İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Merhaba, ben Geral Enstitüsü ve New York Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Mike Dustin. Bugün sizlere, immünolojik sinaps çalışmalarında kullanılmak üzere destekleyici planar biyokatman oluşturma prosedürünü anlatacağım. Haydi başlayalım.

Lipit çift katmanını oluşturmak için, bir cam tüp içerisinde bir ila iki mililitre kloroform metanol ile uygun miktarlarda %20 nikel şelatlayıcı lipit ve %80 fosfatidilkolin çözeltisi hazırlarız. İlk adım, çözücüyü 30 ila 37 °C sıcaklıktaki bir su banyosunda, azot gazı akımı altında buharlaştırmaktır. Bu işlem genellikle yaklaşık 15 dakika sürer.

Ardından, kalan tüm solventi bir liyofilize cihazı kullanarak 90 dakika boyunca yüksek vakum altında uzaklaştırın. Sonrasında, lipidleri 0.4 millimolar nihai konsantrasyona ulaşana kadar %2N oktil glukozit deterjan içeren salin tamponu içerisinde çözün. Bu işlem, lipozomları oluşturmak için karışık deterjan fosfolipid misellerinden oluşan bir çözelti meydana getirir.

Deterjanı uzaklaştırmak ve lipozomlar oluşturmak için bu çözeltiyi üç kez tris salin ile karşıt diyalize tabi tutarsınız. Genellikle yaklaşık 10 kilodalton kesme sınırına sahip altı milimetre çaplı tüplerle bir mililitre civarındaki hacimlerle çalışırız ve tüpleri sıkıştırırken hava kabarcığı kalmamasına dikkat ederiz. Bu çözeltiyi steril filtreleriz, diyalizi temiz koşullar altında gerçekleştiririz ve %70 etanol ile sterilize edilmiş eldivenler kullanarak işlem yaparız.

Bu çözelti kristal berraklığında olmalıdır ve oksidasyonu önlemek için argon gazı altında saklanır. Eğer çözelti bulanıksa, çok duvarlı veziküller oluşturmuşsunuz demektir ve işleme yeniden başlamanız gerekir. Deneyi kurmak için, öncelikle çözünür proteinin belirli bir konsantrasyonunda, nikel şelatlayan çift tabakanın belirli bir yüzey alanına ne kadar ICAM-1 ve MHC çöktüğünü belirlememiz gerekir.

Bunu gerçekleştirmek için, beş mikrometre çapındaki cam boncuklar üzerine çift katmanlar biriktiriyoruz. Cam boncukları, görüntüleme için kullanılan akış hücrelerindekilere yakın koşullar altında protein çözeltileriyle inkübe ediyoruz ve ardından bağlanmış protein yoğunluğunu bir akış immüno-florometrik analiz ile okuyoruz. Yüzeye bağlanmış proteinleri tespit etmek için molekül başına bilinen sayıda floresein içeren FSI etiketli antikorlar kullanılır ve akış mikro-florometresini kalibre etmek için floresein standart boncuklar kullanılır.

Metrekare mikrometre başına 200 molekül ICAM-1 ve metrekare mikrometre başına 0,2 ila 20 molekül I-E-K-M-C-C 91 1 0 3 ile antijen sunan hücrelerdekilere yakın koşullar oluşturacağız. Lipozomlar cama kaynadığında kompleks düzlemsel çift tabakalar kendiliğinden oluşur, ancak bu durum yalnızca cam uygun şekilde temizlendiğinde gerçekleşir. Tüm organik maddeleri yok eden ve aynı zamanda cam yüzeyi oldukça hidrofilik bırakan, sülfürik asit ve %30 hidrojen peroksit ile taze hazırlanmış bir karışım olan asit piana çözeltisi kullanıyoruz.

Piranha çözeltisi ile çalışırken, asit önlüğü ve ağır hizmet tipi asit dirençli eldivenler dahil olmak üzere tam koruyucu kıyafetler giyiyoruz. Atıkların organik atıklardan dikkatle ayrılması ve uygun şekilde bertaraf edilmesi gerekir. Piranha asit çözeltisini hazırlamak için, kuru bir behere 75 milliliters derişik sülfürik asit ekleyin ve ardından dikkatlice 25 milliliters %30 hidrojen peroksit ilave edin.

