Name: İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-15T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Öğrenin, desteklenen düzlemsel lipid çift katmanları oluşturmayı ve TIRF mikroskobisi ile immünolojik sinaps oluşumunu görselleştirmeyi. Hücre adezyon proteinlerinin bağlanması ve sinaptik etkileşimlerin incelenmesi için değerli bir yöntemdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Lipidler hazırlanması <ol><li> Bir bilayeri üst broşüre proteinleri bağlamak için, Ni 2 + şelat lipidler, poli-histidin etiketleri ile rekombinant proteinler çapa. Bazı hücre tipleri, Ni 2 + kaplı bilayers non-spesifik olarak uyması, ancak T-hücrelerinin, T hücre aktivasyonu eğitimi için bu yöntemi en uygun hale yok . </li><li> Çift katlı lipid çözümü% 20 Ni 2 bir çözüm hazırlayarak yapılır + şelat lipid ve kloroform-metanol 1-2 ml cam tüp uygun miktarlarda% 80 fosfatidilkolin. <ol><li> Sıcak (30-37 ° C) su banyosunda azot gazı akışı altında çözücü buharlaşır. Bu genellikle 15 dakika sürer. </li><li> 90 dakika için lyophilizer kullanarak, yüksek vakum altında kalan herhangi bir çözücü çıkarın. </li></ol></li><li> % 2 N-oktil-glucoside karışık deterjan / fosfolipid miseller bir çözüm oluşturur Tris-tuzlu tampon, deterjan lipidler çözülür. Son fosfolipid konsantrasyonu 0.4 mM olmalıdır. Lipozomlar formu için, Tris-tuzlu su, deterjan ve form lipozomlar kaldırmak için 3 değişikliklere karşı bu çözüm dialyze. Biz genellikle 1 ml ile 6 mm çapında yaklaşık 10 kDa kapalı bir kesim Spectra / por # 2 tüp sipariş hacimleri ile çalışmak. Biz boru sıkma, herhangi bir hava kabarcığı s dışlamak için dikkatli . Biz genellikle bu çözüm steril filtre ve% 70 etanol steril eldiven kullanarak taşıma, temiz koşullar altında diyaliz. </li><li> Bu çözüm, kristal berraklığında olmalıdır. Oksidasyonu önlemek için argon gazı altında saklanır. Çözüm bulanık ise, o zaman çok duvarlı vezikül oluşturulan, yeniden başlatmanız gerekir. </li></ol> 2. ICAM-1 ve MHC düzlemsel bilayeri yatırılır ne kadar belirleme <ol><li> Deney kurmak için, ICAM-1 ve MHC çözünür protein belirli bir konsantrasyonda verilen Ni 2 + şelat çift katlı bir yüzey alanı ne kadar yatırılan belirlemek için ilk gerekli. Bunu yapmak için, mevduat bilayers 5 mikrometre çapındaki cam boncuklar, protein çözümleri ile cam boncuk koşullar altında inkübe yaklaşık görüntüleme için kullanılan akış hücreleri, ve bir akış immunofluorometric yöntemi ile bağlı protein yoğunluğu yüksek sesle okudum. </li><li> Floresein başına molekülünün bilinen numaraları ile FITC etiketli antikorlar bağlı yüzey proteinleri tespit etmek için kullanılır. Floresein standart boncuk akışını microfluorimeter kalibre etmek için kullanılır. </li><li> Biz koşulları kuracak yaklaşık bu antijen sunan hücrelerin ICAM-1 200 molecules/μm2 ve I-Ek-MCC91-103 kompleksi 0,2-20 molecules/μm2. </li></ol> 3. Düzlemsel bilayers oluşturulması için cam kapak fişleri Temizleme <ol><li> Düzlemsel bilayers lipozomlar cam sigorta kendiliğinden oluşması, ancak cam sadece düzgün bir şekilde temizlenir. </li><li> Piranha ile çalışırken, biz bir asit önlük ve ağır, aside dayanıklı eldiven dahil olmak üzere tam koruyucu kıyafet giyin. Dikkatlice organik atıklar, atık ayırma ve düzgün atmayın. </li><li> Asit Piranha çözüm hazırlamak için, kuru bir behere 75 ml konsantre sülfürik asit ekleyin ve dikkatlice 25 ml% 30 hidrojen peroksit ekleyin. Çözümü hızla 100 daha fazla ısınır ° C </li><li> 15 dakika boyunca çözüm kuru lamelleri bırakın. Çözüm çıkar ve her iki tarafta bir dakika için arıtılmış su ile durulayın. Arıtılmış su boşaltmak için bir vakum kaynağı kullanarak lamelleri Kuru. Piranha çözümü soğuk ve davlumbaz işaretlenmiş kapağı gevşek, sol Piranha çöp konteyneri, eklemek için izin ver. Lipozomlar, lamelleri ve