Name: T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Öğrenin, T hücreli immün sinapsların partikül çıkışını incelemek için boncuk destekli lipid bilayerlerin (BSLB) hazırlanması ve akış sitometrisi ile analiz yöntemlerini.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuvar üyelerimize ve Kennedy Romatoloji Enstitüsü topluluğuna, özellikle akış sitometri tesisi müdürümüz Jonathan Webber'e yapıcı bilimsel tartışmalar için minnettarız. Bu çalışma Wellcome Trust Principal Research Fellowship 100262Z/12/Z, ERC Advanced Grant (SYNECT AdG 670930) ve Kennedy Trust for Rheumatology Research (KTRR) (üçü de MLD'ye) tarafından finanse edildi. PFCD, Avrupa Komisyonu (LTFCOFUND2013, GA-2013-609409) ve Marie Sklodowska-Curie Actions) ve Oxford-Bristol Myers Squibb Bursu ile birlikte EMBO Uzun Vadeli Burs (ALTF 1420-2015) tarafından desteklendi.

<ol><li>Cespedes, P. F., Beckers, D., Dustin, M. L., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+to+reconstitute+immune+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems to reconstitute immune cell signaling.</a> FEBS Journal. 288 (4), 1070-1090 (2021).</li>
<li>Choudhuri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+release+of+T-cell-receptor-enriched+microvesicles+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polarized release of T-cell-receptor-enriched microvesicles at the immunological synapse.</a> Nature. 507 (7490), 118-123 (2014).</li>
<li>Saliba, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+structure+of+synaptic+ectosomes+exporting+antigen+receptor+linked+to+functional+CD40+ligand+from+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Composition and structure of synaptic ectosomes exporting antigen receptor linked to functional CD40 ligand from helper T cells.</a> elife. 8, 47528(2019).</li>
<li>Barcia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+polarization+of+IFN-gamma+at+Kupfer+and+non-Kupfer+immunological+synapses+during+the+clearance+of+virally+infected+brain+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vivo polarization of IFN-gamma at Kupfer and non-Kupfer immunological synapses during the clearance of virally infected brain cells.</a> Journal of Immunology. 180 (3), 1344-1352 (2008).</li>
<li>Huse, M., Lillemeier, B. F., Kuhns, M. S., Chen, D. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+use+two+directionally+distinct+pathways+for+cytokine+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells use two directionally distinct pathways for cytokine secretion.</a> Nature Immunology. 7 (3), 247-255 (2006).</li>
<li>Kupfer, A., Mosmann, T. R., Kupfer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+expression+of+cytokines+in+cell+conjugates+of+helper+T+cells+and+splenic+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polarized expression of cytokines in cell conjugates of helper T cells and splenic B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (3), 775-779 (1991).</li>
<li>Kupfer, H., Monks, C. R., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+splenic+B+cells+that+bind+to+antigen-specific+T+helper+%28Th%29+cells+and+face+the+site+of+cytokine+production+in+the+Th+cells+selectively+proliferate%3A+immunofluorescence+microscopic+studies+of+Th-B+antigen-presenting+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Small splenic B cells that bind to antigen-specific T helper (Th) cells and face the site of cytokine production in the Th cells selectively proliferate: immunofluorescence microscopic studies of Th-B antigen-presenting cell interactions.</a> Journal of Experimental Medicine. 179 (5), 1507-1515 (1994).</li>
<li>Reichert, P., Reinhardt, R. L., Ingulli, E., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+in+vivo+identification+of+TCR+redistribution+and+polarized+IL-2+production+by+naive+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: in vivo identification of TCR redistribution and polarized IL-2 production by naive CD4 T cells.</a> Journal of Immunology. 166 (7), 4278-4281 (2001).</li>
<li>Gerard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+T+cell-T+cell+synaptic+interactions+drive+the+differentiation+of+protective+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Secondary T cell-T cell synaptic interactions drive the differentiation of protective CD8+ T cells.</a> Nature Immunology. 14 (4), 356-363 (2013).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 18 Unit 18.13 (2007).</li>
<li>Abcam. Counting cells using a hemocytometer. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer">https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer</a> (2021).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+compensation+for+flow+cytometry%3A+visualization+artifacts%2C+limitations%2C+and+caveats%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats.</a> Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).</li>
<li>Dam, T., Junghans, V., Humphrey, J., Chouliara, M., Jonsson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+T+cells+is+induced+by+binding+to+nickel-chelating+lipids+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in T cells is induced by binding to nickel-chelating lipids in supported lipid bilayers.</a> Frontiers in Physiology. 11, 613367(2020).</li>
<li>Nguyen, R., Perfetto, S., Mahnke, Y. D., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+spillover+spreading+for+comparing+instrument+performance+and+aiding+in+multicolor+panel+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design.</a> Cytometry A. 83 (3), 306-315 (2013).</li>
<li>Céspedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antigen-presenting+cells+reveal+the+diversity+and+functional+specialisation+of+extracellular+vesicles+composing+the+fourth+signal+of+T+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Synthetic antigen-presenting cells reveal the diversity and functional specialisation of extracellular vesicles composing the fourth signal of T cell immunological synapses.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Yoon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+non-activated+lymphocytes+using+three-dimensional+refractive+index+tomography+and+machine+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of non-activated lymphocytes using three-dimensional refractive index tomography and machine learning.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6654(2017).</li>
<li>Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distributions+of+autofluorescence+after+compensation%3A+Be+panglossian%2C+fret+not%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Distributions of autofluorescence after compensation: Be panglossian, fret not.</a> Cytometry A. 89 (4), 398-402 (2016).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Balint, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+attack+particles+are+autonomous+killing+entities+released+from+cytotoxic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supramolecular attack particles are autonomous killing entities released from cytotoxic T cells.</a> Science. 368 (6493), 897-901 (2020).</li>
<li>Cespedes, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+expression+of+the+hRSV+nucleoprotein+impairs+immunological+synapse+formation+with+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Surface expression of the hRSV nucleoprotein impairs immunological synapse formation with T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 3214-3223 (2014).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

BSLB'ler, model APC membranları ile uyarılan T hücrelerinin partikül çıkışını incelemek için çok yönlü araçlardır. Yöntemin esnekliği, ligandların ve sinyallerinin TSV'lerin ve supramoleküler saldırı parçacıklarının ve bileşenlerinin salgılanması üzerindeki etkilerini incelemek için karmaşık ve indirgemeci membran bileşimlerinin yeniden inşasını sağlar. Bu teknolojiyi önceden devreye konmuş TH, CTL, Tregs ve CART15 dahil olmak üzere çeşitli T hücreleri üzerinde test ettik. Bu protokol ayrıca taze ...