Çözelti hızla 100 °C'nin üzerine kadar ısıtılır, ardından kuru lameller 15 dakika boyunca çözeltiye daldırılır. Piranha çözeltisindeki bu inkübasyonun ardından, lameller saflaştırılmış suya batırılır ve her iki tarafı birer dakika boyunca durulanır. Daha sonra, saflaştırılmış suyu tahliye etmek için bir vakum kaynağı kullanılarak lameller kurutulur.

Piranha çözeltisinin soğumasını bekleyin ve ardından çeker ocak içerisinde kapağı gevşek bırakılmış ve belirgin şekilde işaretlenmiş olan piranha atık konteynerine ekleyerek çift katmanları oluşturun. Laboratuvarımız, entegre ısıtma avantajlarına sahip olan bi FCS two odalarını kullanmaktadır. FCS two sistemi, bir mikroakışkan manifoldu ile 0,5 millimeter üst contayı, bir yüzeyi ısıtma için indiyum kalay oksit ile kaplanmış ve diğer yüzeyinde akışkan oluğu bulunan bir mikro su kanalı lamını birbirine sabitleyen paslanmaz çelik bir taban üzerindedir.

Akış hücresini kurmak ve düzlemsel çift katmanlar oluşturmak için akış odasının yüksekliğini belirleyen tozsuz 0,25 milimetre conta ve çift katmanın oluşturulacağı piranha ile temizlenmiş 40 milimetre yuvarlak lamel kullanılır. Manifoldu, tüpler yukarı bakacak şekilde düz bir yüzeye yerleştirin. Ardından, delikleri akışkan tüplerinin üzerine gelecek şekilde konumlandırılmış 0,5 milimetre contayı yerleştirin ve düzgünce oturduğundan emin olun.

Akışkan kanalları yukarı bakacak şekilde mikro su kemeri lamını nazikçe yerleştirin ve lamdaki deliklerin mikroakışkan tüplerle hizalandığını doğrulayana kadar aşağı doğru herhangi bir baskı uygulamadan düz bir şekilde oturduğundan emin olun. Ardından, dikdörtgen kesimli tozsuz 0,25 milimetre contayı, kanal akışkan kanallarla hizalanacak ve büyük hava boşlukları kalmayacak şekilde mikro su kemeri lamının üzerine yerleştirin; mikro su kemeri lamının yüzeyine, her bir damla arasındaki merkezden merkeze mesafenin 2,5 milimetre olduğu bir düzenle beş adede kadar bir mikrolitre lipozom süspansiyonu damlası damlatın. Beş lipozom damlası farklı bileşimlere sahip olabilir, ancak bu durumda biri nikel şelatlayıcı lipid içermeyen, diğeri %10 nikel şelatlayıcı lipid içeren olmak üzere yalnızca iki çift katman oluşturacağız.

Bu damlalar yerleştirildikten sonra, lamel camı tek bir hareketle yüzeye dikkatlice yerleştirin ve mümkün olan en kısa sürede tabana sabitleyin. Lipozom damlaları lamel cam ile temas etmelidir. Bilayerlar muhtemelen çoktan oluşmuş olduğundan ve herhangi bir bozulma kusurlu bilayerların oluşmasına yol açabileceğinden, bu temas kesilmemelidir.

Bu noktada, lam üzerindeki çift katmanların konumlarını, mikroskopta lamelin yerleştirilmesine yardımcı olması için birkaç küçük mürekkep lekesiyle işaretlemeyi hatırlamak önemlidir. Sistemin dengeye geldiğinden emin olmak için 20 dakika bekleyin; tüm solüsyonları, yaklaşık 20 cm'lik esnek bir hortuma ve üç yollu bir musluğa bağlı 20 mililitrelik bir şırınga kullanarak aktarın. Musluğun diğer portu, musluk ile akış hücresi arasındaki ölü hacmi minimize etmek için kısa bir hortum parçasıyla akış hücresine bağlanır.

Şırıngayı magnezyum klorür, kalsiyum klorür, glukoz ve insan serum albümini içeren HEBS tamponlu salin ile doldurun. Hava kabarcığı kalmadığından emin olmak için tüpleri ve stop koku hazırlayın. Ardından bunu akış hücrelerine bağlayın ve çift tabakanın üzerinden hava kabarcığı geçmediğinden emin olarak tek bir hareketle beş mililitre itin.

