Leptospira Biyofilmlerinin Nicel, Yapısal ve Fonksiyonel Analizi İçin Modüler İş Akışı

Biyofilmleri çevresel ve konak kalıcılığını sağlayan koruyucu yapılar olarak inceleyerek oluşum dinamiklerini, moleküler bileşimini, adaptasyon özelliklerini ve enfeksiyona katkısını inceliyoruz. Laboratuvarlarımızda kristal biyografi testi, zaman metin görüntüleme, konfokal mikroskopi, taramalı elektron mikroskobu ve transkriptomiği birleştirerek, entegre çok boyutlu analiz yoluyla biyofilm araştırmalarını ilerletmektedir. Başlangıç olarak, Leptospira hücrelerini EMJH ortamında düz tabanlı vida kapaklı cam tüplerde yetiştirin.

Kültürleri 30 derece Celsius sıcaklığında aerobik koşullarda sarsmadan orta logaritmik faza ulaşana kadar kuluçka yapın. Kültürlerin 405 nanometrede 0,2 ile 0,4 arasında optik yoğunluğa ulaşmasını sağlayın; bu, mililitrede sekiz hücrenin gücüne iki ila beş çarpı 10 katına karşılık gelir. 20 x büyütmede karanlık alan mikroskobu kullanarak, hücrelerin modal olup olmadığını ve kümelenmiş olmadığını doğrulayın.

Doğrulanmış orta log aritmik faz kültürünü taze EMJH ortamında bire 100 oranında seyreltirin ve yaklaşık 10 kat altı hücre gücüne karşı mililitre kadar elde edilir ve girdap oluşturmadan inversiyon yoluyla nazikçe karıştırılır. Şimdi steril forseps kullanarak her kuyunun dibine bir 0,1 mikrometrelik steril hidrofilik polikarbonat membran yerleştirilin, kapaklı steril 24 kuyu bir plakaya yerleştirilin. Her kuyuya bir mililitre steril EMJH ortamı ekleyin ve membranı 30 derece Celsius'ta iki saat boyunca önceden ıslatın.

Sonra, her kuyidan bekletme çözeltisini zarı yerinden çıkarmadan çıkarın ve 1,5 mililitre seyreltilmiş bakteri süspansiyon ekleyin; böylece zar tabanda sağlam kalmasını sağlar. Sonra, nemi korumak için kuluçka makinesinin içine su dolu bir tepsi yerleştirin. Plakayı statik koşullarda 30 derece Celsius sıcaklıkta kuluçka altına alın, böylece biyofilm oluşumu sağlanır.

Yavaş büyüyen suşlar için tabakı üç haftaya kadar bırakmak. İstenilen zaman noktasında, biyofilmi rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok kültür ortamı dikkatlice aspire edin. Her birini bir mililitre steril PBS ile nazikçe durulayın ve zarı tabana yastık tutun.

Her kuyuya PBS'de bir mililitre %4 paraform aldehit ekleyin ve biyofilm örneklerini sabitlemek için 37 derece Celsius'ta 30 dakika kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra fiksajı çıkarın ve bir mililitre PBS ile iki kez nazikçe durulayın. Her kuyuya bir mililitre 0,1% ağırlık ve hacim kristal mor çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın, kapak kapının tamamen suya battığından emin olun.

Sonra her kuyudan kristal mor boyayı atın ve bir mililitre PBS ile iki kez durulayın. Plakayı eğip kalan tüm sıvıyı boşaltın. Plakayı oda sıcaklığında bırakın, alt tabaka tamamen kuruyana kadar hava kurusun, tercihen gece boyunca.

Sonra, her kuyuya hacim olarak %50 etanol ve %50 buzul asetik asitten oluşan 500 mikrolitre elucian tamponu ekleyin. Biyofilme bağlı lekeyi tamamen çözmek için pipet yapın. Şimdi, her örnekten 200 mikrolitreyi optik olarak berrak, 96 kuyruklu bir mikroplakaya aktarın.

