Name: Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Öğrenin, HeLa hücrelerinde yüksek verimli floresans tabanlı analizle plazma zarı yeniden mühürleme verimliliğini ölçme yöntemini. Bu teknik, membran onarım mekanizmalarını ve ilaç tarama çalışmalarını destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Lütfen bazı ön deneyler için onun çok modlu algılama platformu kullanmak izin verdiğiniz için Dr Jesse Kwiek (Ohio Devlet Üniversitesi) anıyoruz. Bu makalesinde bildirilen araştırma Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları Ulusal Sağlık Enstitüleri Stephanie Seveau için ödül numarası RO1AI107250 altında tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

1. hazırlık
<ol><li>Hücre kaplama Not: İnsan servikal epitel hücreleri, HeLa ve histon 2B-GFP (H2B-GFP), ifade HeLa Bu protokol için kullanılan, ancak bu tahlil için diğer memeli hücreleri19adapte edilebilir.<ol>
<li>Yapisan bir 75 cm2 hücre kültür şişesi hücrelerinden % 0.25 tripsin-EDTA 2 mL hücrelerle yıkayarak bağlantısını kesin. Kullanılan tripsin taze tripsin-EDTA %0.25 2 mL ile değiştirin.</li>
		<li>Hücreleri yuvarlak ve balonun müstakil kadar 5 min için 37 ˚C hücreleri kuluçkaya.</li>
		<li>8 mL büyüme orta (DMEM % 10 ısı inaktive fetal Sığır serum, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin içeren) hücrelerde resuspend.</li>
		<li>Bir hemasitometre ve hücre süspansiyon 10 µL kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek.</li>
		<li>2. 5 x 105 hücre/mL bir konsantrasyon büyüme ortamına hücrelerde sulandırmak.</li>
		<li>Hücre süspansiyon steril pipet Havzası dökün ve bir 10 mL serolojik pipet kullanarak süspansiyon iyice karıştırın.</li>
		<li>12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları kullanma, HeLa hücreleri (2. 5 x 104 hücreleri/100 µL/iyi) nüsha (veya quadruplicate) bir 96-şey düz, açık alt, siyah polistren doku kültürü tedavi tabağına dağıtın. Not: Bir kaplama düzenleme Şekil 1' deki bir örnek olarak sunulur.</li>
		<li>Hücreleri oksijen hücre kültür kuluçka 37 ˚C ve % 5 CO224 h için kültür.</li>
	</ol></li>
	<li>Hisse senedi eriyik hazırlığı
	<ol>
<li>Hanks dengeli tuz solüsyonu, 0.476 g MgCl2 (5 mM), 95 gr ekleyerek 10 x stok arabelleği (M1 ve M2 hazırlamak için kullanılır) M 1 L hazırlamak ve HEPES (100 mM) 23.83 g 900 mL su için. 1 L. filtre sterilize birime yükseltmek ve pH 7.4 için ayarlayın.</li>
		<li>50 mL 50 (1.25 M) stok glikoz x 11,26 g D-(+) ekleyerek hazırlamak-glikoz toplam 50 mL su için. Filtre çözümü sterilize.</li>
		<li>Bir 100 (120 mM) stok kalsiyum x 50 mL 50 mL su için toplam CaCl2 0.666 g ekleyerek hazırlayın. Filtre çözümü sterilize.</li>
		<li>10 (50 mM) stok etilen glikol-bis(2-aminoethylether)-N, N, n x 50 mL hazırlamak ', N', EGTA, 0.951 g 40 mL su ekleyerek tetraacetic asit (EGTA). PH 8 EGTA çözülmeye NaOH kullanarak artırmak, sonra 50 mL birime yükseltmek. Filtre çözümü sterilize.</li>
		<li>Tek bir 96-şey plaka için orta 1 50 mL hazırlamak (M1, içeren Ca2 +), Orta 2 50 mL (M2, Ca2 +-özgür) ve orta EGTA ile buna göre takıma 2 15 mL:<ol>
<li>M1 için 10 x arabellek M, 100 x CaCl20.5 mL ve 50 x glikoz 1 mL 5 mL 43,5 mL su ekleyin.</li>
			<li>M2 için 10 arabellek M x 5 mL ve 1 mL 50 x glikoz 44 mL su ekleyin.</li>
			<li>M2/EGTA için 10 x arabellek M ve 10 1,5 mL 1,5 mL ekleyin x EGTA 12 mL su için. Not: tüm çözümler propidium iyodür (PI) içeren hücrelere doğrudan eklemeden önce hazırlanmalıdır.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Plaka okuyucu/görüntüleme sitometresi ayarları Not: iki algılama birimleri ile donatılmış bir Multi-Mode plaka okuyucu kullanın: bir spectrofluorometer ve bir görüntüleme sitometresi. Photobleaching fluorophores önlemek için floresans maruz kalma sınırı.<ol>
<li>37 ° c plaka okuyucu tahlil yapmadan önce önceden ısıtmak.</li>
		<li>Buna göre kinetik tahlil için parametreleri ayarlamak içinde ayarları modu:<ol>
<li>Monokromatör, FL (floresan)ve kinetik için optik yapılandırma seçin, modları okumak ve türü, sırasıyla okuyun.</li>
			<li>Dalga boyu ayarları' nın altında bir 9 ve 15 nm uyarma ve emisyon bant, seçmenizi sağlar. Propidium iyodür (PI) kullanarak deneyleri için uyarma ve emisyon dalga boylarında sırasıyla 535 ve 617 nm için ayarlayın.</li>
			<li>Plaka türü' nün altında 96 Wells için plaka formatı ve siyah-duvar açık alt plaka için karşılık gelen önceden ayarlanmış plaka konfigürasyonu seçin.</li>
			<li>Okuma alanıaltında kinetik incelenecek wells vurgulayın.</li>
			<li>Devresel_ödeme ve optikaltında belgili tanımlık birden parlamak 6 okuma başına önceden ve alttan okumaiçin kutuyu işaretleyin.</li>
