İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Merhaba, ben Geral Enstitüsü ve New York Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Mike Dustin. Bugün sizi immünolojik sinaps çalışması için destekleyici düzlemsel Biolay oluşturma prosedüründen geçireceğim. Öyleyse başlayalım.

Lipid çift tabakasını yapmak için, bir ila iki mililitre kloroform metanol içeren bir cam tüpte uygun miktarlarda% 20 nikel, şelatlama lipidi ve% 80 fosfatidilkolin çözeltisi hazırlıyoruz. İlk adım, çözücüyü 30 ila 37 santigrat derece ılık bir su banyosunda bir nitrojen gazı akışı altında buharlaştırmaktır. Bu genellikle yaklaşık 15 dakika sürer.

Ardından, 90 dakika boyunca bir liyofilizatör kullanarak yüksek vakum altında kalan çözücüyü çıkarın. Daha sonra, lipitleri% 2 N sekizli glukozit deterjan faiz tuzlu su tamponu içinde 0.4 milimolar nihai konsantrasyona çözün. Bu, lipozomlar oluşturmak için karışık deterjan fosfolipid mycells çözeltisi oluşturur.

Deterjanı çıkarmak ve lipozomlar oluşturmak için bu çözeltiyi üç tris salin değişikliğine karşı diyaliz edersiniz. Genellikle 10 kilodalton civarında bir kesme ile altı milimetre çapında boru ile bir mililitre mertebesinde hacimlerle çalışırız ve boruyu sıkıştırırken herhangi bir hava kabarcığını dışlamaya dikkat ederiz. Bu solüsyonu steril olarak filtreliyoruz ve diyalizi temiz koşullar altında yapıyoruz ve% 70 etanol sterilize edilmiş eldiven kullanıyoruz.

Bu çözelti kristal berraklığında olmalı ve oksidasyonu önlemek için Argon gazı altında saklanmalıdır. Çözelti bulanıksa, çok duvarlı veziküller oluşturmuşsunuzdur ve yeniden başlamanız gerekir. Deneyi ortaya koymak için, öncelikle belirli bir çözünür protein konsantrasyonunda nikel şelatlama çift tabakasının belirli bir yüzey alanında ne kadar ICAM bir ve MHC biriktiğini belirlememiz gerekir.

Bunu yapmak için, beş mikrometre çapında cam hızında çift tabakalar biriktiriyoruz. Cam boncukları, görüntüleme için kullanılan akış hücrelerindekilere yakın koşullar altında protein çözeltileri ile inkübe edin ve ardından bir akış immünofloro metrik tahlili ile bağlı proteinin yoğunluğunu okuyun. Yüzeye bağlı proteinleri tespit etmek için molekül başına bilinen floresein sayılarına sahip FSI işaretli antikorlar kullanılır ve akış mikro florimetresini kalibre etmek için floresein standart boncukları kullanılır.

ICAM bir mikrometre kare başına 200 molekül ve kare başına 0.2 ila 20 molekül içeren antijen sunan hücrelere yakın koşullar oluşturacağız. I-E-K-M-C-C 91 1 0 3 mikrometresi, lipozomlar cama kaynaştığında karmaşık düzlemsel çift tabakalar kendiliğinden oluşur, ancak yalnızca camı temizlemek için uygun şekilde temizlenirse. Taze hazırlanmış bir sülfürik asit ve% 30 hidrojen peroksit karışımı olan asit piana çözeltisi kullanıyoruz, bu da tüm organik maddeleri yok eder ve aynı zamanda cam yüzeyini çok hidrofilik bırakır.

Piranha ile çalışırken, asit önlüğü ve ağır aside dayanıklı eldivenler de dahil olmak üzere tam koruyucu giysiler giyiyoruz. Atığın organik atıklardan dikkatli bir şekilde ayrılması ve uygun şekilde bertaraf edilmesi gerekir. Asit piranha çözeltisini hazırlamak için, kuru bir behere 75 mililitre konsantre sülfürik asit ekleyin ve ardından dikkatlice 25 mililitre% 30 hidrojen peroksit ekleyin.

