Desteklenen Düzlemsel Lipid Çift Katmanları ile T Hücresi Etkileşimini İncelemek İçin Bir İn Vitro Teknik

Desteklenen bir lipid çift tabakası veya SLB içeren bir akış slaydı alın.

SLB, floroforlarla işaretlenmiş spesifik ligandlara - hücreler arası yapışma molekülü 1 veya ICAM-1 ve anti-CD3 antikorlarına - konjuge edilir.

T hücreleri ve florofor etiketli anti-CD107a Fab ekleyin - degranülasyon markörüne karşı bir antikorun antijen bağlayıcı fragmanı.

T hücresi reseptörü-CD3 veya TCR-CD3 kompleksi, anti-CD3 antikoruna bağlanarak TCR'yi tetikler.

Tetikleme kaynaklı içten dışa sinyalleme, hareketsiz hale getirilmiş ICAM-1'e bağlanan yüzeydeki integrinleri aktive eder.

Konjugasyon, hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesini - mikrotübülün yeniden düzenlenmesini ve hücrenin SLB yüzeyinde yanal yayılmasına yol açan aktin polimerizasyonunu indükler.

Yayılma, daha fazla ligand-reseptör etkileşiminin bir supramoleküler aktivasyon kümesi veya SMAC oluşturmasına izin vererek bir bağışıklık sinapsı oluşturur.

T hücresi litik granülleri mikrotübüller boyunca hareket eder ve plazma zarı ile birleşir, hücre yüzeyinde anti-CD107a Fab'a bağlanan degranülasyon belirteçlerini açığa çıkarır.

Bir floresan mikroskobu kullanarak, TCR-CD3 kompleksleri, integrinler ve degranülasyon belirteçleri açısından zenginleştirilmiş immün sinapsları görselleştirin.

Cam lamelleri 25 ila 30 dakika boyunca taze hazırlanmış asidik piranha çözeltisine batırmak için polipropilen makas tipi forseps kullanarak başlayın. Yıkamanın sonunda, lamelleri her yıkama için taze hacimde ultra saf suyla yedi kez durulayın ve kalan suyun temiz camdan akmasına izin vermek için ıslak lamelleri bir kenara koyun.

Lameller kuruduğunda, son lipozom karışımından iki mikrolitreyi, tam olarak, steril bir akış başlığı içindeki kendinden yapışkanlı bir kayar kanalın ortasına ayırın ve hemen ama dikkatli bir şekilde, lamelin sürgünün yapışkan tarafına nazikçe indirilmesini sağlamak için temiz ve kuru bir lameli sürgüyle hizalayın ve polipropilen makas tipi forsepsin dış halkasını kullanarak cihazın çevresel temasına hafif bir basınç uygulayın. Sızıntıyı önlemek için kaymanın sürgüye sıkıca takıldığından emin olarak lamel ile lamel yapın. Ardından, sürgüyü ters çevirin ve kayar düzeneğin dış tarafındaki çift katmanın etrafına dört nokta çizmek için kalıcı bir işaretleyici kullanın.

İlk enjeksiyondan önce, kanalın bir portunu giriş portu ve diğerini çıkış portu olarak belirleyin ve bu atamayı deney boyunca koruyun. Kabarcık oluşumunu önlemek için, pipet ucunun ucunu, kayar kanalın lastik contasının uçla delindiğini hissedene kadar doğrudan giriş portuna sokun.

Yavaşça kanalı 50 mikrolitre ılık tahlil tamponu ile doldurun. Kazein bloke edici çözelti içinde 200 mikrolitre nikel (II) klorür giriş portuna enjekte edin ve çıkış portundan 50 mikrolitre tamponu çıkarın. 45 dakikalık bir inkübasyondan sonra, fazla kazein çözeltisini çıkış portundan çıkarın.

Oda sıcaklığında 45 dakikalık bir inkübasyon için giriş portuna 100 mikrolitre ICAM-1 ve streptavidin çözeltisi enjekte edin. İnkübasyonun sonunda, fazla protein çözeltisini çıkış portundan çıkarın ve çift tabakayı yıkama başına 100 mikrolitre tahlil tamponu ile iki kez yıkayın. Daha sonra, iki katmanları oda sıcaklığında 45 dakika boyunca 100 mikrolitre florofor konjuge anti-CD3 antikoru ile etiketleyin, ardından gösterildiği gibi yıkama başına 100 mikrolitre tahlil tamponunda iki yıkama yapın.

T hücresi-çift katmanlı etkileşimleri görüntülemek için, slaytı Toplam İç Yansıma Floresan veya TIRF mikroskobunun 37 santigrat derece ısıtılan aşamasına yerleştirin ve çift katmanı 100 güç hedefine ortalamak için mürekkep işaretlerini kullanarak sahneyi ayarlayın.

Granül salınımlı görüntüleme için, CD4 T hücre süspansiyonuna floresan konjuge anti-CD107a antikor Fab fragmanları ekleyin ve etiketli hücreleri, slayt kanalının giriş portuna enjeksiyon için 50 mikrolitre tahlil tamponunda yeniden süspanse edin. Ardından, uygun sayıda deney alanı seçin ve enjeksiyondan sonraki 30 dakika boyunca her alanın görüntülerini dakikada bir kaydedin.