İmmünolojik sinaps (IS), jukstracrine bilgilerinin düzenlenmiş alışverişini kolaylaştıran fiziksel temasla uğraşan hücrelerin arayüzünde oluşan önemli bir moleküler yapıdır. Literatürde farklı IS'ler tanımlanmıştır ve giderek büyüyen bir kanıt kütlesi, bu moleküler merkezlerin hücresel ağların korunmuş bir özelliği olduğunu göstermektedir. B hücreleri, doğal öldürücü hücreler, dendritik hücreler, makrofajlar ve T hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli bağışıklık hücreleri, kısa ömürlü kontakların montajı yoluyla bilgi alışverişinde bulunur1. Multimomik çalışmalar, patojenik hücresel ağları yönlendiren lökositlerin ve stromal hücrelerin yeni alt kümelerinin anlaşılmasını ve bilinmeyen işlevlere sahip yüzey proteinlerini ifade etmeyi ilerletmektedir. Sentetik APC'ler olarak BSLB'ler, tek tek proteinlerin aktif sinyallerin, yani antijenlerin ve costimülasyon/corepression'un T hücreleri tarafından entegrasyonundaki fonksiyonel rolünün doğrudan araştırılmasına ve sonuç olarak sinyal dört olarak adlandırılan efektör parçacıkların salınmasına izin verir.
Bu makalede, model APC'lerin yüzey bileşimini taklit etmek için BSLB'leri kullanırken dikkate alınması gereken protokoller ve kritik teknik noktalar açıklanmaktadır. APC'ler üzerindeki bağışıklık reseptörlerinin ve diğer yüzey proteinlerinin nicel ölçümüne ilişkin protokoller, bu ölçülen miktarları içeren sentetik APC'lerin yeniden uzlaştırılması protokolü ile birlikte sunulmaktadır. Daha sonra, T hücrelerinin ve BSLB'nin birlikte kullanılması için gereken adımlar, akış sitometrisi kullanılarak trans-sinaptik parçacık transferinin nicel ölçümü için protokol ile birlikte sunulur. En dikkat çekici şekilde, BSLB'ler sinaptik ektozomlar (SE) olarak adlandırdığı plazma membran türevi bir tSV popülasyonunu incelemeyi kolaylaştırır. T hücre antijen reseptörü ile zenginleştirilmiş (TCR+) SE'ler TCR tetiklemesine yanıt olarak dökülür2 ve BSLBs3 tarafından verimli bir şekilde yakalanır, antijenlerin ve modellenmiş membran bileşiminin agonistik özelliklerini değerlendirmek için mükemmel bir okuma temsil eder. CD63+ eksozomlar ve supramoleküler atak parçacıkları (SMAP' ler) da uyarılmış T hücreleri tarafından salınır ve BSLB'ler tarafından yakalanır. Aktivasyonun ek okumaları ve T hücreleri tarafından elde edilen ekzosit ve litik granül salgılanması olarak kullanılabilirler. Ekzosit veziküllerinin T hücresinin etkileşim kutbuna harekete geçirilmesi, aktivasyona yanıt olarak IL-2, IFN-γ ve IL-10 gibi sitokinlerin yönlü salınımını da kolaylaştırır4,5,6,7,8. T hücreli salınan sitokinler BSLB'lerde de tespit edilebilse de, immünolojik sinapsta sitokin salınımının nicel analizini doğrulamak için şu anda daha özel bir çalışma geliştirilmektedir.
Spesifik membran bileşimlerinin T hücrelerinin sinaptik çıkışını nasıl etkilediğini sorgulamak için hedef membran bileşeninin fizyolojik yoğunluğunun tanımlanması gerekir. Hücre yüzeyi proteinlerinin akış sitometrisi bazlı nicelikleri bu protokolde önemli bir adımdır ve şunları gerektirir: 1) antikor başına bilinen florokrom sayısına sahip antikorların kullanımı (F/P) ve 2) ölçülen ortalama floresan yoğunluklarından (MFI' ler) florokrom moleküllerinin enterpolasyonunun standart bir referansı olan kıyaslama boncuklarının kullanılması.
Bu kıyaslama standartları, her biri keyfi floresan algılamanın dinamik aralığını kapsayan, giderek artan sayıda eşdeğer çözünür florokrom (MESF) içeren beş boncuk popülasyonudur. Bu standart popülasyonlar ayrı floresan zirveleri verir ve basit doğrusal regresyon ile keyfi floresan birimlerinin MESF'lere dönüştürülmesini kolaylaştırır. Elde eden MOF'lar daha sonra hücre başına ortalama bağlı molekül sayısını (veya sonraki adımlarda BSLB'yi) hesaplamak için antikor F/P değerleriyle birlikte kullanılır. Tahmini hücre yüzey alanlarının tespit edilen moleküllerin ortalama sayısına uygulanması, fizyolojik yoğunlukların molekül/μm2 olarak hesaplanmasını sağlar. Bu niceleme protokolü ayrıca T hücreleri üzerindeki protein yoğunluklarının ölçümüne ve homotipik T hücre sinapslarının oluşumuna aracılık eden membran bileşimlerinin biyokimyasal olarak yeniden oluşturulmasına (yani T-T sinapsları9) uyarlanabilir. Gerekirse, molekül başına bilinen florokrom sayısı ile etiketlenmiş rekombinant hedefler kullanılarak antikor bağlamanın valency'si daha da tahmin edilebilir. Daha sonra, antikor bağlayıcı valency, bağlı floresan proteinlerin ve nicelik antikorlarının sayısı (iki farklı nicelik florokromu ve MESF standardı kullanılarak) aynı anda karşılaştırılarak aynı BSLB popülasyonu için hesaplanabilir.
APC membranlarının yeniden uzlaştırılması, desteklenen lipid bilayerlerinin (SLB' ler) silika boncuklar üzerinde birleşmesini gerektirir1. Farklı fosfolipid türleri içeren lipozom stokları, çok yönlü bir lipid-bilayer matrisi oluşturmak için kullanılabilir ve rekombinant proteinlerin farklı bağlayıcı kimya ile tutturulmasını sağlar (lipozomların hazırlanması 10'da ayrıntılıdır). İlgili ligandın fizyolojik yoğunluğu (veya yoğunlukları" "hücreler üzerinde" tanımlandıktan sonra, aynı akış sitometri protokolü, BSLB'leri hedef fizyolojik yoğunlukla kaplamak için gereken rekombinant protein konsantrasyonu tahmin etmek için uyarlanır. İki farklı ankraj sistemi kombinasyon halinde veya ayrı ayrı kullanılabilir.