proteinlerin tüm hazırlanır, immunolojik sinaps kurulacak hazırdır. </li></ol> 4. Bilayers Şekillendirme <ol><li> Bilayers formu için, laboratuvar Bioptechs FCSII odaları, entegre ısıtma avantajlara sahip kullanır. FCSII sistemi paslanmaz çelik bir kaide üzerinde birlikte kelepçeler, diğer tarafta akışkan oluk ile 0.5 mm üst conta, ısıtma için indiyum kalay oksit ile kaplanmış bir yüzey üzerinde microaqueduct slayt, mikroakışkan manifoldu, tozsuz bir 0.25 mm akış odası ve Piranha yüksekliği tanımlar conta bilayeri oluşan 40 mm yuvarlak lamel temizlenmelidir. </li><li> Bilayeri oluşan edildiği kapak kayma, yüksek hidrofilik ve temiz olması gerekir iken daha hidrofobik ise, microacqueduct slayt aslında daha iyi çalışır. Microaqueduct daha fazla hidrofobik, daha sonra saf su ile yıkama ve soğutma işleminden sonra tamamen bu kuruma yanı kullanır arasında, oda sıcaklığında 60 dakika süreyle% 1 HSA ile tedavi sağlanır yapma. Bu yordamı sola denatüre proteinlerin kaplama lipozom süspansiyon 1 ul yuvarlak, hemispherica formu sağlar&gt; 0.25 mm yüksekliğinde l bırakın. </li><li> Düz bir yüzey üzerine, yukarı doğru yönlendirilmiş tüpleri ile, akış hücresi ve form düzlemsel bilayers monte manifoldu yerleştirin. Sonra, 0 yerleştirin. 5 mm düz oturduğundan emin olmak için, akışkan tüpleri üzerine yerleştirilmiş delikli conta. Yavaşça microaqueduct tarafı yukarı bakacak şekilde akışkan kanalları ile conta üzerine yerleştirin ve slayt delikleri mikroakışkan tüpleri ile uyum doğrulayarak kadar, herhangi bir aşağı doğru basınç uygulayarak düz koltuklar emin olun. Kanal akışkan kanalları ile dizilmiş ve büyük hava boşlukları vardır böylece microaqueduct slayt üstüne bir dikdörtgen kesim ile tozsuz 0.25 mm conta yatırın. </li><li> Her damla merkez-merkez arasındaki mesafe 2.5 mm böyle bir model microaqueduct slayt yüzeyinde 5 x 1 lipozom süspansiyon ul damla yukarı bakacak şekilde yerleştirin. 5 lipozom damla farklı kompozisyonlar olabilir, ancak bu durumda sadece iki bilayers hiçbir Ni 2 + şelat lipidler ve% 10 Ni 2 + şelat lipidler. Oluşturacak </li><li> Bu damla sonra, kapağı tek hareketle yüzeyi aşağı kayma dikkatlice yerleştirin. Mümkün olduğunca çabuk tabanı üzerine sıkıştırın. Lipozom damla kapak kayma ile temas yapmalıdır. Bu kişi bilayers muhtemelen önceden oluşmuş beri, kırık; herhangi bir kusurlu bilayers kesintileri neden olabilir. </li><li> Mikroskop lamel konumlandırmaya yardımcı olması için microacqueduct slayt üzerinde birkaç küçük mürekkep lekeleri ile bilayers konumları işaretlemek için hatırlamak önemlidir. Sistem dengelenmiş olduğundan emin olmak için 20 dakika bekleyin. Esnek borular yaklaşık 20 cm ve 3-way stopcock bağlı 20 ml şırınga kullanarak tüm çözümler aktarın. Stopcock ve akış hücresi arasında ölü hacim en aza indirmek için kısa bir boru uzunluğu akış hücresi, stopcock başka bir bağlantı noktası. 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 5 mM glukoz ve% 1 insan serum albümin içeren tuzlu Hepes tamponlu şırınga doldurun. </li><li> Hiçbir hava kabarcıkları vardır, böylece Başbakan tüp ve stopcock. Akış hücreleri bağlayın ve hiç hava kabarcığı bilayeri üzerinden geçmek emin olun izlerken tek hareketle 5 ml ile itin. Şimdi, size bilayers olacaktır. </li></ol> : Bu video makale &quot;Amoeboid Locomotion Tema Üzerine Çeşitlemeler olarak İmmünolojik Sinapslar ve Kinapses Toplayıcı ve Geri Hunter&quot; destekler <a href="http://arjournals.annualreviews.org/action/doSearch?action=runSearch&amp;type=advanced&amp;result=true&amp;prevSearch=%2Bauthorsfield%3A%28Dustin%2C+Michael+L.%29" target="_blank">Michael L. Dustin</a> , <a href="http://arjournals.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.cellbio.24.110707.175226">Hücre ve Gelişim Biyolojisi Annual Review</a> , Cilt 24, 2008.