Çözelti hızla 100 santigrat derecenin üzerine kadar ısınır, ardından kuru örtü fişlerini 15 dakika boyunca çözeltiye daldırın. Piranhadaki bu inkübasyonun ardından, örtü fişlerini arıtılmış suya batırın ve ardından her iki tarafını bir dakika durulayın. Ardından, arıtılmış suyu boşaltmak için bir vakum kaynağı kullanarak kapak kızaklarını kurutun.

Piranha çözeltisinin soğumasını bekleyin ve çift katmanları oluşturmak için çeker ocakta iyi işaretlenmiş, kapağı gevşek bırakılan piranha atık kabına ekleyin. Laboratuvarımız, entegre ısıtmanın avantajlarına sahip bi FCS iki oda kullanır. FCS iki sistemi, 0,5 milimetrelik bir üst contaya sahip bir mikroakışkan manifoldu, bir yüzeyde ısıtma için indiyum kalay oksit ile kaplanmış bir mikro su kemeri sürgüsünü ve diğer tarafta akışkan bir oluk ile birbirine kenetleyen paslanmaz çelik bir taban üzerindedir.

Akış odasının yüksekliğini tanımlayan tozsuz 0,25 milimetrelik bir conta ve piranha, akış hücresini birleştirmek ve düzlemsel çift katmanlar oluşturmak için çift katmanın oluşturulduğu 40 milimetrelik yuvarlak kapak kızağını temizledi. Manifoldu, tüpler yukarı bakacak şekilde düz bir yüzeye yerleştirin. Ardından 0.5 milimetrelik contayı akışkan tüplerin üzerine yerleştirilmiş deliklerle yerleştirin ve bunun düz bir şekilde oturduğundan emin olun.

Mikro su kemeri sürgüsünü, akışkan kanalları yukarı bakacak şekilde nazikçe yerleştirin ve sürgüdeki deliklerin mikroakışkan tüplerle aynı hizada olduğunu doğrulayana kadar aşağı doğru herhangi bir basınç uygulamadan düz bir şekilde oturduğundan emin olun. Daha sonra, tozsuz 0.25 milimetre contayı, mikro su kemeri sürgüsünün üzerine dikdörtgen bir kesik ile yerleştirin, böylece kanal akışkan kanallarla hizalanır ve büyük hava boşlukları olmaz, mikro su kemeri sürgüsünün yüzeyine beş mikrolitrelik lipozom süspansiyonu damlası yerleştirilir, her damla arasındaki merkezden merkeze mesafe 2.5 milimetre olacak şekilde. Beş lipozom damlası farklı bileşimlere sahip olabilir, ancak bu durumda, biri nikel şelatlama lipidleri içermeyen ve diğeri %10 nikel şelatlama lipidleri olan iki çift tabaka oluşturacağız.

Bu damlalar yerine oturduktan sonra, kapak kızağını tek bir hareketle dikkatlice yüzeye yerleştirin, cl mümkün olduğunca çabuk tabana sabitleyin. Lipozom damlaları kapak fişi ile temas etmelidir. Bu temas kopmamalıdır, çünkü çift tabakalar muhtemelen zaten oluşmuştur ve herhangi bir aksaklık kusurlu çift tabakalara neden olabilir.

Bu noktada, kapak kaymasının mikroskop üzerinde konumlandırılmasına yardımcı olmak için slayt üzerinde birkaç küçük mürekkep lekesi ile çift katmanların konumlarını işaretlemeyi unutmamak önemlidir. Sistemin dengelendiğinden emin olmak için 20 dakika bekleyin, yaklaşık 20 santimetre esnek boruya bağlı 20 mililitrelik bir şırınga ve üç yollu bir durdurma musluğu kullanarak tüm çözeltileri aktarın. Durdurma musluğunun başka bir portu daha sonra vana ile akış hücresi arasındaki ölü hacmi en aza indirmek için kısa bir boru uzunluğu ile akış hücresine bağlanır.

Şırıngayı magnezyum klorür, kalsiyum klorür, glikoz ve insan serum albümini içeren heis tamponlu salin ile doldurun. Boruyu astarlayın ve musluğu durdurun, böylece hava kabarcığı olmaz. Daha sonra bunu akış hücrelerine bağlayın ve çift katmanın üzerinden hava kabarcığı geçmediğinden emin olmak için izlerken tek hareketle beş mililitreyi itin.

