Name: Floresan Füzyon Protein Tabanlı Raporlayıcı Kullanılarak Genotoksin Kaynaklı PARP1/PARP2 Aktivasyonunun Hücrelerde Görselleştirmesi ve Nicel Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-04-17T13:48:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Öğrenin, genotoksin kaynaklı PARP1/PARP2 aktivasyonunu canlı hücrelerde görselleştirmek ve nicel olarak analiz etmek için floresan füzyon protein tabanlı raporlayıcı kullanımını. Bu yöntem DNA onarım dinamiklerini incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>Reaktifler, Kimyasallar ve Peptitler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m Durapore steriflip filtreler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>20 x 20 mm Mikroskop kapak camları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 22-170-371</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A18-1</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakaları, 100 mm</td><td>VWR</td><td>Cat# 25382-166</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakaları, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat# 430166</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü plakaları, 6 kuyulu</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-161</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial, 2 mL</td><td>VWR</td><td>Cat# 89499-722</td><td></td></tr><tr><td>Dietil eter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 60-29-7</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# BP231-1</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık steril filtreler, 0.45 &micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SE1M003M00</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>Cat# 15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 proof</td><td>Decon Labs</td><td>Cat# 2701</td><td></td></tr><tr><td>Cam mikroskobu slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Isıyla inaktive edilmiş fetal boğa serumu</td><td>Atlanta Biologics</td><td>Cat# S11150</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen klorür</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Higromisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10687010</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Kim Wipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Cat# 34256</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X GoStix Plus Kiti</td><td>Takara</td><td>Cat# 631280</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# A452SK-4</td><td></td></tr><tr><td>MNNG</td><td>Molport</td><td>Cat# N493990</td><td></td></tr><tr><td>NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihidroksi-5-(hidroksimetil) tetrahidrofuran-2-il]-4H-piridin-3-karboksamid)</td><td>Marie Migaud veya&nbsp; NuChem Sciences Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PARG inhibitörü (PDD00017273)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# SML1781</td><td></td></tr><tr><td>PARPi inhibitörü (Veliparib, ABT-888)</td><td>MedChemExpress&nbsp;</td><td>Cat# HY-10129</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/streptomisin</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>tBuOOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 180345000</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-x2 (Transfeksiyon reaktifi)</td><td>Mirus</td><td>Cat# MIR-6006</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>VWR</td><td>Cat# 0694</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield (H-1000) anti-fade montaj ortamı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# NC1695563</td><td></td></tr><tr><td>Hücre hatları&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>293-FT&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>(SV40 büyük T antijeni ile dönüştürülmüş insan embriyonik böbrek hücrelerinden türetilmiş)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# R70007</td><td></td></tr><tr><td>LN428&nbsp;</td><td>Generöz hediye</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>(İnsan glioblastoma tümör hücre hattı)</td><td>Dr. Ian Pollack (Pittsburgh Üniversitesi)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>(İnsan hTERT-ölümsüzleştirilmiş retinal pigment epitel hücreleri)</td><td>ATCC</td><td>Cat# CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>U2OS&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>(İnsan osteosarkom hücre hattı)</td><td>ATCC</td><td>Cat# HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMDLg/pRRE</td><td>Lab stock# 253</td><td>Addgene, Cat# 12251</td><td></td></tr><tr><td>pRSV-Rev</td><td>Lab stock# 254</td><td>Addgene, Cat# 12253</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Lab stock# 252</td><td>Addgene, Cat# 12259</td><td></td></tr><tr><td>pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR, RNF146'nın WWE alanıdır, amino asit kalıntıları 100-182, EGFP ile kaynaştırılmıştır; bir Higromisin direnci kasetini içerir)</td><td>Lab stock# 1727</td><td>Addgene, Cat# 176063&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Yazılım ve Algoritmalar&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator (şekillerin hazırlanması için)</td><td>Adobe Systems</td><td>Version 2024</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Version 10.5.0&nbsp;(Mac OS X)</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>https://imagej.net/ij/download.html</td><td></td></tr></tbody></table>

floresan füzyon protein tabanlı raporlayıcı kullanılarak genotoksin kaynaklı parp1/parp2 aktivasyonunun hücrelerde görselleştirmesi ve nicel analizi

Visualization and Quantitative Analysis of Genotoxin-Induced PARP1/PARP2 Activation in Cells Using a Fluorescent Fusion Protein-Based Reporter

Floresan Füzyon Protein Tabanlı Raporlayıcı Kullanılarak Genotoksin Kaynaklı PARP1/PARP2 Aktivasyonunun Hücrelerde Görselleştirmesi ve Nicel Analizi

Poly(ADP-ribose) (PAR) is a polymer of ADP-ribose synthesized by four members of the ADP-ribose polymerase family of enzymes&#8212;PARP1, PARP2, PARP5a, ...