İmmünolojik sinapslar ve kinapse eğitim oluşumu için desteklenen düzlemsel bilayers

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Lenfosit ve antijen sunan hücreler arasındaki etkileşimleri taklit etmek için, poli-histidin etiketleri ile bilayeri üst broşüre rekombinant hücre yapışması ve MHC proteinleri çapa Ni2 + şelat lipidler kullanın. Düzlemsel bilayers, lipid hazırlama, cam yüzeyler bilayeri oluşturacak tedavi ve sonra lenfositler eklenecek bir akış-hücre içeren özel bir odasında bilayeri oluşturan tarafından üretilir. Sonra, bilayers Ni ve onun etiketli rekombinant proteinler ile tahsil edilir eklenir. Son olarak, lenfosit akış hücresi ve TIRF mikroskopi enjekte görüntü sinaps oluşumu ve mekanizmaları kullanılabilir kontrol T hücre hareket, reseptör sıralama siteleri, ve reseptör bozulması siteler.

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Burada, lipid bilyer üst broşür sinaps oluşumunu modüle ve sinaps oluşumu TIRF mikroskobu kullanarak görselleştirmek için bilinen hücre adezyon proteinleri demirleme için yöntemler göstermektedir.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Destekli düzlemsel çift katmanlar, bir immünolojik sinapstaki moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilecek güçlü araçlardır. Etkileşimleri taklit etmek için...

Merhaba, ben Geral Enstitüsü ve New York Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Mike Dustin. Bugün sizlere, immünolojik sinaps çalışmalarında kullanılmak üzere destekleyici planar biyokatman oluşturma prosedürünü anlatacağım. Haydi başlayalım.Lipit çift katmanını oluşturmak için, bir cam tüp içerisinde bir ila iki mililitre kloroform metanol ile uygun miktarlarda %20 nikel şelatlayıcı lipit ve %80 fosfatidilkolin çözeltisi hazırlarız. İlk adım, çözücüyü 30 ila 37 °C sıcaklıktaki bir su banyosunda, azot gazı akımı altında buharlaştırmaktır. Bu işlem genellikle yaklaşık 15 dakika sürer.Ardından, kalan tüm solventi bir liyofilize cihazı kullanarak 90 dakika boyunca yüksek vakum altında uzaklaştırın. Sonrasında, lipidleri 0.4 millimolar nihai konsantrasyona ulaşana kadar %2N oktil glukozit deterjan içeren salin tamponu içerisinde çözün. Bu işlem, lipozomları oluşturmak için karışık deterjan fosfolipid misellerinden oluşan bir çözelti meydana getirir.Deterjanı uzaklaştırmak ve lipozomlar oluşturmak için bu çözeltiyi üç kez tris salin ile karşıt diyalize tabi tutarsınız. Genellikle yaklaşık 10 kilodalton kesme sınırına sahip altı milimetre çaplı tüplerle bir mililitre civarındaki hacimlerle çal

supported-planar-bilayers-for-formation-study-immunological-synapses

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Bu video, desteklenen bir lipid çift tabakası (SLB) üzerinde doğal öldürücü (NK) hücrelerde immünolojik sinaps oluşumunu görselleştirmek için bir tekniği göstermektedir. SLB ilk olarak florofor etiketli bir NK hücre aktive edici reseptör ligandı ile etiketlenir, ardından NK hücreleri ile inkübasyon yapılır. Daha sonra, hücreler polimerize aktin ve perforin pozitif litik granüller için boyanır. Bu yaklaşım, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak sinaps oluşumunun...

