T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

İmmün sinaps çıkışının incelenmesi çoğunlukla mikroskobik yöntemlerle sınırlandırıldı. BSLB'ler, akış sitometrisi, mikroskopi, proteomi ve RNA dizileme teknolojileri de dahil olmak üzere T hücreli bağışıklık sinapslarının çıkışını incelemek için kullanılabilecek araçlar repertuarımızı genişletti. Bu nedenle, BSLB'ler çok çeşitli immünoloji sorularında ve T hücre çıkışının bileşimini ve biyokimyasal düzenlemesini tanımlamak için kullanılabilir.

Bu, örneğin, kimerik antijen reseptörlerinin, belirli sinyal yollarını inhibe eden ilaçların veya ilgi genlerinin genetik ablasyonunun incelenmesini içerir. Bu protokolün en kritik yönlerinden biri, protein kalibrasyonlarını ve trans-sinaptik ilgi parçacıklarını izlemek için gereken çok renkli akış sitometri panelini optimize etmektir. Bu, protein konsantrasyonlarının, antikor konsantrasyonlarının ve cihaz ayarlarının sistematik olarak yinelenmesini gerektirir.

Bir mikrolitre boncuk çözeltisini 1.000 mikrolitre PBS ile seyrelterek başlayın. Boncukları bir hemositometre odası kullanarak sayın ve mililitre başına konsantrasyonlarını hesaplayın. Ardından, titrasyon noktası başına 500.000 nihai BSLB için gereken silika boncuklarının hacmini hesaplayın.

Gerekli miktarda silika boncukları steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Silika boncuklarını bir mililitre steril PBS ile üç kez yıkayın ve boncukları santrifüj edin. Nikel içeren fosfolipidlerin son 12,5 köstebek yüzdesini içeren üç hacimli lipozom ana karışımı hazırlayın.

Yıkanmış silika boncuklarını yeniden depolamak için lipozom ana karışımını kullanın. Ardından, toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak hafifçe karıştırın. Steril bir teknik kullanarak, havayı yerinden etmek ve lipitleri karıştırma sırasında oksidasyondan korumak için tüpe argon veya azot gazı ekleyin.

0.4 milimolar lipit stoklarına argon ekleyin. Stoku saklayın ve steril bir teknik kullanarak manipüle edin. BSLB'leri dikey karıştırıcıya taşıyın ve 10 RPM'de yörüngesel karıştırma kullanarak oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın.

Ardından, bir tezgah üstü minicentrifuge üzerinde oda sıcaklığında 15 saniye santrifüj yaparak boncukları aşağı çevirin. BSLB'lerdeki NTA sitelerini doyurmak için 100 mikromoler nikel sülfat içeren%5 BSA mililitre ekleyerek oluşan BSLB'leri engelleyin.

Yeni bir U-bottom veya V-bottom 96-well plakası alın ve proteinlerin iki kat seri seyreltmelerini hazırlayın. Hazırlanan BSLB'leri 100 mikrolitre HBS-HSA tamponu 500.000 BSLB içerecek şekilde yeniden diriltin. Ardından, başka bir U-bottom veya V-bottom 96-well plakası alın ve BSLB süspansiyonunun 100 mikrolitresini her kuyu 500.000 BSBL alacak şekilde kuyulara aktarın.

İkinci plakayı oda sıcaklığında 300x G'de iki dakika döndürün.Süpernatantı atın ve protein titrasyon plakasından 100 mikroliter hacmini çökelmiş BSLB'leri içeren tabağa aktarın. Işıktan korumak için alüminyum folyo kullanın ve oda sıcaklığında 1.000 RPM'de 30 dakika kuluçkaya yat.

Daha sonra tabağa HBS-HSA tamponu ekleyerek plakayı üç kez yıkayın ve 300x G'de iki dakika oda sıcaklığında aşağı doğru döndürün.Yıkadıktan sonra hücreleri sayın. Daha sonra, sinaptik transfer tahlil ortamını kullanarak mililitre başına 2,5 milyonluk son konsantrasyona seyreltin. BSLB'ler protein karışımı ile yüklendikten sonra, fazla ilişkisiz proteinleri çıkarmak için BSLB'leri HBS-HSA tamponu ile iki kez yıkayın.

200 mikrolitre HBS-HSA tamponunda kuyu başına 500.000 BSLB'yi yeniden diriltir. Kuyu başına 100 mikrolitre BSLB'yi, bir kopya yapmak için yeni bir U-bottom 96 kuyu plakasına aktarın, böylece kuyu başına son BSLB miktarı 250.000'dir. BSLB'leri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300x G'de döndürün.

Süpernatantı atın ve ardından 100 mikrolitre T hücre süspansiyonu kullanarak BSLB'leri yeniden diriltin. Kabarcık oluşumunu önlemek için hafifçe karıştırın. 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca ortak kültürleri kuluçkaya yatırın.

Hücreleri ışıktan koruyun ve önce oda sıcaklığında en az 15 dakika kuluçkaya yatırarak ortak kültürleri soğutun. Oda sıcaklığındaki ortak kültürleri 500x G'de beş dakika santrifüjleyin.Süpernatantı atın ve tıkanma için oda sıcaklığında kalsiyum ve magnezyum iyonsuz% 2 BSA PBS'deki ortak kültürleri yeniden biriktirin. Hücreleri 45 dakika boyunca buza yerleştirin ve ışıktan koruyun.

