Overview
מקור: המעבדה של ג'ף סלקופ - אוניברסיטת מסצ'וסטס אמהרסט
ההפצה של קבוצה של סמנים ביולוגיים אורגניים הנקראים גליצריל-דיאלקל גליצרול-טטראת'רס (GDGTs), המיוצרים על ידי חבילה של ארכאה וחיידקים, נמצאו משקעים מודרניים כדי לשנות באופן צפוי בתגובה לטמפרטורת האוויר או המים1,2. לכן, ניתן להשתמש בהתפלגות של סמנים ביולוגיים אלה ברצף של משקעים של גיל ידוע כדי לשחזר את האבולוציה של אוויר ו/או טמפרטורת המים על decadal כדי לוחות זמנים של אלפי שנים (איור 1). הייצור של רשומות ארוכות ברזולוציה גבוהה של אקלים בעבר, הנקרא פליאוקלימטולוגיה, תלוי בניתוח מהיר של מאות, אולי אלפי דגימות. טכניקות מיצוי ישנות יותר, כגון sonication או Soxhlet, הם איטיים מדי. עם זאת, טכניקת מיצוי ממס מואצת חדשה יותר תוכננה תוך התחשבות ביעילות.
איור 1. דוגמה לתיעוד פליאוקלימט המציג שינויים בטמפרטורת פני הים (SST) במזרח הים התיכון במהלך 27,000 השנים האחרונות3. רשומה זו כוללת ~ 115 דגימות ומבוססת על פרוקסי TEX86 SST מבוסס איזופרנואידים.
Principles
מיצוי ממס מואץ הוא סימן מסחרי (תרמו מדעי Dionex) שיטה של מיצוי המשתמש בטמפרטורות גבוהות (~ 100 °C )C) ולחצים (~ 1,200 psi) כדי להגדיל את הקינטיקה של תהליך החילוץ. המחלץ, הנקרא מחלץ ממס מואץ, או ASE (איור 2), יכול להכיל עד 24 דגימות בודדות. לאחר ASE נטען מוגדר לפעול, זה אוטומטי לחלוטין. ASE מאפשר שליטה אלקטרונית של כל תהליך החילוץ: טמפרטורת החילוץ, לחץ, נפח ממס, תערובת ממס, משך, שטיפה, וחזרה הם כולם מתכווננים מדגם לדגימה. רוב מעבדות הגיאוכימיה האורגנית משתמשות כעת ב- ASE כשיטה סטנדרטית של מיצוי ממסים.
איור 2. מחלץ ממס מואץ (ASE).
מיצוי ממס מואץ הוא טכניקה מהירה, יעילה ובעלת תפוקה גבוהה המשמשת להפרדת סמנים ביולוגיים אורגניים ממספר רב של דגימות משקעים גיאולוגיות.
באופן מסורתי, שיטות החילוץ כגון sonication או Soxhlet משמשים, עם זאת, החיסרון עם פרוטוקולים אלה הוא שהם איטיים מדי לעבד מספיק חומר לשחזור פליאוקלימט מפורט. טכניקה חדשה יותר, מיצוי ממס מואץ, או שיטת ASE, פותחה עם יעילות ותפוקה גבוהה בראש.
שיטת ASE משתמשת בשילוב של טמפרטורות גבוהות ולחץ גבוה כדי לחלץ דגימות ויכולה לבצע דגימות מרובות בריצת הכנה אחת ומהירה יחסית.
סרטון זה הוא השלישי בסדרה המפרטת כיצד לחלץ סמנים ביולוגיים ממ משקעים. זה יכסה את ההליך ולספק תובנה על היתרונות של ASE על sonication או מיצוי Soxhlet.
בהפקת ממס מואצת, דגימות נטענות לתאי פלדה שנטענים לאחר מכן על קרוסלה. בקבוקוני איסוף עבור כל תא לדוגמה נטענים גם על קרוסלה נפרדת. המכשיר טוען תא לדוגמה לתנור פנימי. ממס נשאב מבקבוק ממס דרך סדרה של שסתומים עד ללחץ מספיק הוא הגיע.