Desteklenen Bir Lipid Çift Tabakası Üzerinde NK Hücre İmmünolojik Sinaps Oluşumunun Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu video, birincil insan T hücreleri ile desteklenen lipid çift katmanları (SLB) arasındaki immün sinaps oluşumunu incelemek için bir in vitro tekniği göstermektedir. T hücresi yüzey proteinleri, bir immün sinaps oluşturmak için SLB üzerinde hareketsiz hale getirilen ilgili ligandlarla etkileşime girer, ardından litik granüllerin sinapsa doğru hareketi izler, bu da floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Desteklenen Düzlemsel Lipid Çift Katmanları ile T Hücresi Etkileşimini İncelemek İçin Bir İn Vitro Teknik

Bu video, T lenfositleri ile floresan antijenleri taşıyan epitel hücreleri arasındaki etkileşimleri araştıran immünolojik sinaps topolojisinin canlı hücre görüntülemesini göstermektedir. Floresan mikroskobu, endotel hücrelerinde kırmızı sitoplazma yer değiştirmesini ve sarı zar halkalarını ortaya çıkarır ve bu da immünolojik sinapsların oluşumunu gösterir.

Canlı Hücre Görüntüleme ile İmmünolojik Sinaps Topolojisinin Değerlendirilmesi

Burada, immünolojik sinapslar oluşturmak için cam destekli lipid çift katmanlı tekniğin, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobunun süper çözünürlüklü görüntüleme tekniği ile bir kombinasyonunu açıklıyoruz. Bu protokolün amacı, kullanıcılara bu iki tekniği başarılı bir şekilde uygulamak için gerekli talimatları sağlamaktır.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

Protein fonksiyonelleştirilmiş düzlemsel cam destekli lipid çift katmanlarının hazırlanması, içindeki protein hareketliliğinin belirlenmesi ve protein yoğunluklarının ölçülmesi burada gösterilmiştir. Yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip tek çift katmanlı yerleşik florokromların görselleştirilmesine olanak tanıyan, gürültüsü azaltılmış bir Toplam İç Yansıma mikroskobu oluşturmak için bir yol haritası özetlenmiştir.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

Adaptif bağışıklık, T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasında oluşan dinamik 'immünolojik sinapslar' tarafından kontrol edilir. Bu protokol, endotel hücrelerinin hem az çalışılmış fizyolojik APC'ler hem de yeni bir 'düzlemsel hücresel APC modeli' türü olarak araştırılması için yöntemleri tanımlar.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Burada bir IS oluşumu sırasında B lenfositlerinde hücre kutuplaşma olaylarını karakterize etmek için iki yaklaşım açıklanmaktadır. İlk olarak, sinaptik membranda organel işe alma ve sitroiskelet yeniden düzenlemelerinin ölçülmesini içerir. İkinci bir biyokimyasal yaklaşım, sentez bileşiminde değişiklikleri karakterize etmek, hangi bağışıklık sinaps için polarizasyon uğrar.

Immün SYNAPSE oluşumu sırasında B hücrelerinde organelle dinamikleri eğitimi

Bu protokol hem immünolojik sinaps oluşumunu hem de sonraki polarize salgı trafiğini immünolojik sinapsa doğru görüntüler. Hücresel konjugates bir süperantijen-darbeli Raji hücre (bir antijen sunan hücre olarak hareket) ve Jurkat klonu (bir efektör yardımcı T lenfosit olarak hareket) arasında kuruldu.

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

Burada Boncuk Destekli Lipid Bilayers kullanılarak sentetik antijen sunan hücrelerin adım adım yeniden uzlaştırılması ve aktif T hücrelerinden sinaptik çıkışı sorgulamak için kullanımları için protokolü sunuyoruz.

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

Gramicidin A-doped damlacık arayüz çift katmanlarını bir yere toplamak, elektriksel olarak uyarmak ve analiz etmek için deneysel bir protokol sunulur. Lipid-protein yapı-fonksiyon ilişkileri, membran alanı, iyonik akı ve tek kanal iletkenliğindeki değişiklikler ölçülerek ve bu yanıtların, elektriksel sinapslardan ilham alan bir membran modelinde iyonik iletkenlikteki plastisite benzeri değişikliklerle ilişkilendirilmesiyle nicelendirilir.

Damlacık Arayüz Bilayerları Kullanarak Lipid-Protein Zar Yapı-Fonksiyon Karakterizasyonu

Öğrenin, desteklenen düzlemsel lipid çift katmanları oluşturmayı ve TIRF mikroskobisi ile immünolojik sinaps oluşumunu görselleştirmeyi. Hücre adezyon proteinlerinin bağlanması ve sinaptik etkileşimlerin incelenmesi için değerli bir yöntemdir.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Daha fazla video keşfet