Buz gibi 0,22 mikrometre filtreli %2 BSA ve PBS'yi boyama tamponu olarak kullanarak antikor ana karışımını hazırlayın. Bu ana karışım ekstra engelleme sağlayacaktır. 500x G'deki ortak kültürleri beş dakika ve dört santigrat derece döndürün.

Süpernatantları atın ve ardından optimize edilmiş antikor konsantrasyonları içeren boyama ana karışımındaki hücreleri yeniden kullanmak için çok kanallı bir pipet kullanın. İzotip etiketli hücreler ve BSLB'ler, floresan ve floresan olmayan BSLB'ler ve tek başına lekelenmiş hücreler ve BSLB'leri içerir. Hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak hafifçe karıştırın.

Buzda 30 dakika kuluçkaya yat ve onları ışıktan koru. Hücreleri ve BSLB'leri buz gibi %2 BSA PBS kullanarak iki kez yıkayın. Onları 500x G'de 4 santigrat derecede beş dakika döndürün.

Santrifüjlemeden sonra, kuyuların dibindeki ortak kültür tortularını kontrol edin. Daha sonra, yıkanmış ortak kültürleri 100 mikrolitre PBS'de yeniden diriltin ve hemen elde edin. Yan dağınık ışık için günlük ölçeğini ve yan ve ileri dağınık ışıklar için uçuş zamanı parametresini etkinleştirin.

Hem loş ayarlı hem de en parlak popülasyonların cihazın doğrusal aralığına düşmesini sağlayarak MESF standartlarını elde edin. Ardından, ücret örnekleri alın, telafiyi hesaplayın ve ücret matrisini denemeye uygulayın. Her nicelik kanalı için en az 20.000 toplam MESF standardı alın ve kaydedin.

FACS kılıf sıvısı veya yeniden canlanan MESF boncuklarına benzer kullanmaktan kaçının, çünkü bunlar florokromları yok edecek tuzlar ve alkoller içerir, bu da daha geniş floresan zirvelerine ve yüksek hataya yol ırkar. Yüksek verimli örnekleyiciler kullanarak satın alma için, cihaz alımını Standart olarak ayarlayın, numune alımını 80 mikrolitreye ayarlayın. Saniyede iki ila üç mikrolitre arasında numune Akış Hızı, 50 mikrolitrede numune Karıştırma Hacmi, saniyede 150 mikrolitrelik numune Karıştırma ve üç ila beş arasında kuyu başına karıştırma.

Örnek başına en az 10.000 tek BSLB elde edin. Son olarak, FCS dosyalarını dışa aktar. Bademcikler B hücreleri ve yardımcı T hücrelerinin yüzeyinde ICAM-1'in nicel akış sitometrisi ölçümlerine bir örnek burada gösterilmiştir.

Temsili görüntüler, insan palatin bademciklerinden izole edilmiş tek CXCR5 B hücrelerini ve foliküler yardımcı T hücrelerini analiz etmek için gating stratejisini açıklar. Bu sıralı gating stratejisi, sürekli edinme penceresindeki tek canlı olayları tanımlar. ICAM-1'in FMO kontrolleri ve FMO kontrollerine kıyasla hücre yüzeyi ekspresyosu olan ve popülasyonların ilgili izotipleriyle etiketlenmiş çiftler burada gösterilmiştir.

MESF popülasyonlarının çakışmış histogramlarında farklı standart MESF popülasyonlarından MPI'ların gating ve ölçümü burada gösterilmiştir. Değerler, beş MESF popülasyonunun her biri için MFI'leri temsil eder. MESF popülasyonları için mesf'in cMFI üzerinden doğrusal regresyonu burada sunulmuştur.

Eğim, TFH'deki bademcikler B hücrelerinin yüzeyindeki ICAM-1'in FCM verilerinden hücrelere bağlı MESF'yi çıkarır. Mutlak moleküler yoğunluklara dönüşüm bu basit matematiksel işlemleri takip eder. Temsili görüntüler, rekombinant monomerik ICAM-1 12 histidinlerinin artan yoğunlukları ile yeniden inşa edilen BSLB'lerin akış sitometri analizini göstermektedir.

ICAM-1 referans konsantrasyonunun ölçülen yoğunluk üzerindeki regresyon analizleri burada gösterilmiştir. Eğim, hücrelerin yoğunluğunu elde etmek için hedef protein konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanılır. Akış diyagramları, T hücrelerini BSLB'lerle birlikte kültleştirmek, akış sitometrisi ile parçacık transferinin sonraki ölçümünde model membranlarını yeniden inşa etmek için kritik adımları gösterir.

Sürekli edinme penceresindeki tek BSLB'leri ve hücreleri tanımlamak için gating stratejisi burada gösterilmiştir. Bu protokolün en önemli yönlerinden biri, sonuçların tekrarlanabilirliğini korumak için, protein veya lipit stoklarını her değiştirdiğinizde, yeni kalibrasyon analizi yapmanız gerektiğidir. Farklı T hücre alt kümeleri tarafından salgılanan yeni etkili molekülleri keşfetmek için BSLB'ler, transkriptomik ve proteomik analize tabi tutulduğu için floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile daha da izole edilebilir.

Oxford Üniversitesi'ndeki meslektaşlarımız bu teknolojiyi yeni reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek ve göstermek ve ayrıca genetik ablasyonların T hücre bağışıklık sinapsının çıktısı üzerindeki etkilerini incelemek için kullandılar.