İlk olarak, Ni2+içeren fosfolipidlerin son 12,5 mol'unu içeren SLB, kare mikron10 başına yaklaşık 10.000 His-tag bağlama bölgesi sağlamak için yeterlidir ve BSLB'leri fizyolojik yoğunlukları bu maksimum yükleme kapasitesini aşmayan ticari olarak mevcut proteinlerin çoğuyla süslemek için iyi çalışır. İkinci yükleme sistemi, biyotinilasyonlu anti-CD3e Fab'ı (veya HLA/MHC monomerlerini) streptavidin köprüleri üzerinden yüklemek için biyotin içeren fosfolipidlerden (mol% olarak) yararlanır. Bu iki BSLB dekorasyon yönteminin kombinasyonu daha sonra BSLB'lerin sentetik APC'ler olarak esnek bir şekilde uyarlandırını sağlar. Son derece karmaşık APC yüzey bileşimleri için, fosfolipidlerin ve proteinlerin mol% 'i, eldeki sorunun gerektirdiği kadar protein yüklemek için artırılabilir. Proteinlerin çalışma konsantrasyonları ve biyotinillenmiş fosfolipidlerin mol% 'i tanımlandıktan sonra, BSLB'ler çokparametrik akış sitometrisi ile T hücrelerinin sinaptik çıkışını sorgulamak için monte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3- [(N- (5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit) süksinil] (nikel tuzu)</td> <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>790404C-25mg</td><td>18: 1 DGS-NTA (Ni) kloroform</td></tr><tr><td> PIPETMAN L Çok Kanallı P8x200L, 20-200 & mikro; L</td><td>Gilson</td><td>FA10011</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850375C-25mg</td> <td>& nbsp; 18:1 (&Delta; 9-Cis) Kloroformda PC (DOPC)</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE) ATTO 390</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 390-165</td><td>DOPE ATTO 390</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE) ATTO 488</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 488-165</td><td>DOPE ATTO 488</td></tr><tr><td>1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE) ATTO 565</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 565-165</td><td>DOPE ATTO 565</td></tr><tr><td>1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N- (kap biyotinil) (sodyum tuzu)</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>870273C-25mg</td><td>18:1 Biyotinil Kap PE kloroform</td></tr><tr><td>200 ve mikro; L sarı uçlar 10 x 96 Uç, Yığın</td><td>Starlab</td><td>S1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>Falcon&reg;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>5.00 &plusmn; 0.05 &mikro; m işlevselleştirilmemiş silika boncuklar</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td></td><td></td>SS05003</tr><tr><td>96 Kuyulu Hücre Kültasyon Plakası Kapaklı U-alt, Doku kültürü ile tedavi edilmiş, pirojenik olmayan.</td><td>Costar&reg;</td><td>3799</td><td>FCM boyama ve BSLB ve hücrelerin ko-kültürü için.</td></tr><tr><td>96 Kuyu Hücre Kültasyon Plakası Kapaklı V-alt, Doku kültürü ile muamele edilmiş, pirojenik olmayan.</td><td>Costar&reg;</td><td>3894</td><td>Süspansiyondaki hücrelerin veya boncukların FCM ile boyanması için.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen ve ticaret;</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen & Trade;</td><td>A37573 ve A20006</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>FCM Alüminyum Folyo için biyolojik numunelerin normal tüp boyaması için</td></tr><tr><td></td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td>Hücreleri ve BSLB'leri hafif</td></tr><tr><td>anti-insan CD154'ten (CD40L) korumak için, klon 24-31</td><td>BioLegend</td><td>310815 ve 310818</td><td>Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 647 konjugatları, sırasıyla.</td></tr><tr><td>anti-insan CD185 (CXCR5) Brilliant Violet 711, klon J252D4</td><td>BioLegend</td><td>356934</td><td>Şekil 1'de gösterildiği gibi bademcik hücrelerinin kantitatif FCM analizi için. 1E</td></tr><tr><td>anti-insan CD19 Brilliant Violet 421, klon HIB19</td><td>BioLegend</td><td>302234</td><td>Şekil 1'de gösterildiği gibi bademcik hücrelerinin kantitatif FCM analizi için. 1E</td></tr><tr><td>anti-insan CD2, klon RPA-2.10</td><td>BioLegend</td><td>300202</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan CD2, klon TS1/8</td><td>BioLegend</td><td>309218</td><td>Brilliant Violet 421 konjugatı</td></tr> ile evde etiketlenmiştir.<tr><td>anti-insan CD252 (OX40L), klon 11C3.1</td><td>BioLegend</td><td></td><td>Alexa Fluor 647 eşlenik</td></tr><tr><td>anti-insan CD28, klon CD28.2</td><td>eBioscience</td><td>16-0289-85</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan CD317 (BST2, PDCA-1) ile evde etiketlenmiş, klon 26F8</td><td>ThermoFisher Scientific, invitrojen</td><td>53-3179-42</td><td>Alexa Fluor 488 konjugat, bu klonun klon RS38E'den daha temiz olduğunu bulduk.</td></tr><tr><td>anti-insan CD38, klon HB-7</td><td>BioLegend</td><td>356624</td><td>Alexa Fluor 700 eşlenik</td></tr><tr><td>anti-insan CD38, klon HIT2</td><td>BioLegend</td><td>303514</td><td>Alexa Fluor 647 konjuge</td></tr><tr><td>anti-insan CD39, klon A1</td><td>BioLegend</td><td></td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan CD4 Brilliant Violet 650</td> ile evde etiketlenmiştir, klon OKT4 <td>BioLegend</td><td>317436</td><td>Şekil 1E'de gösterildiği gibi bademcik hücrelerinin kantitatif FCM analizi için</td></tr><tr><td>anti-insan CD4, klon A161A1</td><td>BioLegend</td><td>357414 ve 357421</td><td>PerCP/Cyanine5.5 ve Alexa Fluor 647 konjugatları, sırasıyla</td></tr><tr><td>anti-insan CD4, klon OKT4</td><td>BioLegend</td><td>317414 ve 317422</td><td>PE / Cy7 ve Alexa Fluor 647 konjugatları,</td></tr><tr><td>sırasıyla anti-insan CD40, klon 5C3</td><td>BioLegend</td><td>334304</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan CD40, klon G28.5</td><td>BioLegend</td><td></td> ile <td>evde etiketlenmiştir Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan CD45, klon HI30</td><td>BioLegend</td><td>304056 ve 368516</td><td>Alexa Fluor 647 ve APC / Cy7 konjugatları</td></tr><tr><td>anti-insan CD47, klon CC2C6</td><td>BioLegend</td><td>323118</td><td>Alexa Fluor 647 eşleniği</td></tr> <tr><td>ile etiketlenmiştiranti-insan CD54 (ICAM-1), klon HCD54</td><td>BioLegend</td><td>322702</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan CD63 (LAMP-3), klon H5C6</td><td>BioLegend</td><td>353020 ve 353015</td><td>PerCP / Siyanin5.5 ve Alexa Fluor 647 konjugatları, sırasıyla</td></tr><tr><td>anti-insan CD73, klon AD2</td><td>BioLegend</td><td>344002</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>ile evde etiketlenmiştiranti-insan CD80, klon 2D10</td><td>BioLegend</td><td>305216</td><td>Alexa Fluor 647 konjuge</td></tr><tr><td>anti-insan CD81, klon 5A6</td><td>BioLegend</td><td>349512 ve 349502</td><td>PE / Cy7 konjugatı ve sırasıyla Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester) ile evde etiketlenmiştir.