			<li>Zamanlamaaltında 00:30:00 30 dk kinetik tahlil için Toplam çalışma süresi kutusuna ekleyin ve 00:05:00 aralığıiçin ekleyin. Not: her zaman için gelin ve bir dalga boyu, okuma, bir tam 96-şey plaka zamanı 30 s.</li>
			<li>Sağdaki Ayar bilgileri belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam' ý seçin. Kinetik başlatmak için basın okuma çalıştırın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Buna göre görüntüleme parametreleri ayarlama içinde ayarları modu:<ol>
<li>Minimax, görüntülemeve son nokta için optik yapılandırma seçin, modları okumak ve türü, sırasıyla okumak.</li>
			<li>Dalga boylarındaaltında ışık iletilenve ya da her ikisi 456/541 uyarma ve emisyon boyları için karşılık gelen floresans kutularını seçin nm (GFP) ve 625/713 nm (PI).</li>
			<li>Aynı seçenekleri 1.3.2.3 ve 1.3.2.4 adımlarda tanımlanan Plaka tipi ve Okuma alanı için kullanın.</li>
			<li>De alan ayarıaltında yansıması için bir kuyu içinde sitelerin sayısı seçin. Not: 12 siteleri tam iyi resim karşılık gelir.</li>
			<li>Görüntü alma ayarlarıaltında ışık, 541 (GFP) ve 713 (PI) aktarılan pozlama süreleri seçin. GFP için iyi bir pozlama süresi 20 ms/görüntü ile tüm görüntü. İçin iletilen ışık (TL) ve PI floresan, sırasıyla her şey Merkezi'yle pozlama süreleri 8 ile 20 ms, tek bir görüntü elde etmek.</li>
			<li>Sağdaki ayarları bilgilerinde belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam' ý seçin. Satın alma için her şey (12 resimler/de) bir 96-şey plaka tüm yüzey düşsel ve bir dalga boyu için ~ 15 dk. görüntüleme başlatmak için basın okuma zamanı. Not: Bir tek görüntü/iyi bir 96-şey plaka satın alma saati için bir dalga boyu ~2.5 min/plaka gerektirir. Yukarıda açıklanan parametreleri belirli ekipmanları bizim laboratuvar ile karşılık gelir. Spectrofluorometric ölçümler: 1.0 nm artış uyarma dalga boylarında (250-850 nm) ayarlanabilir bir 9-15 nm bant ile görüntüleme bir xenon flaş lamba bir photomultiplier tüp bulmak &gt; 6 ile oturum dinamik alan ve ayarlanabilir 15 veya 25 nm salma bant. Sitometresi görüntüleme: bir aydınlatma ışık kaynağı beyaz ışık, 460 yetenekli nm ve 625 nm uyarma boyları 20 nm bant, 541 merkezli emisyon filtreleri ile nm (108 nm bant) ve 713 nm (123 nm bant), sırasıyla, bir 4 X amaç birleştiğinde bir 1,25 megapixel 12-bit şarj kuplajlı cihaz fotoğraf makinesi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. tahlil
Not: tahlil zaman hücrelerin % 70-90 birleşmesi olması gerekir. Yıkama adımları sırasında Orta kaldırıldı ve oldukça (doğrudan üzerinde hücreler) yan duvarına uygulanan gerekir. LLO sıcaklıkta onun toplama kadar adım 3.1.5 önlemek için &lt; 4 ˚C korumak.
<ol><li>30 µM PI M1 stokunun hazırlamak ve 30 µM PI m2 hisse senedi 37 ˚C önceden ısıttı.</li>
	<li>Plaka 1 12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları, aşağıdaki gibi kullanarak hücreleri nazikçe yıkayın:<ol>
<li>Onarım keyfi koşulları için hücreleri 200 µL/iyi M1 ile iki kez önceden 37 ˚C ısındı büyüme orta ve yıkama kaldırın. Orta 100 µL/30 µM PI içeren kuyu ile sıcak M1 değiştirin.</li>
		<li>İçin kısıtlayıcı koşullar onarmak, büyüme orta kaldırmak ve 5 mM 200 µL/iyi M2 ile bir yıkama ardından Ca2 +, şelasyon yapın EGTA içeren hücreleri 200 µL/iyi sıcak M2 ile yıkayın. 30 µM PI içeren orta 100 µL/iyi sıcak M2 ile değiştirin.</li>
		<li>Büyüme orta yıkanmış ve propidium iyodür içeren orta yerine sonra doğrudan 2.1.3 adım taşıyın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntü plaka 1 iletilen ışık, GFP ve PI altında 1.3.3 (önceden kinetik) altında ayrıntılı olarak. Bu adım 15-20 dakika sürer.</li>
	<li>2.1.3. adımda 15dk döneminde plaka 2 12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları aşağıdaki gibi kullanarak hazırlayın:<ol>
<li>96-şey yuvarlak alt Polipropilen Mikroplaka buza koyun. 1 (Şekil 1) plaka için karşılık gelen bir deneysel tasarım kullanarak plaka yapılandırın.</li>
		<li>Onarım keyfi koşulları için 100 µL/60 µM 100 ek tarafından takip PI içeren kuyusu buz gibi M1 eklemek µL/4 x LLO veya denetim için içeren kuyusu buz gibi M1.</li>
		<li>Onarım kısıtlayıcı koşullar için 100 µL/60 µM 100 ek tarafından takip PI içeren iyi buz gibi m2 eklemek µL/iyi buz gibi m2 4 x LLO veya denetim için içeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemen plaka 1 (2.1.3. adım) görüntüleme sonra buz, buz ile doğrudan temas plaka ayırmak için alüminyum folyo kullanarak yerleştirin. Plaka 1 5 dakika soğumasını sağlar.</li>