לחץ זה מוחזק למשך פרק זמן המוכתב על ידי המדגם והניתוח. לאחר מכן, הממס הוא הסמיק מתא המדגם דרך קו פלדה לתוך בוחן האוסף המתאים. ניתן לחזור על התהליך מספר פעמים. ניתן להתאים אישית את הטמפרטורה, הלחץ ומשך הזמן עבור המדגם.
הטמפרטורה הגבוהה המשמשת מגבירה את הקינטיקה של החילוץ בעוד הלחץ הגבוה שומר על הממס מפני תנודתיות. מקטורן האוסף מכיל כעת תמצית שומנים מוחלטת, ומה שנשאר בתא המדגם נקרא שאריות. הוא כולל חומר לא אורגני, כמו גם חומר אורגני שאינו ניתן לחילוץ ממס, הנקרא קרוגן.
עכשיו שאנחנו מכירים את העקרונות מאחורי מיצוי ממס מואץ, בואו נסתכל על איך זה מתבצע במעבדה.
לאחר איסוף דוגמאות של עניין; יבש בהקפאה, הומוגני, וטיהור כפי שהודגם בסרטון אחר בסדרה זו.
לאחר שכל הדגימות הוכנו, להרכיב תא עבור כל אחד להיות חילוץ, ואחד נוסף עבור ריק. כדי לעשות זאת, בורג מכסה קצה על גוף התא. בעזרת פינצטה שטופה בממס, מניחים מסנן סיבי זכוכית בעירה על גבי כל אחד מהם. לחץ לאט ובעדינות על המסנן כלפי מטה עם הבוכנה.
סמן את גופי התא לפי מספר עבור כל דגימה, וסמן את הריק בנפרד. מניחים פח שקילה בעירה על סולם מעבדה ואר. לשטוף מרית עם ממס, ולאחר מכן להשתמש בו כדי להעביר 5 עד 10 גרם של מדגם לפח שקילה, ולתעד את המסה.
מעבירים את כל החומר בפח השקילה לתא המתאים לו. מניחים מסנן סיבי זכוכית נוסף למעלה, ולחם בעדינות עד שהוא מגיע לחלק העליון של המדגם.
הוסף מפזר, כגון אדמה או חול הצורנית, עד שהוא כמעט מלא, נזהר להימנע מלהכניס פסולת לחוטים של גוף התא. כיפה החלק העליון של התא עם מכסה קצה אחר. חזור על שלבים אלה עבור כל דוגמה והריק.
סמן כל בון אוסף במספר של תא לדוגמה מתאים או ריק, וכיפה עם מכסה בריון. מקם כל תא בחריץ ממוספר על מגש ASE העליון. הגדר את הפרמטרים עבור שיטת החילוץ באמצעות לוח המקשים ב- ASE כדי לחלץ ב 100 °C (70 °F) ו- 1,200 פסאיי. לחלץ כל מדגם 3 פעמים עם אחיזה סטטית של 10 דקות לשטוף את גוף התא עם 50% של הנפח הכולל שלה בין החזקות סטטיות.
לאחר מכן, ודא כי בקבוק ממס מכיל מספיק כדי לחלץ את כל הדגימות. יש לשטוף את קווי המכשירים 3 פעמים לפני תחילת הריצה. לבסוף, לחץ על התחל.
הסר את המשחקון מן ASE. עכשיו שהסמנים הביולוגיים חולצו, הם חייבים להיות מטוהרים לפני הניתוח.
מיצוי ממס מואץ היא טכניקה רב-תכליתית, אשר ניתן להשתמש בה עבור מגוון רחב של יישומים, שחלקם נחקרים כאן.
מיצוי ממס מואץ יכול לשמש גם על סוגים אחרים של מדגם, כולל מזון. ניתוח שאריות לבדיקת זיהום חומרי הדברה מתבצע לעתים קרובות במתקנים רגולטוריים ותעשייתיים כדי לברר את הבטיחות והאיכות של מוצרי מזון כמו פירות או ירקות. ASE יכול לשמש כדי לחלץ חומרי הדברה organochlorine מדגימות מזון, ולקבוע את הסוגים או רמות של שאריות נוכח התוצרת. לאחר מכן ניתן להשתמש במידע זה כדי לקבוע אם התוצרת מתאימה לצריכה אנושית או מן החי. לדוגמה, dieldrin צריך להימצא בתוך 0 עד 0.1 חלקים למיליון על מזון, בהתאם למוצר.