</td></tr><tr><td>anti-insan CD82, klon ASL-24</td><td>BioLegend</td><td>342108</td><td>Alexa Fluor 647 eşlenik</td></tr><tr><td>anti-insan CD86, klon IT2.2</td><td>BioLegend</td><td>305416</td><td>Alexa Fluor 647 eşlenik</td></tr><tr><td>anti-insan CD8a, klon HIT8a</td><td>BioLegend</td><td>300920</td><td>Alexa Fluor 700 eşlenik</td></tr><tr><td>anti-insan CD8a, klon SK1</td><td>BioLegend</td><td>344724</td><td>Alexa Fluor 700 eşlenik</td></tr><tr><td>anti-insan HLA-A/ B/C/E, klon w6/32</td><td>BioLegend</td><td>311414 ve 311402</td><td>Alexa Fluor 647 konjugatı ve Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan HLA-DR, klon L243</td><td>BioLegend</td><td>307656 ve 307622</td><td>Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 647 konjugatları</td></tr> ile evde etiketlenmiştir.<tr><td>anti-insan ICAM-1, klon HCD54</td><td>BioLegend</td><td>322702</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan ICOS ile evde etiketlenmiş, klon C398.4A</td><td>BioLegend</td><td>313516</td><td>Ermeni Hamster IgG</td></tr><tr><td>anti-insan ICOSL, klon MIH12</td><td>BioLegend</td><td>329611</td><td>Alexa Fluor 647 eşlenik</td></tr><tr><td>anti-insan ICOSL, klon MIH12</td><td>eBioscience</td><td>16-5889-82</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan LFA-1, klon TS1/22</td><td>BioLegend</td> ile evde etiketlenmiştir <td>Evde üretilmiştir</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan OX40, klon Ber-ACT35 (ACT35)</td> <td>ile</td> evde etiketlenmiştir <td></td><td>Alexa Fluor 350018 Alexa Fluor 647 eşlenik</td></tr><tr><td>anti-insan PD-1, klon EH12.2H7</td><td>BioLegend</td><td>135230 ve 329902</td><td>Alexa Fluor 647 konjugatı ve Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan PD-L1, klon 29E.2A3</td><td>BioLegend</td><td>ile</td><td>evde etiketlenmiştir 329702 Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan PD-L2, klon 24F.10C12</td><td>BioLegend</td><td>329611</td><td>Alexa Fluor 647 eşlenik</td></tr><tr><td>anti-insan PD-L2, klon MIH18</td><td>BioLegend</td><td>345502</td><td>Evde Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>anti-insan TCRab, klon IP26</td><td>BioLegend</td><td>306712 ve 306714</td><td>Alexa Fluor 488 ve Alexa Fluor 647 konjugatları</td></tr> ile etiketlenmiştir.<tr><td>antti-insan CD156c (ADAM10), klon SHM14</td><td>BioLegend</td><td>352702</td><td></td></tr><tr><td>antti-insan CD317 (BST2, Tetherin), klon RS38E</td><td>BioLegend</td><td>348404</td><td>Alexa Fluor 647 eşlenik</td></tr><tr><td>Ermeni Hamster IgG Alexa Fluor 647 İzotip kontrolü, klon HTK888</td><td>BioLegend</td><td>400902</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester)</td></tr> <tr><td>BD Sitometre Kurulumu ve İzleme boncukları</td> <td>ile evde etiketlenmiştirBecton Dickinson & Şirket (BD)</td><td>641319</td><td>Kantitatif FCM BD FACS öncesi enstrümanların performans</td></tr><tr><td>takibiDiva</td><td>Becton Dickinson & Şirket (BD)</td><td>23-14523-00</td><td>Satın alma yazılımı</td></tr><tr><td>Sığır Seum Albümin</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, Kalsiyum klorür</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>susuz, BioReagent, böcek hücre kültürü için uygun, bitki hücre kültürü için uygun, & Sığır sütünden elde edilen% 96.0</td></tr> <tr><td>kazein, protein kinaz için substrat için uygun (defosforilasyondan sonra), saflaştırılmış toz</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>C5890</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads İnsan T-Aktivatörü CD3 / CD28</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11132D</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>ThermoFisher Scientific, Invitrogen & trade;</td><td>12321D</td><td>2 mL'den daha küçük hacimlerde Dynabeads İnsan T-Aktivatörü CD3/CD28'in çıkarılması için</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-15</td><td>ThermoFisher Scientific, Invitrogen&trade;</td><td>12301D</td><td>Dynabeads & trade'in kaldırılması için; 15 mL'den daha az hacimlerde İnsan T-Aktivatörü CD3/CD28</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu Nitelikli, Tek Atış</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>A3160801</td><td>56 oC'de 30 dakika boyunca ısı inaktivasyonuna ihtiyaç duyar</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Cytiva, GE Healthcare</td><td>GE17-1440-02</td><td>Lenfosit izolasyonu için steril polisakkarit ve sodyum diatrizoat çözeltisi</td></tr><tr><td>Sabitlenebilir Canlılık Boyası eFluor 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td>Analizler sırasında ölü hücrelerin dışlanması için</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Becton Dickinson & Şirket (BD)</td><td>Sürüm 10.7.1</td><td>Analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Grant Bio MPS-1 Çok Plakalı Çalkalayıcı</td><td>Keison Ürünleri</td><td>MPS-1</td><td>Boyama sırasında hücrelerin veya staning veya protein yüklemesi sırasında BSLB'lerin karıştırılması için (orbital ajitasyona alternatif olarak)</td></tr><tr><td>HEPES Tampon Çözeltisi (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, N- (2-Hidroksietil) piperazin-N ve prime; - (2-etansülfonik asit), 4- (2-Hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit.</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>HBS/HAS veya HBS/BSA tamponunun hazırlanması için. Biyoperformans Sertifikalı, &ge; %99,5 (titrasyon), hücre kültürü için uygun</td></tr><tr><td>HERACell 150i CO2 inkübatör, 150 L, Elektropolisajlı Paslanmaz Çelik</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51026282</td><td>Saflaştırılmış CD4+ ve CD8+ T hücrelerinin kültürlenmesi ve genişletilmesi için.</td></tr><tr><td>Hula Mikser&reg; Numune Karıştırıcı</td><td>ThermoFisher Scientific, Yaşam Teknolojileri</td><td>15920D</td><td>BSLB'lerin ve lipid ana karışımının, bloke edici çözeltilerin, protein ana karışımının ve küçük ölçekli antikor boyamalarının karıştırılması için kullanılan dikey, değişken açılı laboratuvar karıştırıcısı.</td></tr><tr><td>İnsan Serumu Albümini, %30 sulu çözelti</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>12667-M</td><td></td></tr><tr><td>İnsan TruStain FcX Fc Reseptör Bloke Etme Çözeltisi</td><td>BioLegend</td><td>422302</td><td>Fc Reseptör Engelleme Biyolojik olarak ilgili örneklerden Fc Reseptörlerinin bloke edilmesi için çözelti</td></tr><tr><td>Innovatis CASY hücre sayacı ve analizörü TT</td><td>Biovendis Products GmbH</td><td></td><td>Hücrelerin sayımı ve elektrik akımının dışlanmasına dayalı olarak hücre boyutunun ve hacminin belirlenmesi için.