	<li>12-çok kanallı micropipette ve 200 µL ipuçları kullanma, 100 µL plaka 2 (adım 2.1.4) karşılık gelen kuyu 1 plaka içine her kuyudan transfer. Düzgün toksin plaka 1 medya dağıtmak için menisküs aşağıdaki ipuçlarını yerleştirin ve nazikçe kabarcıklar tanıtımı olmadan ses çıkarma. Not: Bu yanlışlıkla hücreleri ayırmak gibi yukarı ve aşağı, pipet değil.</li>
	<li>Toksin hücrelere bağlamak ve hemen spectrofluorometer modu (adım 1.3.2) kullanılarak kinetik tahlil için plaka okuyucu için plaka 1 aktarmak izin vermek ek bir 1 dk plaka bırakın.</li>
	<li>Kinetik tahlil sonunda görüntü plaka 1 (sonrası kinetik) kullanarak hemen adım 1.3.3.</li>
</ol>3. analiz: Hücre numaralandırma
<ol><li>Mikroplaka hücre numaralandırma yazılımını kullanarak nükleer floresans üzerinde temel hücre sayısını belirler.<ol>
<li>Ayarları, içinde Re-analizseçin ve Görüntü analiz ayarları içinde Kategori bölümünde Gizli nesne çözümleme 541 nesneleri bulmak için dalga boyu kullanarak seçin.</li>
		<li>Yöntem, bulgu görüntülerde çizmek kullanarak nesneleri bul seçeneği içinde çekirdek ayarları sekmesinde seçin ve Uygulatuşuna basın.</li>
		<li>Tamam ve okuma algoritması sayma hücre başlatmak için tuşuna basın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternatif olarak, böyle bir aracı kullanılabilir durumdaysa, hücreleri numaralandırmak için ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanın.<ol>
<li>ImageJ içinde bir yığın görüntü dosyasını açın.</li>
		<li>Yığın görüntü menü çubuğu, türü, üzerine getirin'ı tıklatarak 8 bit gri tonlamalı görüntülere dönüştürmek ve 8-bitseçin.</li>
		<li>Arka plan çıkarmak: tıklayın görüntü menü çubuğunda hover üzerinde ayarlamave Parlaklık/kontrastseçin. Arka plan gürültü çıkarmak ve Uygulaseçmek için en düşük değer ayarlayın.</li>
		<li>İkili görüntüler oluşturmak için eşik: menü çubuğunda tıklayın görüntü üzerinde ayarlamaüzerinde ve eşikseçin. Koyu arka planseçin, minimum ve maksimum eşik değerlerini ayarlayın ve Uygula' yı tıklatın.</li>
		<li>Çekirdeklerin üst üste söz konusu olduğunda, bir dönüm noktası aracı segment çekirdekler için kullanılabilir. Menüde, ikili üzerine getirin işlemi ' ı tıklatın ve dönüm noktasıseçin. Not: Bu otomatik olarak bağlı çekirdeği ayıracak.</li>
		<li>Kullanıcı tarafından belirtilen ölçütü (boyut ve döngü) çekirdeği tanımlaması rafine ve hücre artıkları dışlamak için uygulama tarafından maskeli görüntüleri analiz.<ol>
<li>Analiz üzerinde menü ve ardından Çözümle parçacıklar' yi tıklatın. İstediğiniz boyuta ayarla (piksel ^ 2) ve (1 değeri olan tam bir daire) Döngüsellik aralıkları tek tek hücreler/çekirdek dahil etmek yeterlidir.</li>
			<li>Göster açılır liste kutusunda, istediğiniz seçenekleri seçin, özetlemekontrol ve hücre sayısı elde etmek için Tamam ' ı tıklatın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analiz: Kinetik eğrileri
<ol><li>Kinetik plaka okuyucu yazılımı bir analitik veri yazılım baðlamanýz gerekebilir.</li>
	<li>Deneysel her koşul için çoğaltır karşılık gelen standart sapma ve deneysel her koşul için Ortalama, standart hata ile birlikte her timepoint, floresans yoğunluklarda ortalama.</li>
	<li>Deneysel her koşul için karşılık gelen kinetik eğrisi izleme: PI yoğunluğu (y ekseni) zaman (x ekseni) karşı.</li>
	<li>Verilen tedavi durumu resealing verimliliğini hesaplamak için (AUC) eğri altındaki alan hesaplamak + LLO M1 (AUC(M1)) ve + LLO m2 (AUC(M2)). Yeniden mühürlemeden verimliliğini (E) değerlendirmek için aşağıda önerilen yaklaşım kullanın: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58351/58351eq1v2.jpg">
</li>
	<li>Verimlilik oranı (REff) aşağıda belirtilen malzemelerini kontrol ve test tedavi arasında bir karşılaştırma gerçekleştirir: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58351/58351eq2.jpg"> REFF = 1, test tedavi onarım üzerinde hiçbir etkiye sahip REFF &lt; 1, test tedavi engeller onarım REFF &gt; 1, test tedavi artırır onarım</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak eğri altındaki alan hesaplar: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58351/58351eq3.jpg">, nerede k takipler toplam sayısı.</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu tahlil membran hücre nüfus düzeyinde yüksek üretilen iş kapasitesi ile yeniden mühürlemeden etkinliğini ölçer. O-ebilmek var kullanılmış için hücresel bileşenleri veya membran onarım etkileyebilecek uyuşturucu kitaplıkları ekran. 96-şey plaka açıklanan tahlil kullanılan ama 384-şey plakalar için daha yüksek üretilen iş için uyarlanabilir. Floresans ölçümleri yapisan canlı hücreler aşırı hücre hücre dekolmanı, fiksasyon veya sonrası fiksasyon etiketleme floresans gibi işleme gerek kalmadan gerçek zamanlı olarak elde et...