Artık tıslama etiketli proteinleri çift katmana sokmak için çift katmanlarınıza sahip olacaksınız. Önce kasa ile bloke edilmeli ve nikel ile doldurulmalıdır. Bir mililitrelik bir şırıngayı kasalı nikel iyon çözeltisiyle doldurun ve bunu herhangi bir hava kabarcığı yakalamadan yan bağlantı noktasına bağlayın.

Çözeltiyi enjekte ettikten sonra, tam tıkanmaya izin vermek için 20 dakika bekleyin. Daha sonra blokaj solüsyonunu 20 mililitrelik şırıngadan H-B-S-H-S-A ile yıkayın. Şimdi polyhis, etiketli, ICAM, one ve IEK içeren 0.5 mililitre H-B-S-H-S-A solüsyonu enjekte edin.

Bu deneyde, ICAM olanı SCI beş ile etiketlenmiştir. Bu nedenle, LFA bir ICAM bir etkileşimi, iki katmandaki ICAM bir yeniden düzenlemenin görüntülenmesiyle takip edilebilir, protein çift katmana yapışırken proteinin nikel yüklü çift tabakayı bağlaması için 30 dakika izin verir. Özel bir tabla eki kullanarak akış hücresini ters çevrilmiş mikroskoba sabitleyin.

Ardından, sistemin 37 santigrat derecede dengelenmesini sağlamak için ısıtma elektroniğini bağlayın. Akış hücresini, objektif çift katmanlardan biriyle hizalanacak şekilde konumlandırmak için daha önce yapılan işaretleri kullanın ve alan diyaframının yansıyan ışık görüntüsüne odaklanarak odak düzlemini bulmak için girişim yansıma mikroskobunu kullanın. Son olarak, bağlanmamış ICAM'ı akış hücrelerinden yıkayın.

Çim M ve geniş alan modlarında ICAM tek kanalında çift katmanın floresan görüntülerini elde edin. Bu, nikel içermeyen çift tabakaya göre nikel kaplı çift tabaka üzerinde ICAM bir bağlanmasını doğrulamak içindir. Akış hücresi artık hücreleri almaya hazırdır.

Bu gösteri için, bir retrovirüs ENC kaplama GFP'leri P zap 70 ile transdüksiyona uğramış bir ND T hücresi reseptörü transgenik T hücreleri kullanacağız, hücreleri bir kez H-B-S-H-S-A ile yıkayacağız ve daha sonra hücreleri Alexa 5 68 etiketli bir FAB ile T hücresi reseptörüne inkübe edeceğiz, böylece TCR mikro kümelerini izleyebiliriz. 15 dakika sonra, hücreleri bir ila 10 oranında seyreltin. Bu, H 57 antikorunu yeterince seyreltir, böylece çim M görüntülemesine müdahale etmez, ancak başlangıçta bağlı fab ayrışmaya başladığında T hücresi reseptörünün doygunluğunu korur, daha sonra bunları akış hücresine enjekte eder.

İmmünolojik sinapsı üç renkli çim M modunda görüntülüyoruz. Bu, LFA bir, ICAM bir etkileşimi, TCR kümelerinin ve C smac'ın oluşumunu ve GFP ZAP 70'i işe alan TCR mikro kümelerinin sürekli oluşumunu içerir. Bu sonuçlardan bazıları satın alma sırasında açıktır, diğerleri ise tam olarak takdir etmek için işlem sonrası analiz gerektirecektir.

Tamam, size immünolojik sinapsı incelemek için desteklenen düzlemsel çift katmanları nasıl kullanacağınızı gösterdik. Bu deneylerin işe yaraması için T hücrelerinin çok iyi durumda olması ve PPS tamponlu salin çözeltisinin uzun süreli T hücresi kültürü için çok fazla olmaması çok önemlidir. Yani hücreleri kültürden çıkarmak, onları bu ortama koymak ve sonra onları çok hızlı bir şekilde kullanmak istiyorsunuz.

Daha uzun vadeli deneyler yapmak istediğinizi fark ederseniz, o parça tamponlu salin yerine kullanabileceğiniz çok iyi serum içermeyen medya formülasyonları vardır. Sitokin üretimi veya T hücrelerinin çoğalması gibi daha uzun son uç nokta yapmak istiyorsanız, bu hücreleri çok daha uzun süre canlı tutacaktır. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.