ניתן לחלץ רכיבים תזונתיים מזון גם באמצעות ASE. לדוגמה, מוצרים כמו שוקולד, אשר עשוי להיות תוכן שומן כבידתי גבוה, ניתן לחלץ. באמצעות ASE עם אתר נפט כממס, שומן ניתן להפריד מדגימות שוקולד נתון לניתוח כמותי כדי לקבוע תוכן שומן אחוז מדויק לכל כמות ידועה של שוקולד. באמצעות מידע זה, גופים רגולטוריים יכולים לאמת טענות שנעשו על ידי יצרני שוקולד, או יצרנים יכולים להשיג מידע כדי ליצור תוויות מזון מדויקות.
הרגע צפית בהקדמה של JoVE להפקת סמנים ביולוגיים שומנים באמצעות מיצוי ממס מואץ, או ASE. שיטות לעיבוד וניתוח נוספים ניתן למצוא בסרטונים הבאים.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. איסוף החומרים הדרושים
- לחלץ דגימות. דגימות (במקרה זה, משקעים) קפואים, מיובשים בהקפאה, מרוסקים והומוגניים לפני החילוץ, ומופקים בקבוצות כדי למקסם את היעילות.
- בהתאם לגודל המדגם, השתמש בבקבוקוני אוסף עם נפחים של 40 או 60 מ"ל. לניסוי זה, בקבוקוני זכוכית בורוסיליקט (40 מ"ל) וכובעים בטוחים ממס משמשים. בקבוקוני Combust, פיפטות זכוכית בורוסיליקט, ופחיות שקילה ב 550 °C (6 שעות לפני להבטיח הסרה של מזהמים אורגניים אפשריים.
- דיכלורומטן (DCM) ומתנול נפוצים ברוב מעבדות הגיאוכימיה האורגנית. השתמש בהם בנפרד, (מתנול הראשון, ואחריו DCM) לשטוף כלי מעבדה וכלי זכוכית לפני השימוש. תערובת של דיכלורומתאן למתנול (MeOH; 9:1) משמשת במעבדות רבות לחילוץ יעיל של סמנים ביולוגיים עם מגוון רחב של קוטביות. ממיסים צריכים להיות נקיים ממזהמים אורגניים.
- להשיג מחלץ ממס מואץ לשימוש לניסוי זה.
2. הכנת תאים לדוגמה
- להרכיב תא לדוגמה עבור כל דגימה שיש לחלץ, בתוספת ריק אחד.
- עבור כל תא, בורג מכסה קצה בקצה אחד של גוף התא.
- מניחים מסנן סיבי זכוכית בעירה על גבי כל תא באמצעות פינצטה שטופה בממס. לאחר מכן, לחץ בעדינות ובאיטיות את המסנן למטה לתוך התא באמצעות בוכנה המסנן.
- תייג את גופי התא לפי מספר (לדוגמה 1 - 22) עבור כל דגימה וכתוב "ריק" בתא הריק.
- מלאו את החסר באדמה הצורנית (או בחול) וכובע עם מכסה קצה שני. להדק ביד.
3. הכנת דוגמאות
- מניחים פח שקילה בעירה על סולם המעבדה ואז טרה.
- לשטוף את מרית המעבדה עם ממס, ולאחר מכן להשתמש בו כדי להעביר מסה מתאימה של מדגם לתוך פח שקילה, ולתעד את המסה.
- המסה של המדגם משתנה בהתאם לתוכן החומר האורגני שלה. חומר אורגני יחסית חומר רזה (בוץ ימי) עשוי לדרוש מספר גרם, בעוד חומר אורגני עשיר (רקמת עלה) עשוי לדרוש הרבה פחות.
- מעבירים את כל החומר בפח השקילה לתא ASE מוכן.
- מניחים מסנן סיבי זכוכית נוסף על החלק העליון של התא, ולאחר מכן לחץ לאט ובעדינות כלפי מטה עד שהוא מגיע לחלק העליון של המדגם באמצעות בוכנה המסנן.