Memeli hücre mekanik, ozmotik ve biyokimyasal stres plazma membran bütünlüğü kaybı sonuçlanan, tabidir. Hızlı ve verimli yeniden mühürlemeden olmadan, hasarlı hücreleri hızlı bir şekilde programlanmış veya nekrotik ölüme yenik. 1960'lardan beri çabaları işlem yeniden mühürlemeden plazma zarı anlamak için onun işlev bozuklukları ile ilişkili yıkıcı sonuçları tarafından motive edilmiş. Nitekim, bacak-korse kas distrofisi, diyabet ve Chediak-Higashi sendromu gibi hastalıkların mutasyonlar gen kodlama dysferlin, gelişmiş glikasyondan son ürünleri imalatı ve kusurları nedeniyle eksik plazma zarı onarım için bağlantılı olmuştur lizozomal ticareti düzenleyici CHS1, sırasıyla1,2,3,4,5,6. Ancak, bugüne kadar membran anlayışımızı yeniden mühürlemeden hala sınırlı7var. İlk çalışmalar membran yeniden mühürlemeden ekstraselüler Ca2 + ile hasarlı plazma zarı8,9,10akını tarafından başlatılır gösterdi. O zamandan beri birkaç ayrı ayrı Ca2 +-hücreleri yeniden mühürlemek için önerilen bağımlı mekanizmaları. Yama hipotez yara yakınlık içinde birbirleriyle ve bir yama11,12,13,14davranmaya hasarlı plazma zarı ile hücre içi veziküller sigorta öneriyor. İkinci bir model o kalsiyum-bağımlı ekzositozu öneriyor organellerin yara adlı bir site sphingomyelin plazma zarı dış kitapcıktaki ceramide dönüştürür lizozomal enzim asit sphingomyelinase bültenleri. Bu ani değişiklik lipid bileşiminde hasarlı bölge15,16,17endositoz ceramide tahrik sonuçlanır. Son olarak, üçüncü önerilen mekanizma endosomal kapalı18plazma zarı bud dışa dönük vezikül oluşumu tanıtmak taşıma (ESCRT) için gerekli karmaşık sıralama için bir rol içerir. Proteinler, sadece sınırlı sayıda bu modelleri tespit edildi ve onların makine daha fazla aydınlatılmamıştır gerekir.
Burada biz verimliliği yapisan memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden plazma zarı zarar tabi önlemler rekombinant listeriolysin O (LLO)19aracılı bir yüksek-den geçerek tahlil tanımlamak. LLO fakültatif intraselüler patojen Listeria Monositogenez20,21,22 tarafından salgılanan gözenek oluşturan bir toksin (SFT) ve MACPF/CDC aittir (membran atak kompleksi, perforin, ve kolesterol bağımlı cytolysin) süper. MACPF çoğu memeli gözenek oluşturan proteinleri ise KGK özellikle bakteriyel toksinler bağışıklık savunma dahil kendi patojenik yaşam23tanıtmak için ana bilgisayar hücrelerine de zarar gram-pozitif patojenler tarafından üretilen. KGK suda çözünen monomer sentez veya kolesterol için bağlama dimer plazma zarı sunmak ve en fazla 50 alt birimleri prepore bir kompleks oligomerize. Karmaşık prepore sonra 30-50 nm çapı24,25,26,27' deki yayılan bir β-varil gözenek oluşturan lipid bilayer genelinde β-iplikçikleri eklemek için yeniden düzenler.  Bu iri gözenekli hücre içinde ve dışında Cerayanlar iyonları ve küçük hücresel bileşenleri izin; Yine de, bazı çalışmalar daha küçük boyutları gözeneklerin de kurulan28,29,30olduğunu önerdi. KGK arasında LLO yüksek üretilen iş analizleri31,32için elverişli geri dönüşü olmayan pH ve sıcaklık bağımlı toplama dahil benzersiz özelliklerini görüntüler. LLO 4 ˚C, onun bağlayıcı hücreleri, ancak karmaşık gözenek oluşumu için izin veren bir sıcaklık hücre kültür orta eklenebilir. Gözenek oluşumu inisiyasyon sonra toksin moleküllerin membran için formu reaksiyonlar, düzlemde verimli difüzyon ve konformasyon remodeling gözenek üretimi dahil izin 37 ˚C sıcaklığa yükselterek eşitlenebilir. Bu nedenle, sıcaklık, hücre hasarı kinetik anahtarı izleyen plazma zarı bağlı toksin miktarına bağlıdır. Önemlisi, çözünür LLO (plazma zarı bağlı değildir) sıcaklık ilişkisiz toksin molekülleri silsin gereğini azaltır ve zaman içinde membran hasar ölçüde sınırlar 37 ˚C ulaştığında hızla ve geri dönüşümsüz toplar. LLO kolesterol için bağlar ve gözenekleri kolesterol açısından zengin membranlar oluşturur, son olarak, bu tahlil memeli hücreleri geniş bir mükellef olduğundan. LLO esas olarak gözenek oluşumu ile sinyal konak hücre etkiler akılda tutmak önemlidir birkaç istisna dışında hangi gözenek bağımsız hücre sinyallemesi33,34,35,36 oluşabilir ,37,38,39. Bu nedenle, olamaz faaliyetleri membran onarım sürecini etkileyebilir sinyal o LLO hariç.
Bu tahlil doğrudan hücre pasif yaralı hücreleri girer ve nükleik asitler ile ilişkilendiren bir kez son derece floresan olur bir hücre impermeant fluorochrome (Örneğin, propidium iyodür) birleşme ölçerek yaralama ölçüde değerlendiriyor . Bu nedenle, fluorochrome hücre yaralama, gerçek zamanlı analiz izin deney boyunca hücre kültür ortamında muhafaza edilebilir. Nükleik asit bağlama boya floresan yoğunluğu toksin konsantrasyon ile artacak ve toksin verilen konsantrasyona kadar tüm gözenekleri kurulur ve hücreleri tamamen tamir veya doygunluk ulaşılıncaya kadar zamanla artacaktır. Hücre dışı Ca2 + membran gözenekler yoluyla akını yeniden mühürleme için olmazsa olmaz bir olaydır. Bu nedenle, resealing verimliliği dolaylı olarak hücre kültür Ca2 + (onarım izin veren koşul) içeren bir Ca2 +' yaralama için orta yaralama karşılaştırarak kanıtı-ücretsiz Orta (onarım kısıtlayıcı durumu). Nükleik asit bağlama boya floresan yoğunluğu hücre konsantrasyonu her iyi doğru orantılı olduğundan, aynı toplama bütün Wells, tohum hücrelere önemlidir. Her şey hücrelerde önce ve sonra hücre dekolmanı, yüzen olarak, toplanan hücre veri yorumu karmaşık hale floresans okuma belirsiz oluşmaz emin olmak için tahlil numaralandırmak önemlidir. Hücreleri numaralandırmak için lokalize nükleer histon 2B-GFP (H2B-GFP) ifade hücreleri bu tahlil kullanılmıştır. Isı kontrollü, çok modlu, 37 ° C'de yaşam hücrelerinin mikroskopisi görüntüleme (96 veya 384-şey plaka biçimini kullanarak) hızlı, yüksek üretilen iş ölçümler floresans yoğunluklarını Mikroplaka Okuyucular birleştirmek İkinci hücre sayı saymak ve farklı hücre popülasyonlarının nihai oluşumu gözlemlemek için kullanılabilir.
Sonuçta, bu tahlil kullanıcılar tarafından tarama için ana bilgisayar molekülleri onların bilgi membran tamir mekanizmaları karmaşıklığı genişletme yeteneğini sağlar veya membran denetleyebilen exogenously eklenen bileşikler onarın. Aşağıdaki protokol için LLO maruz hücreleri resealing verimliliğini ölçmek için deneysel adımları açıklar ve verilen ilaç ya da yeniden mühürlemeden verimliliği hücresel tedavi etkilerini değerlendirmek.