Artık his-etiketli proteinleri çift tabakaya yerleştirmek için çift tabakalarınız hazır olacak. Öncelikle kazein ile bloke edilmeli ve nikel ile yüklenmelidir. Bir mililitrelik bir şırıngayı kazein nikel iyon çözeltisiyle doldurun ve hava kabarcığı kalmadığından emin olarak bunu yan porta bağlayın.

Çözeltiyi enjekte ettikten sonra, tam bloklamanın gerçekleşmesi için 20 dakika bekleyin. Ardından, bloklama çözeltisini 20 mililitrelik şırıngadaki H-B-S-H-S-A ile yıkayarak uzaklaştırın. Şimdi, polyhis etiketli ICAM one ve IEK içeren 0,5 mililitre H-B-S-H-S-A çözeltisini enjekte edin.

Bu deneyde, ICAM-1, SCI-5 ile etiketlenmiştir. Böylece LFA-1 ICAM-1 etkileşimleri, çift tabakadaki ICAM-1 yeniden düzenlemesi görüntülenerek takip edilebilir. Protein çift tabakaya yapışırken, proteinin nikel yüklü çift tabakaya bağlanması için 30 dakika bekleyin. Akış hücresini, özel bir sahne eklemesi kullanarak ters mikroskoba sabitleyin.

Ardından, sistemin 37 °C'de dengelenmesini sağlamak için ısıtma elektroniğini bağlayın. Objektifin çift tabakalardan biriyle hizalanması için akış hücresini daha önce oluşturulan işaretlere göre konumlandırın ve alan diyaframının yansıyan ışık görüntüsüne odaklanarak odak düzlemini belirlemek için girişim yansıma mikroskopisi kullanın. Son olarak, bağlanmamış ICAM-1'i akış hücrelerinden yıkayarak uzaklaştırın.

Çift katmanın floresan görüntülerini, turf M ve geniş alan modlarında ICAM one kanalında edinin. Bu işlem, nikel kaplı çift katman üzerindeki ICAM one bağlanmasını nikel içermeyen çift katmana kıyasla doğrulamak içindir. Akış hücresi artık hücreleri almaya hazırdır.

Bu demonstrasyon için, retrovirüs ile GFP ve Zap 70'e kaplanmış ND T-hücre reseptörü transgenik T hücreleri kullanacağız; hücreleri bir kez HBSS ile yıkayın ve ardından TCR mikro kümelerini takip edebilmek için hücreleri T-hücre reseptörüne özgü Alexa 568 işaretli bir FAB ile inkübe edin. 15 dakika sonra, hücreleri 1:10 oranında seyreltin. Bu işlem, H 57 antikorunu TIRFM görüntülemesini engellemeyecek kadar seyreltirken, başlangıçta bağlanan fab ayrışmaya başladığında T-hücre reseptörünün saturasyonunu korur; ardından hücreleri akış hücresine enjekte edin.

İmmünolojik sinapsı üç renkli turf M modunda görüntülüyoruz. Bu süreç; LFA-1, ICAM-1 etkileşiminin oluşumunu, TCR kümelerinin ve cSMAC'ın oluşumunu ve GFP-ZAP70'i mobilize eden TCR mikro kümelerinin sürekli oluşumunu içerir. Bu sonuçların bazıları görüntüleme sırasında belirginleşirken, diğerlerinin tam olarak anlaşılabilmesi için işlem sonrası analiz gerekecektir.

Tamam, size immünolojik sinapsı incelemek için desteklenmiş düzlemsel çift katmanların nasıl kullanılacağını göstermiş olduk. Bu deneylerin başarılı olması için T-hücrelerinin çok iyi durumda olması oldukça önemlidir ve PPS tamponlu salin çözeltisi uzun süreli T-hücresi kültürü için uygun değildir. Bu nedenle, hücreleri kültürden çıkarıp bu ortama aktarmalı ve ardından çok hızlı bir şekilde kullanmalısınız.

Daha uzun süreli deneyler yapmak isterseniz, HEPES tamponlu salin yerine kullanabileceğiniz oldukça iyi bazı serumsuz besiyeri formülasyonları mevcuttur. Sitokin üretimi veya T hücrelerinin proliferasyonu gibi daha uzun süreli son nokta analizleri yapmak istiyorsanız, bu formülasyonlar hücrelerin çok daha uzun süre canlı kalmasını sağlayacaktır. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.