- הוסף אדמה הצורנית (או חול) לתא עד שהוא כמעט מלא. היזהר להסיר את כל הפסולת מחוטים גוף התא.
- כיפה החלק העליון של התא עם מכסה קצה אחר.
- חזור על שלבים 3.1 - 3.6 עבור כל דגימה.
4. הכנת בקבוקוני אוסף
- סמן כל תקנה במספר של תא מתאים(למשל 1 - 22 או ריק) וכובע עם מכסה ביקציית אוסף ASE.
5. חילוץ
- מקם כל תא לדוגמה בחריץ ממוספר על מגש ASE העליון.
- מקם את בינתון האוסף המתאים באותו חריץ מספר במגש ASE התחתון.
- צור את שיטת החילוץ באמצעות לוח המקשים ב- ASE. לחלץ ב 100 °C (70 °F) ו 1,200 פסאיי. לחלץ כל מדגם 3x עם אחיזה סטטית של 10 דקות לשטוף את גוף התא עם 50% של הנפח הכולל שלה בין החזקות סטטיות.
- ודא בקבוק ממס מכיל מספיק ממס כדי לחלץ את כל הדגימות.
- יש לשטוף את ASE 3x לפני תחילת הריצה על-ידי לחיצה על כפתור השטיפה בלוח הבקרה של ASE.
- לחץ על התחל.
מיצוי ממס מואץ הוא טכניקה מהירה, יעילה ובעלת תפוקה גבוהה המשמשת להפרדת סמנים ביולוגיים אורגניים ממספר רב של דגימות משקעים גיאולוגיות.
באופן מסורתי, שיטות החילוץ כגון sonication או Soxhlet משמשים, עם זאת, החיסרון עם פרוטוקולים אלה הוא שהם איטיים מדי לעבד מספיק חומר לשחזור פליאוקלימט מפורט. טכניקה חדשה יותר, מיצוי ממס מואץ, או שיטת ASE, פותחה עם יעילות ותפוקה גבוהה בראש.
שיטת ASE משתמשת בשילוב של טמפרטורות גבוהות ולחץ גבוה כדי לחלץ דגימות ויכולה לבצע דגימות מרובות בריצת הכנה אחת ומהירה יחסית.
סרטון זה הוא השלישי בסדרה המפרטת כיצד לחלץ סמנים ביולוגיים ממ משקעים. זה יכסה את ההליך ולספק תובנה על היתרונות של ASE על sonication או מיצוי Soxhlet.
בהפקת ממס מואצת, דגימות נטענות לתאי פלדה שנטענים לאחר מכן על קרוסלה. בקבוקוני איסוף עבור כל תא לדוגמה נטענים גם על קרוסלה נפרדת. המכשיר טוען תא לדוגמה לתנור פנימי. ממס נשאב מבקבוק ממס דרך סדרה של שסתומים עד ללחץ מספיק הוא הגיע.
לחץ זה מוחזק למשך פרק זמן המוכתב על ידי המדגם והניתוח. לאחר מכן, הממס הוא הסמיק מתא המדגם דרך קו פלדה לתוך בוחן האוסף המתאים. ניתן לחזור על התהליך מספר פעמים. ניתן להתאים אישית את הטמפרטורה, הלחץ ומשך הזמן עבור המדגם.
הטמפרטורה הגבוהה המשמשת מגבירה את הקינטיקה של החילוץ בעוד הלחץ הגבוה שומר על הממס מפני תנודתיות. מקטורן האוסף מכיל כעת תמצית שומנים מוחלטת, ומה שנשאר בתא המדגם נקרא שאריות. הוא כולל חומר לא אורגני, כמו גם חומר אורגני שאינו ניתן לחילוץ ממס, הנקרא קרוגן.
עכשיו שאנחנו מכירים את העקרונות מאחורי מיצוי ממס מואץ, בואו נסתכל על איך זה מתבצע במעבדה.
לאחר איסוף דוגמאות של עניין; יבש בהקפאה, הומוגני, וטיהור כפי שהודגם בסרטון אחר בסדרה זו.