<table><tbody><tr><td>SpectraMax i3x Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>i3x</td><td></td></tr><tr><td>MiniMax 300 Görüntüleme sitometresi</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>5024062</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Propidium İyodür</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL2</td><td></td></tr><tr><td>HeLa H2B-GFP</td><td>Millipore</td><td>SCC117</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA %0.25</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu Corning düz tabanlı siyah polistiren doku kültürü ile tedavi edilmiş plaka</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in dengeli Tuzları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4891</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>ISC BioExpress</td><td>0732-100G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz, HybriMax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5146-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Fizyolojik çalışma ortamlarında memeli hücreleri kez plazma zarı zarar görmesine neden mekanik ve biyokimyasal gerilmeler tabi. Bu zarardan karşılık olarak, karmaşık moleküler makineleri hızla bariyer fonksiyonu geri yüklemek ve hücre yaşam sürdürmek için plazma zarı yeniden mühürleyin. Bu alanda araştırma, 60 yaşında olmasına rağmen hala makine yeniden mühürlemeden hücre kapsamlı bir anlayış eksikliği. Hücresel bileşenleri belirlenmesi amacı ile bu denetim plazma zarı yeniden mühürleme veya yeniden mühürleme, artırabilir uyuşturucu biz verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer floresans tabanlı yüksek üretilen iş tahlil geliştirdik Mikroplaka içinde kültürlü. Plazma zarı zarar için bir model sistem olarak bakteriyel gözenek oluşturan toksin listeriolysin O (LLO), büyük 30-50 nm çapında proteinaceous gözenekleri kolesterol içeren formlar hücreleri maruz membranlar. Isı kontrollü çok modlu Mikroplaka Okuyucu kullanımı hızlı ve hassas spectrofluorometric ölçümleri, aydınlık alan ve floresan mikroskopi görüntüleme yaşayan hücrelerin birlikte sağlar. Bir membran impermeant nükleik asit bağlama fluorochrome tarafından yayılan floresan yoğunluğu kinetik Analizi yaralama ve verimliliği yeniden mühürlemeden hücre hesaplama için izin hücre nüfus düzeyinde yeniden mühürlemeden membran kapsamını yansıtır . Yapısal nükleer protein histon 2B, mikroplaka hesap numarasına olası değişimler için her şey bir floresan chimera hızlı ve için nihai sağlayan hücreleri numaralandırma için floresans mikroskobu görüntüleme sağlar farklı hücre popülasyonlarının tanımlaması. Bu yüksek üretilen iş tahlil ana bilgisayar genler için tarama yoluyla membran tamir mekanizmaları anlayışımızı genişletmek için beklenen veya exogenously eklendi güçlü bir araç bu denetim plazma zarı yeniden mühürleme bileşikleri olduğunu.