visualization-quantitative-analysis-genotoxin-induced-parp1parp2

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Canlı hücreler içinde ubiquitin-proteasome etkinliğini izlemek için bir yöntem tarif edilmektedir. A degron-İstikrarsızlaşmış GFP-(GFP-DGN) ve bir sabit GFP-dgnFS füzyon proteini oluşturulur ve bir lentiviral ifade vektörü kullanılarak hücre içine transdüksiyon ile uygulanır. Bu teknik, ubiquitin-proteasome etkinlik kolaylıkla Epifloresans ya da akış sitometrisi kullanılarak ölçülebilir hangi bir sabit GFP-dgn/GFP-dgnFS eksprese eden hücre soyu üretmek için olanak sağlar.

Yaşayan Hücreler ubikitin-proteozom Faaliyet Monitoring Degron (DGN)-destabilize Yeşil floresan proteini (GFP) tabanlı Muhabir Protein Kullanımı

Bu protokol, DNA hasarının yanı sıra, mitoz sırasında lokalizasyonu cevap olarak aktive bir çift iplikli DNA mola sinyal protein görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır.

DNA Hasarı Tepki Proteinler İki ve Üç Boyutlu Canlı Hücre Görüntüleme

Mitoz geçiren kanser hücrelerinde fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir. PJ-34 eradike insan meme kanseri MDA-MB-231 mitoz İlave sentrozom barındıran hücreler. Normal iki odak mitoz farklı olarak, ekstra-sentrozom PJ-34 varlığında iki kutup mili kümelenmiş değildi.

Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

Bu protokol lazer microirradiation DNA hasar, nispeten basit kırılmalara ve DNA hasar sinyal ve onarım faktör montaj hasar sitelerde içinde vivo çalışmaya karmaşık hasarı gibi farklı türde ikna etmek için nasıl kullanılacağını açıklamak için hedeftir .

Vivo hücresel yanıt-e doğru basit ve karmaşık DNA hasarı incelemek için lazer Microirradiation

Bu iletişim kuralı açıklar caspase Bimolecular floresan uluslara (BiFC); Başlatan caspases, indüklenen yakınlığı hangi onların harekete geçirmek için ilk adımdır görselleştirmek için kullanılan bir görüntüleme tabanlı yöntemi.

Caspase harekete geçirmek Bimolecular floresan uluslara kullanarak yolları kadar aydınlatma

Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

Bu makalede, toplama üzerinde floresan proteinlerin etkisi ve hızlı değerlendirme bağlamında yeni uncharacterized floresan protein misfolded polyglutamine genişlemesi floresan gazetecilere toksisitesi değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar.

Floresan proteinlerin etkisi Polyglutamine toksisite deneyleri Maya kullanılarak füzyon ortakları

DNA hasarının ardından, insan hücreleri genomlarının bütünlüğünü geri yüklemek için gerekli onarım yollarını aktive ederler. Burada, dolaylı immünoffloresan yöntemini DNA onarım proteinlerini tespit etmek, mekansal ve zamansal işe alımlarını analiz etmek ve DNA hasarı nın olduğu yerlerde protein-protein etkileşimini sorgulamaya yardımcı olmak için bir araç olarak tanımlıyoruz.

DNA Onarım Proteinlerinin İmmünfluoresan Etkileşiminin Görselleştirilmesi

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Bu çalışmada, teratojenik kimyasalları tanımlamak için bir in vitro hücre testi sunuyoruz. Fibroblast büyüme faktörü (FGF)/serum yanıt faktörü (SRF) sinyallemesinin dinamikleri, insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) raportör hücrelerinde ölçüldü ve teratojenite riski, bu sinyal yolunun kimyasal bozulması ölçülerek değerlendirildi.<br...

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde fibroblast büyüme faktörü sinyal bozulmasının gerçek zamanlı izlenmesine dayalı gelişimsel toksisite testi

Öğrenin, genotoksin kaynaklı PARP1/PARP2 aktivasyonunu canlı hücrelerde görselleştirmek ve nicel olarak analiz etmek için floresan füzyon protein tabanlı raporlayıcı kullanımını. Bu yöntem DNA onarım dinamiklerini incelemeye yardımcı olur.

Floresan Füzyon Protein Tabanlı Raporlayıcı Kullanılarak Genotoksin Kaynaklı PARP1/PARP2 Aktivasyonunun Hücrelerde Görselleştirmesi ve Nicel Analizi (Video) | JoVE Journal

Floresan Füzyon Protein Tabanlı Raporlayıcı Kullanılarak Genotoksin Kaynaklı PARP1/PARP2 Aktivasyonunun Hücrelerde Görselleştirmesi ve Nicel Analizi

Daha fazla video keşfet