmuş embriyolarda bakteri yükünü büyük ölçüde azalttı. Tobramisin, enfeksiyondan 24 veya 48 saat sonra uygulandığında bakteri yükü üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi ve kalıcı enfeksiyon aşamalarında direnç gösterdi.