Floresan Füzyon Protein Tabanlı Raporlayıcı Kullanılarak Genotoksin Kaynaklı PARP1/PARP2 Aktivasyonunun Hücrelerde Görselleştirmesi ve Nicel Analizi

Laboratuvarımız, normal ve dönüştürülmüş hücrelerde PARP1 ve PARP2'ye bağlı DNA onarım ve DNA hasar yanıt yollarını incelemektedir. Alandaki bir zorluk, hücrelerde PARP1 ve PARP2 aktivasyonunun nicel analizi ve hücre lizisinden kaçınmaktır. Bu, subhücre lokalizasyon çalışmalarına olanak tanır.

Başlamak için, 1,5 mililitrelik steril mikrosantrifüj tüpüne 375 mikrolitre fetal sığır serumu ve Penisillin-Streptomisin serbest DMEM ekleyin. Sonra, tüpe 10 mikrolitre lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ve gerekli tüm plazmidleri ekleyin. Mikrosantrifüj tüpünü nazikçe dokunarak ortamı, transfeksiyon reaktivini ve plazmid DNA'sını karıştırın.

DNA ve transfeksiyon reaktif kompleksi oluşumu için oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika kuluçka yapın. Sonra, plazmid ve transfeksiyon reaktif karışımını, kültürlenmiş 293FT hücreleri içeren 60 milimetrelik kaba damla olarak ekleyin ve hücreleri 48 saat boyunca kuluçka makinesine geri gönderin. Sonra, transfekte edilen 293FT hücrelerden kültür ortamını toplayın.

Lentivirüs parçacıklarını izole etmek için, toplanan ortamı steril bir 0,45 mikrometrelik filtreden geçirerek hücre kalıntılarını lentiviral parçacıklardan ayırın. Transdüksiyon için, istenen hücreleri 24 saat boyunca kültürlendirin ve hücre birleşiminin %20 ile %40 arasında olduğunu doğrulayın. Sonrasında, 15 mililitrelik konik bir tüpe bir mililitre virüs, bir mililitre büyüme ortamı ve iki mikrolitre Polybrene ekleyin; bu tüpe nazikçe ters çevrilerek karıştırılır. Şimdi, altı kuyu tabakasından büyüme ortamını çıkarın.

Her kuyuya virüsü, medium ve Polybrene karışımını ekleyin. Transdüksiyon karışımı içeren hücreleri, 32 derece Celsius ve %5 karbondioksit sıcaklığında nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine 16 ila 18 saat boyunca yerleştirin. RNF146 amino asitlerinin ifadesini doğrulamak için, 100 ila 182 EGFP, bir kültür kabında 200.000 LivePAR ekspresyon hücresi tohumu ve örtü kapakları bulunması.

Hücrelerin örtü kapaklarına yapışmaları, ortamı koşullandırması ve çoğaltmaya başlaması için 24 ila 36 saat bekle. Sonra LivePAR eksprese eden hücreleri verilen reaktiflere maruz bırakın. Bileşikleri doğrudan kapak kapaklarındaki hücreleri içeren ortama ekleyin ve karışımları dağıtmak için hücre kültür tablarında ortamı nazikçe karıştırın.

60 milimetrelik kapları 37 derece Celsius'ta 60 ila 90 dakika boyunca kuluçkaya geçirin. Hücreleri sabitlemek için ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca PBS ile %4 formaldehit ile önekleyin.

Formaldehit çıkarıldıktan sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Sonra, hücrelere 7:3 oranında üç mililitre soğuk metanol ve aseton ekleyerek onları sabitleyin. Tabakları dokuz dakika boyunca eksi 20 derece Celsius sıcaklığında koyun.

Sonra, metanol aseton çözeltisini çıkarın. Hücreleri PBS ile üç kez yıkandıktan sonra, DAPI içeren 15 mikrolitre antiifade ortamını cam slayta pipetleyin. Kapak kaydırmasını hücreler içe bakacak şekilde montaj ortamına nazikçe monte edin, böylece kabarcıkları en aza indirin.

Kapak kaygısını cam sürgüye ortalayıp sabitleyin ve kenarlara az miktarda şeffaf üst kat tırnak minesi uygulayarak kenarları kapatın. Sürgüleri karanlığa yerleştirin ki tırnak minesi kurusun. Image J'yi indirip kurduktan sonra, Eklentiler'e tıklayarak, Makrolar seçerek ve Install'i seçerek Image J'yi açın ve makro metin dosyasını LivePAR_Macro yükleyin.

Tüm konfokal dosyaları Image J'de açın ve orijinal dosyaları korumak için TIFF dosyası olarak kaydedin. Sonra, bir tablo belgesini açın ve Date_CellLineFociAnalysis olarak kaydedin. Bir TIFF dosyasını tek tek analiz edin.

Çekirdekleri bulmak için 1'e basın. ROI yöneticisi penceresi açıldığında, tüm girişleri seçin ve ekle tuşuna basarak çekirdek alanını orijinal görüntünün üzerine bindirin. Yanlış tanımlanmış çekirdekleri silinin ve çerçeve içinde tam olmayan çekirdekleri hariç tutun.

Sonra, Freehand Selection aracı ile çekirdeği çizin ve PAR odaklarını nicelendirmek için 2 tuşuna basın. ROI yöneticisinde her çekirdeği seçin ve çekirdek başına odak sayısını sayın. Dosyadaki tüm çekirdekleri puanladıktan sonra nicel verileri açık tablo belgesine kopyalayıp yapıştırın.

Benzer şekilde, tüm TIFF dosyaları için analizi tekrarlayın. Tamamlandığında, tercih ettiğiniz yazılımda çekirdek başına PAR odaklarını çizin. Araç kontrol hücrelerinde pansellüler EGFP boyama görüldü.

Genotoksin ile işlenmiş hücrelerde, çekirdek içinde lokalizasyonu temsil eden nükleer odakların biriktiği görüldü. PARP1 ve PARP2 inhibitörü veliparib ile ön tedavi PAR odaklarının kaybına yol açtı. Çekirdek başına PAR odak sayısının zaman ve tedavi koşulları fonksiyonu olarak nicelendirilmesi de benzer sonuçlar göstermiştir.

Bu protokol, genotoksinlere ve genetik değişiklikleri takip eden PARP1 ve PARP2 sinyal ekseninin aktivasyonunu nicelikle ölçememize olanak tanır. Bu testle geleneksel immünofluoresans teknikleri kullanarak poli ADP-riboz ile proteinlerin kolokalizasyonunu doğruladık. İleriye dönük olarak, bu testi PARP1, PARP2 veya PARP inhibitörlerinin yüksek verimli analizi için genotoksisite testleri ve PARP1 ile PARP2 sinyalizasyonunda yer alan yeni faktörleri belirlemek için kullanıyoruz.