</td></tr><tr><td>KCl, Potasyum klorür</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>Toz, BioReagent, hücre kültürü için uygun</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2, Magessium chloride</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td>BioReagent, hücre kültürü için uygun, böcek hücre kültürü için uygun</td></tr><tr><td>24 x 1.5/2.0 mL için Mikrotüp Ek Parça tüpler</td><td>Keison Ürünleri</td><td>P-2-24</td><td>Grant Bio MPS-1 Çok Plakalı Çalkalayıcı</td></tr><tr><td>Mini İnkübatör</td> Labnet International için mikrotüp ek parça<td>&nbsp;</td><td>I5110A-230V</td> CO2Minimum Esansiyel Ortam Esansiyel Olmayan Amino Asitlerin <td>yokluğunda BSLB ve hücrelerin inkübasyonu (birlikte kültürlenmesi) için</td></tr> <tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Fare IgG poliklonal antikor kontrolü</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>PP54</td><td>Fare IgG yakalama boncuğu standartlarına</td></tr> <tr><td>bağlı antikorların ölçümü için pozitif kontrol olarak kullanılırFare IgG1, k Isotype, klon MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400129, 400112, 400130, 400144, 400128 ve 400170</td><td>Alexa Fluor 488, PE, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 700, APC / Cyanine7 ve Brilliant Violet 785 & nbsp; konjugatları, sırasıyla.</td></tr><tr><td>Fare IgG1, k İzotip, klon X40</td><td>Becton Dickinson & Şirket (BD), Horizon</td><td>562438</td><td>Parlak Menekşe 421 eşleniği.</td></tr><tr><td>Fare IgG1, &kappa; İzotip kontrolü, klon P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>14-4714-82</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester) ile evde etiketlenmiştir</td></tr> <tr><td>Fare IgG2a, k İzotip, klon MOPC-173</td><td>BioLegend</td><td>400240</td><td>Alexa Fluor 647 eşlenik</td></tr><tr><td>Fare IgG2b, k İzotip, klon MPC-11</td><td>BioLegend</td><td>400330 ve 400355</td><td>Alexa Fluor 647 ve Brilliant Violet 785 konjugatları,</td></tr><tr><td>Multiwell 6 kuyulu Vakumlu gaz plazma ile muamele edilmiş doku kültürü</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>Saflaştırılmış CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin kültürlenmesi ve genişletilmesi için.</td></tr><tr><td>Na2HPO4, Disodyum Fosfat</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl, Sodyum klorür</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>BioReagent, hücre kültürü için uygun, böcek hücre kültürü için uygun, bitki hücre kültürü için uygun, & % 99</td></tr> <tr><td>NiSO4, Nikel (II) sülfat</td><td>Merck, Sigma-Aldrich</td><td>656895</td><td>NTA bölgelerini doyurmak için; bloke etme işlemi sırasında eklenir</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin [+] 10.000 birim Penisilin; [+] 10.000 ve mikro; g/mL Streptomisin</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Tuz pH 7.4, steril</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>10010</td><td>No Ca 2 + veya Mg2 + eklendi</td></tr><tr><td>Polietersülfon (PES) Filtre ünitesi</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>&nbsp; UY-06730-43</td><td>Düşük protein bağlamalı hidrofilik PES membranı, yüksek protein içerikli çözeltilerin filtrelenmesini kolaylaştırır</td></tr><tr><td>PURESHIELD argon ISO 14175-I1-Ar</td><td>BOC Ltd.</td><td>11-Y</td><td>+4 ° C'de depolanan lipit stoklarının korunması için.</td></tr><tr><td>Saflaştırılmış Streptavidin</td><td>BioLegend</td><td>280302</td><td></td></tr><tr><td>Quantum Alexa Fluor 488 MESF boncuk</td><td>Bangs Laboratories Inc.</td><td>488</td><td>Alexa Fluor'un hücrelere ve/veya BSLB Quantum Alexa Fluor 647 MESF boncuklarına bağlı moleküllerin enterpolasyonu için kıyaslama boncukları</td></tr><tr><td></td><td>Bangs Laboratories, Inc.</td><td>647</td><td>Hücrelere ve/veya BSLB'ye bağlı Alexa Fluor 647 moleküllerinin enterpolasyonu için kıyaslama boncukları</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare IgG Kappa Hafif Zincir, klon OX-20</td><td>ThermoFisher Scientific, invitrojen</td><td>SA1-25258</td><td>Alexa Fluor 647 NHS Ester (Süksinimidil Ester) ile evde etiketlenmiştir</td></tr> <tr><td>Rekombinant insan IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RMPI Medium 1640 (1x); [-] L-Glutamin</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Rozet İnsan B Hücresi Zenginleştirme Kokteyli</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>15064</td><td>Saflaştırılmış hücre popülasyonlarındaki protein yoğunluklarını ölçmek için B hücrelerinin izolasyonu</td></tr><tr><td>Rozet İnsan CD4+ T Hücre Zenginleştirme Kokteyli</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>15022C.1</td><td></td></tr><tr><td>Rozet İnsan CD4 + CD127low T Hücre Zenginleştirme Kokteyli</td><td>STEMCELL Teknolojiler</td><td>15361</td><td>CD4 + CD127Low T hücrelerinin FACS ile aşağı akış izolasyonu için ön zenginleştirme.</td></tr><tr><td>Rozet İnsan CD8+ T Hücre Zenginleştirme Kokteyli</td><td>STEMCELL Teknolojileri</td><td>15063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Orta 1640 (1x); [-] Fenol Kırmızısı</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11835-063</td><td>CO2 yokluğunda BSLB ve hücrelerin inkübasyonu (birlikte kültürlenmesi) için. Fenol kırmızısı içermeyen ortam, akış sitometrisi ve mikroskopi tabanlı ölçümlerde hücrelerin otofloresansını azaltır.</td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific, Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Sprout mini santrifüj</td><td>FisherScientific, Heathrow Scientific LLC</td><td>120301</td><td>1,5 mL Eppendorf tüplerinde silika boncukları ve BSLB'yi yıkamak için kullanılan tezgah üstü mikrosantrifüj.</td></tr><tr><td>Steril kapaklı 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpler</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads Kompanzasyon Boncukları</td><td>ThermoFisher Scientific, invitrogen</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Tuz Giderme Kolonları 7K MWCO</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen&trade;</td><td>89882</td><td></td></tr></tbody></table>

