Elektroporasyon eşiklerinin miktarının belirlenmesi için yüksek verim yeteneğine sahip üç boyutlu doku modeli

Araştırmamız, kanseri tedavi etmek için elektroporasyon, özellikle bipolar mikrosaniye darbeleri kullanmaya odaklanmaktadır. Şu anda yumuşak doku ablasyonuna bakıyoruz, ancak aynı zamanda bu darbeleri kullanarak in vivo transfeksiyona da geçiyoruz. Protokolümüz aslında geri dönüşü olmayan ve tersine çevrilebilir elektroporasyon eşiklerini daha verimli bir şekilde görüntülemenizi sağlar.

Ayrıca küp tabanlı bir sistemden biraz daha iyi olabilir çünkü 3B ortam yerine 2B olarak görmemizi sağlar. Ve 3 boyutlu bir ortam, dokuda göreceğimize çok daha benzer olacaktır. Gelecekte, bu modelde gördüklerimizi in vivo olarak tercüme etmeye çalışacağız ve bu modelin gerçekte yaptığı şey, DNA aşıları, kemoterapiler ve CRISPR-Cas9 sistemleri gibi şeyleri sunmaya çalıştığımızda yapacağımız parametre seçimlerini bilgilendirmek.

Başlamak için, hücre süspansiyonunu ve gerekli reaktifleri bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Hazırlanan hücre süspansiyonunu tip 1 sığır kollajen solüsyonu ile 1:1 oranında iyice karıştırın. Erken polimerizasyonu önlemek için karışımı buz üzerine veya soğuk boncuk banyosuna koyun.

Ardından, 12 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğunun tabanını kaplamak için 500 mikrolitre birleşik çözeltiyi pipetleyin. Jelin her bir kuyucuğun duvarlarına temas etmesini sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Jelleri, 37 santigrat dereceye ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 karbondioksit ile 6 saat veya jeller sertleşene kadar inkübe edin.

Ardından, kuyu plakasını eğin ve her bir oyuğa yavaşça 500 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve plakanın duvarından aşağı kaymasına izin verin. Plastik yem bağlantısını iki adet 1.64 milimetre 304 paslanmaz çelik küt uçlu şırınga iğnesinden çıkarın. Pim elektrodu olarak hizmet etmek için bir iğneyi bir kenara koyun.

Diğer iğne için bir ucun son 5 milimetresini düzleştirin. Ardından, halka elektrodu oluşturmak için bir kuyu plakasının dibine aynı hizada oturacak kadar uzun, 19 milimetre çapında 316 paslanmaz çelik borunun bir bölümünü kesin. Elektrot bileşenlerine uyması için CAD yazılımını kullanarak bir elektrot tutucu tasarlayın.

Elektrodu monte etmek için halka ve pim elektrotlarını elektrot tutucuya takın ve halka elektrodu sabitlemek için iğneyi düzleştirilmiş ucu tutucuya bastırarak takın. Bir biyogüvenlik kabininde, hazırlanan plakayı eğin ve her bir kuyucuktan 400 mikrolitre kültür ortamını aspire edin. Aspire edilen kuyucuklara mikrolitre başına 20 mikrolitre 5 mikrogram yeşil floresan protein plazmit çözeltisi ekleyin.

Çözeltinin jel yüzeyine eşit şekilde yayılmasını sağlamak için plakayı yavaşça döndürün. Jelleri 37 santigrat dereceye ayarlanmış nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 karbondioksit ile 10 dakika inkübe edin. Ardından, fiber optik sıcaklık probunu pim elektroduna yerleştirin ve sıcaklığı kaydetmeye başlayın.

Elektroporatörün pozitif ucunu pim elektroduna ve negatif ucunu iğneye bağlayarak halka elektrodu sabitleyin. Şimdi sıcak plakayı açın ve 37 santigrat derecelik bir sıcaklığı korumak için jelleri ısıtın. Daha sonra monte edilmiş halkayı ve pim elektrodunu sıcaklık probu ile birlikte kuyuya yerleştirin ve jelin 37 santigrat derece sıcaklığa ulaştığından emin olun.

Tedaviyi uygulamak için elektroporatörü etkinleştirin. Daha sonra kuru görünen jellere 100 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve işlenmemiş jelleri elektriklendirmeye devam edin. Tüm tedaviler tamamlandıktan sonra, jelleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 10 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, plakanın duvarı boyunca her bir oyuğa yavaşça 500 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Jelleri nemlendirilmiş inkübatörde 24 saat boyunca tekrar inkübe edin. Plakayı eğin ve kültür ortamını her bir kuyudan aspire edin.

Ardından, plakanın duvarları boyunca her bir oyuğa yavaşça 500 mikrolitre PBS ekleyin. Jelleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile 5 dakika inkübe edin. Ardından, PBS'yi her kuyudan aspire edin.

Plakanın duvarından aşağı kaymasına izin vererek her bir oyuğa yavaşça 500 mikrolitre PBS ekleyin. Plakayı yavaşça döndürün, ardından eğin ve PBS'yi her bir kuyudan aspire edin. Şimdi, jelleri görüntüleme için nemli tutmak için her bir oyuğa 100 mikrolitre taze PBS ekleyin.

Ardından, standart floresan mikroskopi tekniklerini kullanarak plakayı görüntüleyin. Görüntülemeden sonra, plakanın her bir oyuğuna 500 mikrolitre kültür ortamı ekleyin ve 24 saat inkübe edin. Belirlenen her zaman noktası için tam görüntüleme ve kurtarma iş akışını tekrarlayın.

Hesaplamalı bir model oluşturduktan sonra, dikey ve yatay eksenler boyunca simit şeklindeki bölgenin hem dış hem de iç kenarlarının çapını ölçmek için mikroskop yazılımını kullanın. Sırasıyla dış ve iç çapların ortalamasını alın ve karşılık gelen yarıçapları hesaplamak için 2'ye bölün. Son olarak, önceden oluşturulan arama tablosunu kullanarak, ölçülen yarıçaplardaki elektrik alan yoğunluğunu türetin.

Transfekte edilmiş bölgenin dış yarıçapı, tersinir elektroporasyonu veya RE eşiğini, hesaplamalı bir modelden elektrik alan yoğunlukları ile ilişkilendirerek ölçmek için kullanıldı. İç yarıçap, geri dönüşü olmayan elektroporasyon veya IRE eşiğini belirlemek için kullanılırken. Üç bipolar mikrosaniye darbe protokolünün tümü, açıkça görülebilen RE ve IRE sınırlarına sahip simit şeklinde transfeksiyon bölgeleriyle sonuçlandı.

Test edilen dalga biçimleri arasında 2-1-1 patlama dengeli dalga biçimi en yüksek IRE eşiğini oluştururken, 2-1-1 dengesiz dalga biçimi en düşük eşiği gösterdi. 420 volt kullanan standart bir monopolar elektroporasyon protokolü, santimetre başına 642 voltluk bir RE eşiğine sahip dairesel bir transfeksiyon bölgesi ile sonuçlandı, ancak hücre ölümü üretemedi ve IRE eşiğinin belirlenmesini engelledi. Jel bozunması nedeniyle zamanla doku deformasyonu, transfekte edilen bölgelerin dairesel şekillerini kaybetmesine neden olarak doğru RE ve IRE ölçümünü zorlaştırdı.

Halka ve pim elektrotlarının kuyunun dibi ile yanlış hizalanması da asimetrik dairesel olmayan transfeksiyon modelleri üreterek eşik ölçümünü zorlaştırdı.