Doğruluk sayma hücre: HeLa hücreleri sık sık bir modeli memeli hücre satır olarak membran tamir mekanizmaları keşfetmek için kullanılır. Membran onarım hücre nüfus düzeyinde değerlendirirken, aynı toplama için uygun verileri yorumlama bütün Wells, plaka hücrelere önemlidir. Tahlil zamanda cep numaraları kuyular arasında eşdeğer olduğunu doğrulamak önemlidir. Yapısal GFP (H2B-GFP) erimiş histon 2B hızlı HeLa hücreleri floresan onların çekirdekleri tespiti dayalı hücreleri otomatik olarak n...

Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Bu test, plazma membran biyolojisi alanındaki önemli soruları ele almak ve hasarlı hücrelerin plazma zarLarını ne kadar verimli bir şekilde yeniden mühürleyebildiğini belirlemek için geliştirilmiştir. Bu teknik, plazma zarının yüksek verim kapasitesinde yeniden sızdırmazlık verimliliğini ölçmek ve plazma membranının yeniden mühürlemeye aracılık eden belirli proteinleri ve buna karşılık gelen yolları belirlemek için kullanılabilir. Steril bir pipet havzasıiçine büyüme orta süspansiyon mililitre başına beşinci HeLa hücrelerine 20 mililitre 2.5 kat 10 ekleyerek başlayın ve hücreleri iyice karıştırmak için 10 mililitre serolojik pipet kullanın.Daha sonra, 96-iyi düz, net alt, siyah polistiren doku kültürü tedavi plaka triplicate iyi başına hücrelerin 100 mikrolitre tohum için çok kanallı mikropipet kullanın. Tüm deneysel koşullar arasındaki karşılaştırmalar eşdeğer hücre sayılarını gerektirdiğinden, homojen bir hücre dağılımının başarılı bir deneyin anahtarı olduğunu unutmayın. 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka makinesinde 24 saat kaldıktan sonra, plaka okuyucuyu 37 santigrat dereceye ısıtın ve optik konfigürasyonu monokromatöre, okuma modunu floresana ve okuma türünü kinetik olarak ayarlayın.Dalga boyu ayarlarının altında, dokuz nanometre uyarma ve 15 nanometre emisyon bandpass'ı seçin. Propidium iyodür kullanarak yapılan tahliller için uyarma ve emisyon dalga boylarını sırasıyla 535 nanometre ve 617 nanometreye ayarlayın. Plaka türü altında, plaka biçimi için 96-wells seçin ve siyah duvar berrakalt plakası karşılık gelen önceden ayarlanmış bir plaka yapılandırması seçin.Okuma alanı altında, kinetik test boyunca analiz edilecek kuyuları vurgulayın. PMT ve optik altında, okuma başına yanıp söner önceden altı ayarlayın ve alttan okumak için kutuyu işaretleyin. Zamanlama altında, 30 dakikalık kinetik bir çalışma için toplam çalışma süresine sıfır saat 30 dakika ve sıfır saniye girin ve aralık için sıfır saat beş dakika sıfır saniye girin.Ayarlar bilgilerinde belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından kinetik çalıştırmayı başlatmak için oku'yu tıklatın. Görüntüleme parametrelerini ayarlar modu içinde ayarlamak için, optik yapılandırma için MiniMax'ı, okuma modu için görüntülemeyi ve okuma türü için bitiş noktasını ayarlayın. Dalga boylarının altında, iletilen ışığı ve deneysel uyarma ve emisyon dalga boylarına karşılık gelen uygun floresan kutularını seçin.Plaka türünü ve okuma alanını sadece gösterildiği gibi ayarlayın ve kuyu alanı ayarı altında, görüntülenecek bir kuyu içindeki site sayısını ayarlayın. GFP için görüntü edinme ayarları altında, görüntü başına 20 milisaniye lik pozlama süresiyle aygıtın tamamını iyi görüntüye göre ayarlayın. İletilen ışık için, sekiz milisaniyelik pozlama süresiyle her kuyunun merkezinin tek bir görüntüsünü elde edin.Propidium iyodür için, 20 milisaniyelik pozlama süresi ile her kuyunun merkezinde tek bir görüntü elde edin. Ardından ayarlar bilgilerindeki ayarları onaylayın ve Görüntülemeyi başlatmak için Tamam'ı tıklatın ve okuyun. Onarım izin koşulları için yüksek iş lenme floresan bazlı bir test kurmak için, hücreleri her kuyuda 200 mikrolitre 37 derece Santigrat M1 orta ile iki kez yıkayın ve ikinci yıkamayı attıktan sonra 30 mikromolar propidium iyodür ile takviye edilmiş 100 mikrolitre taze 37 derece Santigrat M1 ortamı ekleyin.Onarım kısıtlayıcı koşullar için, hücreleri bir kez 37 derece Santigrat M2 orta 200 mikrolitre ile iyi başına beş milimolar EGTA ile takviye ve