Görüntüleme Patogenez ve Cording Deşifre ve Mycobacterium abscessus Zebra balığı Embriyolar

Bu prosedürün genel amacı, Mycobacterium abscessus suşlarının virülansını incelemek ve karşılaştırmak ve bu bakteriler ile konakçı doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimleri in vivo olarak şeffaf zebra balığı embriyoları kullanarak tanımlamaktır. Bu, önce homojen bakteri inoküler hazırlanarak gerçekleştirilir. Daha sonra, embriyolara döllenmeden 30 saat sonra intravenöz olarak bakteri süspansiyonları enjekte edilir.

Ek olarak, makrofajların enfeksiyon kontrolündeki rolünü daha kesin bir şekilde incelemek için, makrofaj tükenmiş embriyolar oluşturmak için lipokoat bazlı bir enjeksiyon prosedürü kullanılır. Son olarak, enfekte embriyolar, enfeksiyonun ilerlemesini izlemek için floresan ve konfokal mikroskopi kullanılarak hazırlanır ve görüntülenir. Sonuç olarak, elde edilebilecek sonuçlar, floresan fagositik hücreler ile M apsesi arasındaki, ya tek tek bazi ya da şeffaf bir embriyo içindeki serpantin kordonları olarak spesifik etkileşimleri göstermektedir.

Zebra balığının fareler gibi diğer hayvan modellerine göre en büyük avantajı, enfeksiyon sürecini gerçek zamanlı olarak spesifik olarak araştırmaya ve mikrobakteri apseleri ile mikrofajlar veya nötrofiller arasındaki spesifik etkileşimleri incelemeye izin vermesidir. Bu adım, zebra balıklarında sonraki enjeksiyon basıncı için kritik bir konudur. Kaba mikobakteri absesinin büyük agregalar oluşturma ve kod üretme eğiliminin yüksek olması nedeniyle, mikroenjeksiyon öncesi homojen ve kantitatif olarak kontrollü inoküler hazırlamak için özel bir tedavi gereklidir.

M apsesi hazırlamak için, 150 santimetrekare doku kültürü şişelerinden katlanarak büyüyen kültürleri 50 mililitrelik steril plastik tüplere inoküler hasat edin ve 4.000 kez G ve oda sıcaklığında 15 dakika santrifüjleyin. Pelet ve Eloqua'yı yeniden süspanse etmek için OADC zenginleştirmesi ile desteklenmiş bir mililitre Middlebrook yedi H dokuz ve ayrıca ara 80 kullanın. 200 mikrolitre bakteri süspansiyonu, 26 gauge iğne ile 1.5 mililitrelik tüplere, her bir ALI bakteri süspansiyonu dörtlüsünü 15 kez homojenize eder.

Daha sonra bir su banyosu kullanarak, her biri on saniyelik aralarla 10 saniye boyunca üç kez sonikat yapın. Arasına, bir mililitre yedi H dokuz, orta ve kısaca girdap ekleyin, ardından üç dakika boyunca 100 kez G'de santrifüjleyin. Topaklanmayı önlemek için süpernatanlar içeren mikobakterileri dikkatlice toplayın ve homojen süspansiyonları 50 mililitrelik steril bir plastik tüpte çekin.

Süspansiyonu beş dakika boyunca 4.000 kez G'de santrifüjleyin ve peleti yeniden süspanse etmek için 200 mikrolitre yedi H dokuz orta kullanın, nihai bakteriyel aşılamayı değerlendirin. Metin protokolüne göre, bu yöntemin görsel gösterimi, adımların öğrenilmesi zor olduğu için kritiktir, çünkü zebra balığı embriyolarında enjeksiyonun mikroskop altında hassas bir şekilde manipüle edilmesi ve mikroenjeksiyon tekniğinin elde edilmesi, yaklaşık 24 saatte M apsesinin mikroenjeksiyonunu gerçekleştirmek için zaman gerektirmiştir. Döllenme veya HPF sonrası, embriyoları 100 milimetrelik bir Petri kabına kaplamak için cımbız kullanın ve onları 28.5 santigrat derecede tutun.

30 48 HPF embriyosunu, kırpılmış bir mikro yükleyici ucu ile litre başına 270 miligram trica içeren 25 mililitre balık suyu ile doldurulmuş V şeklinde bir konumlandırma odasına aktarın. Daha kolay manipülasyon için embriyoları kanallara düzgün bir şekilde yerleştirin. Mikrobakteriyel aşılamayı verilmesi istenen CFU'ya seyreltmek için 80 arasında% 0,05 olan PBST kullanın ve bir mikro yükleyici ucu ile uygun enjeksiyonu kontrol etmek için% 10 fenol kırmızısı ekleyin.

Beş ila 10 mikrolitre bakteri aşısı içeren bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. Mikroenjeksiyon iğnesini enjektöre bağlı bir mikro manipülatörün tutucusuna bağlayın ve iğnenin üst kısmını kırmak için ince cımbız kullanın. Beş ila 10 mikrometre arasında bir açıklık çapı elde etmek için.

Mikroenjeksiyon basıncını ve süresini ayarlayarak enjeksiyon hacmini kalibre edin. Daha sonra gerekli enjeksiyon hacmini elde etmek için, bir embriyonun yumurta sarısına atılan bir damlacığın çapını ölçün ve bu damlacık, coddle venine mikro enjeksiyon yapın. Embriyoyu ventral tarafı iğneye bakacak şekilde konumlandırın ve iğne ucunu ürogenital açıklığa yakın yerleştirin.