570 nanometrede absorbansı ölçmek ve tüm adımlarda işleme alınan aşılanmamış kontrollerden arka plan değerlerini çıkarmak. En az üç teknik kopya için ortalama ve standart sapmayı kaydedin. Daha önce gösterildiği gibi biyofilmleri kuyu plakalarında alın.

%4 paraform aldehit ve %1 glutaraldehit içeren bir çözeltiyi pH 7.4 seviyesinde 0.2 mol sodyum tamponunda kuyulara ekleyin. Sabit örnekleri 37 derece Celsius'ta 30 dakika kuluçka yapın. Fiksasyonu çıkarın ve yüzeye bağlı biyofilmi korumak için PBS ile iki kez durulayın; böylece yüzeye bağlı biyofilm ayrılmayı en aza indirin.

Şimdi kapak kazını PBS'de seyreltilmiş %1osmiyum tetroksite batırın ve taramalı elektron mikroskopik kontrastını artırmak için bir saat kuluçka yapın. Sonra substratı PBS ile iki kez durulayın. Numuneleri, her biri sırayla 10 dakika boyunca derecelendirilmiş etanol serilerine batırarak kurutun.

Sonra, 500 mikrolitre heksametildisilazan ekleyin ve beş dakika kuluçka yapın. Sonra yerine taze heksametildisilazan ile değiştirin ve beş dakika daha kuluçka yapın. Sonrasında fazla çözeltiyi çıkarın ve numuneyi bir duman davlumbağı altında tamamen hava kurutmasına izin verin.

Şimdi kurutulmuş örnekleri, çift taraflı iletken karbon bant kullanarak taramalı elektron mikroskopi kutularına monte edin. Sputter, örnekleri yaklaşık 10 nanometre altın veya platin ince bir tabakayla kaplayarak görüntüleme için elektron kontrastını artırır. Son olarak, hazırlanan sapları uygun örnek tutucuyla taramalı elektron mikroskobuna yükleyin.

Mümkünse görüntüleme kalitesini artırmak için odayı gece boyunca tahliye edin. Daha sonra, biyofilmin ultra yapısını görselleştirmek için uygun büyütmelerle beş ila 15 kilovolt arasında ikincil elektron görüntüleri alın. 21 günlük kuluçkadan sonra, kristal mor boyama, hem polikarbonat filtrelerde hem de leptospira interrogans ve leptospira biflexa için cam kapak kapaklarında görünür biyofilm desenleri ortaya çıkardı.

Her tür, nokta benzeri, dallanan veya torlu formlar gibi kendine özgü mimari ayak izleri sergiler. 570 nanometre absorbans ölçümleri, leptospira byflexa biyofilmlerinde leptospira araştırmalarına kıyasla tüm zaman noktalarında daha fazla kristal violet tutulmasını doğruladı, bu da suşta daha yüksek biyokütle birikimi olduğunu gösteriyor. Leptospira interrogans biyofilmlerinin taramalı elektron mikroskopisi, üç günlük biyofilmlerde erken ekstrasellüler matris birikintilerini, 14 günlük üç boyutlu yapıya sahip olgun ve kanalize bazal yüzeyi ve yoğun mimariyle 21 gün boyunca tam gelişmiş matris konsolidasyonunu yakaladı.

Optimize edilmiş protokolümüz, aynı kültürlerden tamamlayıcı okumaları senkronize eder, dayanıklılığı artırır, değişkenliği azaltır ve dinamik ile yapısal bilgileri ortaya çıkarır ve tek yöntemli yaklaşımlarla erişilebilir hale gelir. Tamamlayıcı analizi entegre ederek, bulgularımız biyofilm değerlendirmesini standartlaştırdı, leptospira dinamikleri ve mimarisini netleştirdi. Yapıyı virülansla ilişkilendirir ve tekrarlanabilir karşılaştırmalı araştırmaları güçlendirirler.

Gelecekteki mutantlar, regülasyonu biyofilm morfolojisi ve dinamikleriyle ilişkilendirmek, çevresel kalıcılığı netleştirmek ve biyofilm bilgisini bozan veya yayılmayı teşvik eden stratejileri değerlendirmek.