sadece M2 orta 200 mikrolitre ile bir yıkama takip ile yıkayın. İkinci yıkama attıktan sonra, iyi başına 30 mikromolar propidium iyodür ile takviye taze 37 derece Santigrat M2 orta 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra plakayı aktarılan ışık, GFP ve PI'nin altında az önce gösterildiği gibi görüntüleyin.Plaka görüntülenirken, buz üzerine 96 iyi yuvarlak alt polipropilen mikroplaka yerleştirin ve sadece önceki plaka için gösterildiği gibi plaka yapılın. Onarım izin koşulları için, iyi başına 60 mikromolar propidium iyodür ile desteklenen buz gibi m1 orta 100 mikrolitre ekleyin ve iyi başına 4X listeriolysin O ile veya olmadan buz soğuk M1 100 mikrolitre eklenmesi izledi. Onarım kısıtlayıcı koşullar için, iyi başına 60 mikromolar propidium iyodür ile desteklenen buz gibi m2 orta 100 mikrolitre ekleyin ve iyi başına 4X listeriolysin O ile veya olmadan buz soğuk M2 100 mikrolitre eklenmesi izledi.Listeriolysin O'nun, birinci plaka buz üzerinde yken ve ikinci plaka hazırlanırken kinetik tözün başlamasından yaklaşık beş dakika önce buz üzerinde uygun deneysel konsantrasyonda hazırlanması zorunludur. İlk plaka görüntüleme bittiğinde, hemen buz üzerinde alüminyum folyo bir levha üzerine plaka aktarın. Beş dakika sonra, toksinin uygun dağılımı için karıştırmadan önce her kuyuda çözeltinin menisküs altına pipet uçlarını ekleyerek, ikinci plakanın her kuyudan 100 mikrolitreyi uygun şekilde soğutulmuş plakaya aktarın.Toksinin bir dakika lığına ana bilgisayar hücrelerine bağlanmasına izin verin ve spektroflorometre modunu kullanarak kinetik sonrası tetkik için ilk plakayı hemen plaka okuyucuya aktarın. Kinetik tararmanın sonunda, ön kinetik görüntülemede gösterildiği gibi plaka görüntüsünün kinetik sonrası görüntüsünü hemen elde edin. Çekirdek floresan dayalı hücre sayısını belirlemek için, ayarlar altında mikroplaka hücre numaralandırma yazılımı, yeniden analiz seçin ve görüntü analizi ayarlarında, nesneleri bulmak için bir dalga boyu olarak 541 kullanarak ayrık nesne analizi seçin.Nesneleri bul seçeneğinde, görüntüleri bulma yöntemindeki çizimi kullanın, çekirdekleri seçin ve uygula'yı tıklatın, ardından Tamam'ı tıklatın ve hücre sayma algoritmasını başlatmak için okuyun. GFP ekspresyonu, listeriolysin O tedavisinin varlığında veya yokluğunda propidium iyodür yoğunluğu ölçümlerini engellemez. Propidium iyodin ekspresyonu, kinetik öncesi analize kıyasla HeLA H2B-GFP hücrelerinde GFP floresan yoğunluğunda artış la kanıtlanan GFP floresans yoluyla kanayabilir.Daha da önemlisi, çekirdeklerin numaralandırmasında yer alan segmentasyon süreci GFP floresansındaki artıştan etkilenmediği için bu geçit hücre sayma işlemini etkilemez. Listeriolysin O yokluğunda, plazma membran bütünlüğü varlığı veya ekstrasellüler kalsiyum yokluğunda sabit kalır, kalsiyum varlığında listeriolysin O tedavi propidium iyodür floresan yoğunluğunda sürekli bir artış ile orta sonuçlar takviye. Ancak ekstrasellüler kalsiyum yokluğunda, propidium iyodür floresansında, membran tekrarsızlığının yokluğunu yansıtan önemli ölçüde daha dik bir artış vardır.Alternatif olarak, uzak kırmızı floresan ile bir karbocyanin nükleik asit bağlayıcı boya GFP ile spektral örtüşme en aza indirmek için propidium iyodür ikame edilebilir. Buna ek olarak, uzak kırmızı boya için daha büyük uyarma katsayısı gürültü oranı ve onarım izin ve onarım kısıtlayıcı koşullar arasında daha iyi bir çözünürlük için daha yüksek bir sinyal sergiler. Bu yordamı denerken, tüm tüplerin denemeden bir gün önce etiketleilmesi önerilir, çünkü bu sizi deney günündeki tüm reaktif hazırlığına hazırlayacaktır.Bu yordamı takiben, görüntü sitometrisi gibi diğer yöntemler ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir, örneğin gözenek oluşturan bir gözenek tüm hücrelere eşit şekilde zarar verir veya bazı hücreler diğerlerinden daha duyarlıdır. Bu teknik, geliştirildikten sonra, gözenek boyutunun farklı hücre tiplerinin onarım verimliliği üzerindeki etkilerini araştırmak için bulaşıcı hastalık ve plazma zarı onarımı alanlarında ki araştırmacıların önünü açmıştır.