t hücreli İmmün sinapsların partikül Çıkışını İncelemek için boncuk destekli lipid bilayerlerin hazırlanması

Preparation of Bead-supported Lipid Bilayers to Study the Particulate Output of T Cell Immune Synapses

Antijen sunan hücreler (APC'ler) fiziksel temas halinde olan T hücrelerine üç aktive edici sinyal sunar: 1) antijen, 2) costimülasyon / corepression ve 3) çözünür sitokinler. T hücreleri aktivasyona yanıt olarak iki tür efektör parçacık salgılar: hücrelerarası habercileri aktaran ve sitotoksikliğe aracılık eden trans-sinaptik veziküller (tSV' ler) ve supramoleküler saldırı parçacıkları. Bu varlıklar, T hücreleriyle fiziksel temas halinde olan APC'ler tarafından hızla içselleştirilir ve karakterizasyonlarını korkutucu hale getirir. Bu makale, bu trans-sinaptik parçacıkları yakalamak ve analiz etmek için boncuk destekli Lipid Bilayer'leri (BSLB' ler) antijen sunan hücre (APC) mimetikleri olarak imal etmek ve kullanmak için protokol sunmaktadır. Ayrıca, hücre yüzeylerindeki protein yoğunluklarının mutlak ölçümleri, BSLB'lerin bu fizyolojik düzeylerle yeniden uzlaştırılması ve T hücreleri tarafından sinaptik parçacık salınımını izlemek için akış sitometri prosedürü için protokoller açıklanmıştır. Bu protokol, yardımcı T hücreleri, sitotoksik T lenfositleri, düzenleyici T hücreleri ve kimerik antijen reseptör ifade eden T hücreleri (CART) dahil olmak üzere, bireysel proteinlerin, karmaşık ligand karışımlarının, patojen virülans belirleyicilerinin ve ilaçların T hücrelerinin efektör çıkışı üzerindeki etkilerini incelemek için uyarlanabilir.