Ve iğnenin ucunu, sadece coddle ven bölgesini delene kadar yavaşça embriyonun içine itin. Ardından, genellikle nanolitre başına yaklaşık 100 CFU içeren bir ila üç nanolitre olmak üzere istenen hacimde bakteri süspansiyonu verin. Lipo Choate, makrofajların ve embriyoların 24 HP'de tükenmesini gerçekleştirmek için embriyoları metin protokolüne göre inkübe edin ve izleyin. Kader, embriyolar ve onları trica ile balık suyu ile dolu bir enjeksiyon kabına aktarın.

Sonra sırt taraflarını aşağı doğru yönlendirin. Lipozom kapsüllü klononat çözeltisini girdapladıktan sonra, mikro kılcal iğneyi yükleyin ve enjeksiyon hacmini kalibre edin. Daha önce gösterildiği gibi coddle ven bölgesini delin ve iki ila üç litre çözelti enjekte edin.

Enjeksiyonu üç kez tekrarlayın. Embriyoları 28.5 santigrat derecede inkübe edin ve enfekte etmeden önce makrofajların uygun şekilde tükenmesini kontrol etmek için floresan mikroskobu kullanın. Bu videoda daha önce gösterildiği gibi, istenen zaman noktasında koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları numaralandırmak için.

Enfeksiyon koşulu başına beş embriyo toplayın ve her embriyoyu 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Kriyo, embriyoları litre başına 300 ila 500 miligram ötenazi yaptıktan sonra 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ederek embriyoları uyuşturur. Trika. Embriyoları yeni bir tüpte iki kez yıkamak için steril su kullanın.

Daha sonra, her embriyoya bir XPBS'de% 2 Triton X 100'de suyu çıkardıktan sonra ve tam lizis için dokuyu homojenize etmek için 26 gauge bir iğne kullanın. Süspansiyonu santrifüjledikten sonra, peleti yeniden süspanse etmek için bir X-P-B-S-T kullanın. Daha sonra Middlebrook yedi H 10 OADC üzerinde homojen plakanın seri seyreltilmesi.

B-B-L-M-G-I-T Panta ile desteklenmiş, M apse enfeksiyonunun canlı görüntülenmesi için kolonileri saymadan önce plakaları dört gün boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin, trica anestezisi uygulanmış embriyoları ters mikroskop için 35 milimetre cam tabanlı bir Petri kabında %1 düşük erime noktalı aros'ta monte edin veya dik konfokal mikroskopi için tek boşluklu bir depresyon slaytı. Embriyoyu istenen pozisyona yönlendirin ve M apsesi enfeksiyonunun sabit görüntülenmesi için katılaşmış arosları trica içeren balık suyu ile kaplayın. Embriyoları ötenazi yaptıktan sonra, onları 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve embriyoları iki saat boyunca bir XPRT'de% 4 Paraform aldehit içinde sabitleyin.

Oda sıcaklığında, dokuların bütünlüğünü ve floresansı art arda korumak için embriyoları bir X-P-B-S-T ile 10 dakika boyunca iki kez yıkayarak paraform aldehiti çıkarın. Embriyoları, koşul başına 10 dakika boyunca artan gliserol çözeltisi konsantrasyonlarında inkübe edin. % 50 gliserol içine gömülü embriyoyu bir görüntüleme odasına yerleştirin.

Son olarak, embriyonun sıralı floresan edinimi ve iletim görüntülemesi için 10 x objektifli bir floresan mikroskobu veya 40 x veya 63 x objektifli bir floresan konfokal mikroskop kullanın. Kaba ve pürüzsüz M apse varyantlarının virülansını araştırmak ve karşılaştırmak için, 30 HPFC yetkin embriyoya intravenöz olarak floresan bakteriler enjekte edildi. Pürüzsüz varyantın aksine, kaba olan, merkezi sinir sistemi içinde apse gelişimi ile daha sağlam ve ölümcül bir enfeksiyona neden olur.

Virülanstaki farklılıklar ya CFU'nun numaralandırılmasıyla ya da ilişkili floresan piksel sayılarının belirlenmesiyle ölçüldü. Bu şekilde görüldüğü gibi, kordon oluşumunun kinetiği, video mikroskobu ile noninvaziv bir şekilde izlenebilir ve görüntülenebilir, bu da kaba varyantın burada gösterildiği gibi hücre dışı olarak çoğalma eğilimini gösterir. Makrofaj tükenmiş embriyoların kaba M apsesi ile enfeksiyonu, bakteri yüklerinde ve kordon üretiminde büyük bir artışa ve hızlı larva ölümüne yol açar.

Bu, makrofajların ve M apsesi arasındaki etkileşimleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için M apsesi enfeksiyonunu kontrol etmek için makrofajların gerekli olduğunu açıkça göstermektedir. Kırmızı floresan makrofajlar üreten EG one M kiraz transgenik hattı kullanılabilir. Enfeksiyonlar, tek tek bakterilerin etkili fagositozu ile belirgin bir makrofaj alımına neden olurken, mikobakteriyel kordlar, geliştirildikten sonra fagositoza uğramamak için apseler tarafından geliştirilen bir stratejiyi temsil eder.

Bu teknik, yeni bir bağışıklık kaçış mekanizması olarak kodlamanın önemli rolünü keşfetmenin yolunu açtı. Zebra balığı enfeksiyon köstebeği sayesinde, mycobacterium apselerinin patogenezinde kodların in vivo katkısını gözlemlemek ve tanımlamak artık mümkün hale geliyor.