E. coli'den Elastin Benzeri Polipeptitlerin (ELP) Organik Çözücü Bazlı Ekstraksiyon ve Çökeltme Yöntemi Kullanılarak Verimli Arındırılması

Bu araştırmanın kapsamı, çözücü ekstraksiyon çökletinin ELP füzyon proteinlerini hızla arındırıp füzyon aktivite fonksiyonunu koruyup koruyamayacağını sorarmaktadır. Son gelişmeler arasında, gelişmiş endotoksin kontrolüyle hızlı çözücü bazlı ELP arındırması yer alıyor; bu da hedefli nükleik asit teslimatı için aktif kendiliğinden oluşan nanopartikülleri mümkün kalıyor. Başlamak için, E.coli hücre pelletinden bir gram tartın.

Hücre pelletini yeniden süspansiyona almak için dört mililitre taze hazırlanmış lizis tamponu ekleyin. Pelet tamamen dağınıp tampon ile karışana kadar nazikçe vortex yapın. Hücre duvarı sindirimine yardımcı olmak için yeniden süzülmüş hücrelere yaklaşık beş miligram lizozim ekleyin.

Sonra tüpü buz üzerine koyun ve bir saat kuluçka yapın. İnkubasyon sonrası, beş saniyelik aralıklarla mikro uçlu sonikatör kullanarak örneği sonikle soniklendirin. Örneği buz üzerinde tutun ve sonikasyona devam edin, görünür partiküllerden arındırılmış uniform bir lizat elde edilene kadar genellikle beş ila sekiz dakika boyunca.

Sonikat lizatını 10.000 G'de 20 derece Celsius sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjlenerek netleştirin. Sonra çözünür fraksiyonu içeren üst yüzey maddesini, çözünmeyen fraksiyonu içeren peletten dikkatlice ayırın. Süpernatanttan 10 ila 20 mikrolitre pipet yapın ve eşdeğer bir kütlesi lizin tamponunda yeniden askıya alın.

Her iki fraksiyonu 4x Laemmli tamponu ile karıştırarak son 1x konsantrasyona ulaşın. Sonra süspansiyonu 95 derece Celsius'ta beş dakika boyunca ısıtın. ELP ağırlıklı olarak çözünürse, arıtılmış üst üstten organik çözücü ekstraksiyonuna devam edin.

Çözücü ekstraksiyonunu yapmak için, hava kurutulmuş pellet veya üst parçaya dört mililitre organik çözücü veya çözücü karışımı ekleyin. İkili çözücü karışımları için, bire bir kombinasyon için her birinden iki mililitre gibi kesin hacimsel oranlar kullanın. Süspansiyonu bir dakika boyunca sertçe girdabla vurarak peletin içine doğru çözücü nüfuzunu sağlayın.

Şimdi, karışımı 20 derece Celsius sıcaklığında beş dakika kuluçka edin, böylece hücre dışı proteinler toplanır ve ELP organik fazda çözünür. Numuneyi 13.000 G'de, 20 derece Celsius sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjlenerek çözünmeyen proteinleri çözünmeyen kalıntılardan ayırın. Süpernatantı dikkatlice toplayın, çünkü peleti rahatsız etmeden çünkü içinde çözünmüş ELP bulunur.

Toplanan süpernatantın hacmini tam olarak ölçün ve yağağa hazırlanın. Sonra, protein çökeltmesi için üst yüzeye hacminin 2,33 katı olan aseton veya asetonitril ekleyin. Karışımı 20 derece Celsius'ta beş ila yedi dakika boyunca kuluçka yapın.

Örneği 10.000 G'de, 20 derece Celsius sıcaklığında 10 dakika boyunca santrifüjlendirin. Sonra süpernatantı atıp pelleti ya hafif bir azot gazı akışı altında 10-15 dakika ya da kapalı olmayan santrifüj tüplerini ters olarak tüy içermeyen mendillere 20 derece Celsius'ta bir saat boyunca yerleştirerek kurutabilirsiniz. Kurutulmuş protein pelletini 50 mikrolitre PBS içinde yeniden askıya alın.

Sonra tam çözünmeyi sağlamak için nazikçe yukarı aşağı pipetleyin. Yeniden süspansiyona uğramış proteini kısa ve orta süreli kullanım için eksi 20 derece Celsius sıcaklığında sakla. SDS-PAGE kullanarak doğrulama yapmak için önce saflaştırılmış proteini 4x SDS-PAGE yükleme tamponu ile karıştırın.

Homojenlik için kısa bir süreliğine çözgücü vortex yapın. Örneği, ELP ve TEEN için 10%SDS-PAGE jeline yükleyin; bu jel korizmatlaşarak mutazı birleştirir. Jeli 100 ila 120 voltta çalıştırın, ta ki takip dalışı dipte ulaşana kadar.

Şimdi, jeli InstantBlue Coomassie boyası veya uygun bir alternatif ile 20 derece Celsius'ta iki saat boyunca boyayın. Şeffaf bir arka plan oluşana kadar deiyonize suyla durulayın. Organik ekstraksiyondan önce bir liz adımından sonra 100 kilodalton ağırlığında öne çıkan bir ELP ve TEEN, korosmat mutaz bandı olarak birleşmiştir.

Farklı organik çözücü kombinasyonları, ELP ve TEEN'in birleşerek korizmatlaşmış mutazın çeşitli ekstraksiyon verimlilikleri ve saflıklarına yol açtı. AG ve BG bire bir karışımları en yüksek protein geri kazanımı sağladı. AG çözücü ekstraksiyonu elde edilen ELP ve TEEN korun mutaza için birleştiğinde, ITC ile saflaştırılmış proteine kıyasla enzimatik aktivitesinin yaklaşık %80'ini korudu; BG ise yaklaşık %50 aktivite korudu ve V40 kontrolü neredeyse hiç aktivite göstermedi.

Önemli bulgular arasında, organik çözücü ekstraksiyon çökletinin düşük endotoksinli ELP füzyonları hızla arındırdığı ve füzyon protein aktivitesini koruduğu gösterilmiştir. Bu protokol, E.Coli'den ELP füzyonları ile veya onsuz çok adımlı ITC olmadan hızlı deterjansız yöntemlerin eksikliğini ele alır. Bu protokol, E.coli pelletlerinden doğrudan tek aşamalı hızlı bir arındırma sunar ve füzyon protein fonksiyonunu korurken yüksek derecede saf, düşük endotoksinli ELP füzyonları sağlar.