Hücre yüzeyinde mutlak protein nicelemesi için FCM Ligandların fizyolojik yoğunluklarını sunan BSLB'lerin yeniden uzlaştırılması, modellenen hücre alt kümesindeki toplam protein yoğunluklarının tahminini gerektirir. BSLB'leri yeniden inşa etmek için, BSLB ile hücreler arasındaki yapışmayı ve fonksiyonel etkileşimi destekleyen proteinlerin yanı sıra, örneğin CD40, CD58 ve B7 reseptörleri (CD80 ve CD86) gibi ilgili ligandları da ekleyin. ICOSL3, PD-L1 ve PD-L215 gibi costimulatory moleküller de dahil<su...

Burada Boncuk Destekli Lipid Bilayers kullanılarak sentetik antijen sunan hücrelerin adım adım yeniden uzlaştırılması ve aktif T hücrelerinden sinaptik çıkışı sorgulamak için kullanımları için protokolü sunuyoruz.

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

Antigen-presenting cells (APCs) present three activating signals to T cells engaged in physical contact: 1) antigen, 2) costimulation/corepression, and 3) ...

İmmün sinaps çıkışının incelenmesi çoğunlukla mikroskobik yöntemlerle sınırlandırıldı. BSLB'ler, akış sitometrisi, mikroskopi, proteomi ve RNA dizileme teknolojileri de dahil olmak üzere T hücreli bağışıklık sinapslarının çıkışını incelemek için kullanılabilecek araçlar repertuarımızı genişletti. Bu nedenle, BSLB'ler çok çeşitli immünoloji sorularında ve T hücre çıkışının bileşimini ve biyokimyasal düzenlemesini tanımlamak için kullanılabilir.Bu, örneğin, kimerik antijen reseptörlerinin, belirli sinyal yollarını inhibe eden ilaçların veya ilgi genlerinin genetik ablasyonunun incelenmesini içerir. Bu protokolün en kritik yönlerinden biri, protein kalibrasyonlarını ve trans-sinaptik ilgi parçacıklarını izlemek için gereken çok renkli akış sitometri panelini optimize etmektir. Bu, protein konsantrasyonlarının, antikor konsantrasyonlarının ve cihaz ayarlarının sistematik olarak yinelenmesini gerektirir.Bir mikrolitre boncuk çözeltisini 1.000 mikrolitre PBS ile seyrelterek başlayın. Boncukları bir hemositometre odası kullanarak sayın ve mililitre başına konsantrasyonlarını hesaplayın. Ardından, titrasyon noktası başına 500.000 nihai BSLB için gereken silika boncuklarının hacmini hesaplayın.Gerekli miktarda silika boncukları steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Silika boncuklarını bir mililitre steril PBS ile üç kez yıkayın ve boncukları santrifüj edin. Nikel içeren fosfolipidlerin son 12,5 köstebek yüzdesini içeren üç hacimli lipozom ana karışımı hazırlayın.Yıkanmış silika boncuklarını yeniden depolamak için lipozom ana karışımını kullanın. Ardından, toplam hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak hafifçe karıştırın. Steril bir teknik kullanarak, havayı yerinden etmek ve lipitleri karıştırma sırasında oksidasyondan korumak için tüpe argon veya azot gazı ekleyin.0.4 milimolar lipit stoklarına argon ekleyin. Stoku saklayın ve steril bir teknik kullanarak manipüle edin. BSLB'leri dikey karıştırıcıya taşıyın ve 10 RPM'de yörüngesel karıştırma kullanarak oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın.Ardından, bir tezgah üstü minicentrifuge üzerinde oda sıcaklığında 15 saniye santrifüj yaparak boncukları aşağı çevirin. BSLB'lerdeki NTA sitelerini doyurmak için 100 mikromoler nikel sülfat içeren%5 BSA mililitre ekleyerek oluşan BSLB'leri engelleyin.Yeni bir U-bottom veya V-bottom 96-well plakası alın ve proteinlerin iki kat seri seyreltmelerini hazırlayın. Hazırlanan BSLB'leri 100 mikrolitre HBS-HSA tamponu 500.000 BSLB içerecek şekilde yeniden diriltin. Ardından, başka bir U-bottom veya V-bottom 96-well plakası alın ve BSLB süspansiyonunun 100 mikrolitresini her kuyu 500.000 BSBL alacak şekilde kuyulara aktarın.İkinci plakayı oda sıcaklığında 300x G'de iki dakika döndürün.Süpernatantı atın ve protein titrasyon plakasından 100 mikroliter hacmini çökelmiş BSLB'leri içeren tabağa aktarın. Işıktan korumak için alüminyum folyo kullanın ve oda sıcaklığında 1.000 RPM'de 30 dakika kuluçkaya yat.Daha sonra tabağa HBS-HSA tamponu ekleyerek plakayı üç kez yıkayın ve 300x G'de iki dakika oda sıcaklığında aşağı doğru döndürün.Yıkadıktan sonra hücreleri sayın. Daha sonra, sinaptik transfer tahlil ortamını kullanarak mililitre başına 2,5 milyonluk son konsantrasyona seyreltin. BSLB'ler protein karışımı ile yüklendikten sonra, fazla ilişkisiz proteinleri çıkarmak için BSLB'leri HBS-HSA tamponu ile iki kez yıkayın.200 mikrolitre HBS-HSA tamponunda kuyu başına 500.000 BSLB'yi yeniden diriltir. Kuyu başına 100 mikrolitre BSLB'yi, bir kopya yapmak için yeni bir U-bottom 96 kuyu plakasına aktarın, böylece kuyu başına son BSLB miktarı 250.000'dir. BSLB'leri oda sıcaklığında iki dakika boyunca 300x G'de döndürün.Süpernatantı atın ve ardından 100 mikrolitre T hücre süspansiyonu kullanarak BSLB'leri yeniden diriltin. Kabarcık oluşumunu önlemek için hafifçe karıştırın. 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca ortak kültürleri kuluçkaya yatırın.Hücreleri ışıktan koruyun ve önce oda sıcaklığında en az 15 dakika kuluçkaya yatırarak ortak kültürleri soğutun. Oda sıcaklığındaki ortak kültürleri 500x G'de beş dakika santrifüjleyin.Süpernatantı atın ve tıkanma için oda sıcaklığında kalsiyum ve magnezyum iyonsuz% 2 BSA PBS'deki ortak kültürleri yeniden biriktirin. Hücreleri 45 dakika boyunca buza yerleştirin ve ışıktan koruyun.Buz gibi 0,22 mikrometre filtreli %2 BSA ve PBS'yi boyama tamponu olarak kullanarak antikor ana karışımını hazırlayın. Bu ana karışım ekstra engelleme sağlayacaktır. 500x G'deki ortak kültürleri beş dakika ve dört santigrat derece döndürün.Süpernatantları atın ve ardından optimize edilmiş antikor konsantrasyonları içeren boyama ana karışımındaki hücreleri yeniden kullanmak için çok kanallı bir pipet kullanın. İzotip etiketli hücreler ve BSLB'ler, floresan ve floresan olmayan BSLB'ler ve tek başına lekelenmiş hücreler ve BSLB'leri içerir. Hacmin yarısını yukarı ve aşağı pipetleyarak hafifçe karıştırın.Buzda 30 dakika kuluçkaya yat ve onları ışıktan koru. Hücreleri ve BSLB'leri buz gibi %2 BSA PBS kullanarak iki kez yıkayın. Onları 500x G'de 4 santigrat derecede beş dakika döndürün.Santrifüjlemeden sonra, kuyuların dibindeki ortak kültür tortularını kontrol edin. Daha sonra, yıkanmış ortak kültürleri 100 mikrolitre PBS'de yeniden diriltin ve hemen elde edin. Yan dağınık ışık için günlük ölçeğini ve yan ve ileri dağınık ışıklar için uçuş zamanı parametresini etkinleştirin.Hem loş ayarlı hem de en parlak popülasyonların cihazın doğrusal aralığına düşmesini sağlayarak MESF standartlarını elde edin. Ardından, ücret örnekleri alın, telafiyi hesaplayın ve ücret matrisini denemeye uygulayın. Her nicelik kanalı için en az 20.000 toplam MESF standardı alın ve kaydedin.FACS kılıf sıvısı veya yeniden canlanan MESF boncuklarına benzer kullanmaktan kaçının, çünkü bunlar florokromları yok edecek tuzlar ve alkoller içerir, bu da daha geniş floresan zirvelerine ve yüksek hataya yol ırkar. Yüksek verimli örnekleyiciler kullanarak satın alma için, cihaz alımını Standart olarak ayarlayın, numune alımını 80 mikrolitreye ayarlayın. Saniyede iki ila üç mikrolitre arasında numune Akış Hızı, 50 mikrolitrede numune Karıştırma Hacmi, saniyede 150 mikrolitrelik numune Karıştırma ve üç ila beş arasında kuyu başına karıştırma.Örnek başına en az 10.000 tek BSLB elde edin. Son olarak, FCS dosyalarını dışa aktar. Bademcikler B hücreleri ve yardımcı T hücrelerinin yüzeyinde ICAM-1'in nicel akış sitometrisi ölçümlerine bir örnek burada gösterilmiştir.Temsili görüntüler, insan palatin bademciklerinden izole edilmiş tek CXCR5 B hücrelerini ve foliküler yardımcı T hücrelerini analiz etmek için gating stratejisini açıklar. Bu sıralı gating stratejisi, sürekli edinme penceresindeki tek canlı olayları tanımlar. ICAM-1'in FMO kontrolleri ve FMO kontrollerine kıyasla hücre yüzeyi ekspresyosu olan ve popülasyonların ilgili izotipleriyle etiketlenmiş çiftler burada gösterilmiştir.MESF popülasyonlarının çakışmış histogramlarında farklı standart MESF popülasyonlarından MPI'ların gating ve ölçümü burada gösterilmiştir. Değerler, beş MESF popülasyonunun her biri için MFI'leri temsil eder. MESF popülasyonları için mesf'in cMFI üzerinden doğrusal regresyonu burada sunulmuştur.Eğim, TFH'deki bademcikler B hücrelerinin yüzeyindeki ICAM-1'in FCM verilerinden hücrelere bağlı MESF'yi çıkarır. Mutlak moleküler yoğunluklara dönüşüm bu basit matematiksel işlemleri takip eder. Temsili görüntüler, rekombinant monomerik ICAM-1 12 histidinlerinin artan yoğunlukları ile yeniden inşa edilen BSLB'lerin akış sitometri analizini göstermektedir.ICAM-1 referans konsantrasyonunun ölçülen yoğunluk üzerindeki regresyon analizleri burada gösterilmiştir. Eğim, hücrelerin yoğunluğunu elde etmek için hedef protein konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanılır. Akış diyagramları, T hücrelerini BSLB'lerle birlikte kültleştirmek, akış sitometrisi ile parçacık transferinin sonraki ölçümünde model membranlarını yeniden inşa etmek için kritik adımları gösterir.Sürekli edinme penceresindeki tek BSLB'leri ve hücreleri tanımlamak için gating stratejisi burada gösterilmiştir. Bu protokolün en önemli yönlerinden biri, sonuçların tekrarlanabilirliğini korumak için, protein veya lipit stoklarını her değiştirdiğinizde, yeni kalibrasyon analizi yapmanız gerektiğidir. Farklı T hücre alt kümeleri tarafından salgılanan yeni etkili molekülleri keşfetmek için BSLB'ler, transkriptomik ve proteomik analize tabi tutulduğu için floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile daha da izole edilebilir.Oxford Üniversitesi'ndeki meslektaşlarımız bu teknolojiyi yeni reseptör-ligand etkileşimlerini incelemek ve göstermek ve ayrıca genetik ablasyonların T hücre bağışıklık sinapsının çıktısı üzerindeki etkilerini incelemek için kullandılar.