high-throughput-measurement-plasma-membrane-resealing-efficiency

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Düzenlenmiş endositoz, hücre zarı proteinleri çoğunluğu yüzey ekspresyon düzeyleri yönetir. Burada, dopamin taşıyıcısı (DAT), polytopic membran proteini endositik hızını ölçmek için indirgenebilir, Membran geçirgenliği olmayan biyotinilasyon reaktifleri kullanmaktadır. Bu yöntem çoğu plazma membran proteinlerinin endositik oranını ölçmek için basit bir yaklaşımdır kolaylaştırır.

Tersinir biyotinilasyon Plazma Membran Protein endositik Oranları Ölçüm

Bu video, memeli hücrelerinde plazma zarının yeniden kapatılma verimliliğini incelemek için bir testi göstermektedir. Hücreler, hücre zarında gözenekler oluşturan bakteriyel gözenek oluşturan bir toksine maruz kalır. Hücre dışı kalsiyum iyonlarının varlığında, gözenek kalsiyum akışına neden olur ve zarın yeniden kapanması olaylarına neden olur. Yeniden mühürleme verimliliği, hücrelere yalnızca yeniden kapatılmış bir zar olmadan giren DNA bağlayıcı propidyum iyodür boyası kullanılarak...

Plazma Membranının Yeniden Sızdırmazlık Verimliliğini Ölçmek için İn Vitro Floresan Bazlı Bir Test

Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Proteolipozomlar, iyi tanımlanmış bir biyokimyasal ortamda yeniden oluşturulan saflaştırılmış kanalları ve taşıyıcıları incelemek için kullanılır. Bu proteinlerin aracılık ettiği akışı ölçmek için deneysel bir prosedür gösterilmiştir. Sulandırılmış proteinin fonksiyonel özelliklerini kantitatif olarak belirlemek için proteolipozomları hazırlama, kayıtları gerçekleştirme ve verileri analiz etme adımları açıklanmaktadır.

Bir Proteoliposome Tabanlı effluks Deney Cl Tek-molekül Properties belirleme<sup&gt; -</sup&gt; Kanallar ve Nakliyeciler

Burada, canlı hücrelerdeki integral zar proteinlerinin oryantasyonunu ve topolojisini belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu basit protokol, ilgilenilen protein ile GFP arasındaki kimeraların seçici proteaz duyarlılığına dayanır.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Sunulan protokol, gözenekleri kapsayan solvent içermeyen lipid çift katmanları kullanılarak tek taşıyıcı seviyesinde membran protein aracılı taşımanın analizini açıklar. Bu, yüksek derecede paralel veri toplama ve analizi ile birleştirilen toplu olarak üretilen nanopor dizi çiplerinin oluşturulmasıyla elde edilir ve gelecekte membran protein efektör taramalarının kurulmasını sağlar.

Membran Transport Tek Protein çözünürlükte Oldukça Paralel nanopore çip Sistemi Analiz Süreçleri

Hücre zarının iki fotonlu lazer ile yaralama membran yeniden mühürlemeden yeteneği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve birden çok hücre türü için uygulanabilir. Burada, vitro canlı İki fotonlu lazer ablasyon takip dysferlinopathy hasta hücrelerde membran yeniden mühürleme, görüntüleme için bir protokol açıklayın.

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

Burada, plazma zarı Derneği düzeyinin kantitatif analiz için periferik ilişkili protein fluorescently öğesini gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Yöntemi membran Hesaplamalı ayrışma ve plazma zarı floresan marker ile etiketli hücrelerdeki gözlenen sinyal sitoplazmik bileşeni dayanmaktadır.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Bu protokol, membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçerek elektrojenik membran proteinlerinin incelenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu tahlil, epitel hücre hatlarında endojen olarak eksprese edilen çoklu iyon kanallarının fonksiyonel olarak okunması için bir platform sağlar.

İki Epitel Hücre Hattında İki Endojen İyon Kanalının Yüksek Verimli Fonksiyonel Çalışması için Membran Potansiyelinin Floresan Bazlı Bir Analizi

Öğrenin, HeLa hücrelerinde yüksek verimli floresans tabanlı analizle plazma zarı yeniden mühürleme verimliliğini ölçme yöntemini. Bu teknik, membran onarım mekanizmalarını ve ilaç tarama çalışmalarını destekler.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

Daha fazla video keşfet