preparation-bead-supported-lipid-bilayers-to-study-particulate-output

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Desteklenen düzlemsel bilayers immünolojik sinaps moleküler etkileşimleri modellemek için kullanılabilir güçlü araçlardır. Burada, lipid bilyer üst broşür sinaps oluşumunu modüle ve sinaps oluşumu TIRF mikroskobu kullanarak görselleştirmek için bilinen hücre adezyon proteinleri demirleme için yöntemler göstermektedir.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Bu video, lipid çift katmanları ile kaplanmış mikroküreler üzerinde septin protein düzeneğini inceleme tekniğini açıklar. Bu teknik, eğri yüzeyler üzerindeki eğriliğe bağlı protein düzeneklerinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Küresel Destekli Lipid Çift Tabakalı Deney: Mikroküreler Üzerinde Septin Düzeneğini Gözlemlemek İçin Bir Teknik

Bu video, desteklenen bir lipid çift tabakası (SLB) üzerinde doğal öldürücü (NK) hücrelerde immünolojik sinaps oluşumunu görselleştirmek için bir tekniği göstermektedir. SLB ilk olarak florofor etiketli bir NK hücre aktive edici reseptör ligandı ile etiketlenir, ardından NK hücreleri ile inkübasyon yapılır. Daha sonra, hücreler polimerize aktin ve perforin pozitif litik granüller için boyanır. Bu yaklaşım, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobu kullanılarak sinaps oluşumunun...

Desteklenen Bir Lipid Çift Tabakası Üzerinde NK Hücre İmmünolojik Sinaps Oluşumunun Süper Çözünürlüklü Görüntülenmesi

Bu video, birincil insan T hücreleri ile desteklenen lipid çift katmanları (SLB) arasındaki immün sinaps oluşumunu incelemek için bir in vitro tekniği göstermektedir. T hücresi yüzey proteinleri, bir immün sinaps oluşturmak için SLB üzerinde hareketsiz hale getirilen ilgili ligandlarla etkileşime girer, ardından litik granüllerin sinapsa doğru hareketi izler, bu da floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Desteklenen Düzlemsel Lipid Çift Katmanları ile T Hücresi Etkileşimini İncelemek İçin Bir İn Vitro Teknik

Bu video, sentetik antijen sunan hücrelerin Boncuk Destekli Lipid Çift Katmanları aracılığıyla sulandırılmasını ve bunların aktive edilmiş T hücreleri tarafından üretilen sinaptik çıktıyı değerlendirmedeki uygulamalarını göstermektedir.

T Hücrelerinden Sinaptik Çıktıyı Araştırmak için Boncuk Destekli Lipid Çift Katmanlarının Kullanılması

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır ve doğal zar parçacıkları hücre zarlarının özelliklerini yaklaşık ve analitik çeşitli stratejiler dahil edilmesi uygun sistemlerdir. Burada destekli lipid iki katmanlı kaplı SiO 2 boncuklar, fosfolipid vezikülleri ya da doğal zar parçacıklarının oluşan mikrodizileri hazırlanması için bir yöntemi göstermektedir.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Burada, immünolojik sinapslar oluşturmak için cam destekli lipid çift katmanlı tekniğin, uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) mikroskobunun süper çözünürlüklü görüntüleme tekniği ile bir kombinasyonunu açıklıyoruz. Bu protokolün amacı, kullanıcılara bu iki tekniği başarılı bir şekilde uygulamak için gerekli talimatları sağlamaktır.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

Adaptif bağışıklık, T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasında oluşan dinamik 'immünolojik sinapslar' tarafından kontrol edilir. Bu protokol, endotel hücrelerinin hem az çalışılmış fizyolojik APC'ler hem de yeni bir 'düzlemsel hücresel APC modeli' türü olarak araştırılması için yöntemleri tanımlar.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

Biz bir sıvı lipid iki katmanının çevrili nanometrik protein yamaları ile cam fonksiyonel hale getirilmesi için bir protokol mevcut. Bu alt tabakalar gelişmiş optik mikroskop ile uyumludur ve hücre yapışması ve göç çalışmaları için platform olarak hizmet etmesi beklenmektedir.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

Bu protokolde tek lipid ve multi-lipid vesicles, desteklenen lipid bilayerler ve askıda lipid bilayerleri taklit eden hücre oluşumu açıklanmaktadır. Bu in vitro modeller çeşitli lipit tiplerini içerecek şekilde uyarlanabilir ve çeşitli molekül ve makromolekül etkileşimlerini araştırmak için kullanılabilir.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Öğrenin, T hücreli immün sinapsların partikül çıkışını incelemek için boncuk destekli lipid bilayerlerin (BSLB) hazırlanması ve akış sitometrisi ile analiz yöntemlerini.

T Hücreli İmmün Sinapsların Partikül Çıkışını İncelemek için Boncuk Destekli Lipid Bilayerlerin Hazırlanması

Daha fazla video keşfet