לאחר שכל הדגימות הוכנו, להרכיב תא עבור כל אחד להיות חילוץ, ואחד נוסף עבור ריק. כדי לעשות זאת, בורג מכסה קצה על גוף התא. בעזרת פינצטה שטופה בממס, מניחים מסנן סיבי זכוכית בעירה על גבי כל אחד מהם. לחץ לאט ובעדינות על המסנן כלפי מטה עם הבוכנה.
סמן את גופי התא לפי מספר עבור כל דגימה, וסמן את הריק בנפרד. מניחים פח שקילה בעירה על סולם מעבדה ואר. לשטוף מרית עם ממס, ולאחר מכן להשתמש בו כדי להעביר 5 עד 10 גרם של מדגם לפח שקילה, ולתעד את המסה.
מעבירים את כל החומר בפח השקילה לתא המתאים לו. מניחים מסנן סיבי זכוכית נוסף למעלה, ולחם בעדינות עד שהוא מגיע לחלק העליון של המדגם.
הוסף מפזר, כגון אדמה או חול הצורנית, עד שהוא כמעט מלא, נזהר להימנע מלהכניס פסולת לחוטים של גוף התא. כיפה החלק העליון של התא עם מכסה קצה אחר. חזור על שלבים אלה עבור כל דוגמה והריק.
סמן כל בון אוסף במספר של תא לדוגמה מתאים או ריק, וכיפה עם מכסה בריון. מקם כל תא בחריץ ממוספר על מגש ASE העליון. הגדר את הפרמטרים עבור שיטת החילוץ באמצעות לוח המקשים ב- ASE כדי לחלץ ב 100 °C (70 °F) ו- 1,200 פסאיי. לחלץ כל מדגם 3 פעמים עם אחיזה סטטית של 10 דקות לשטוף את גוף התא עם 50% של הנפח הכולל שלה בין החזקות סטטיות.
לאחר מכן, ודא כי בקבוק ממס מכיל מספיק כדי לחלץ את כל הדגימות. יש לשטוף את קווי המכשירים 3 פעמים לפני תחילת הריצה. לבסוף, לחץ על התחל.
הסר את המשחקון מן ASE. עכשיו שהסמנים הביולוגיים חולצו, הם חייבים להיות מטוהרים לפני הניתוח.
מיצוי ממס מואץ היא טכניקה רב-תכליתית, אשר ניתן להשתמש בה עבור מגוון רחב של יישומים, שחלקם נחקרים כאן.
מיצוי ממס מואץ יכול לשמש גם על סוגים אחרים של מדגם, כולל מזון. ניתוח שאריות לבדיקת זיהום חומרי הדברה מתבצע לעתים קרובות במתקנים רגולטוריים ותעשייתיים כדי לברר את הבטיחות והאיכות של מוצרי מזון כמו פירות או ירקות. ASE יכול לשמש כדי לחלץ חומרי הדברה organochlorine מדגימות מזון, ולקבוע את הסוגים או רמות של שאריות נוכח התוצרת. לאחר מכן ניתן להשתמש במידע זה כדי לקבוע אם התוצרת מתאימה לצריכה אנושית או מן החי. לדוגמה, dieldrin צריך להימצא בתוך 0 עד 0.1 חלקים למיליון על מזון, בהתאם למוצר.
ניתן לחלץ רכיבים תזונתיים מזון גם באמצעות ASE. לדוגמה, מוצרים כמו שוקולד, אשר עשוי להיות תוכן שומן כבידתי גבוה, ניתן לחלץ. באמצעות ASE עם אתר נפט כממס, שומן ניתן להפריד מדגימות שוקולד נתון לניתוח כמותי כדי לקבוע תוכן שומן אחוז מדויק לכל כמות ידועה של שוקולד. באמצעות מידע זה, גופים רגולטוריים יכולים לאמת טענות שנעשו על ידי יצרני שוקולד, או יצרנים יכולים להשיג מידע כדי ליצור תוויות מזון מדויקות.
הרגע צפית בהקדמה של JoVE להפקת סמנים ביולוגיים שומנים באמצעות מיצוי ממס מואץ, או ASE. שיטות לעיבוד וניתוח נוספים ניתן למצוא בסרטונים הבאים.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
בסוף החילוץ, יש תמצית שומנים מלאה (TLE) עבור כל מדגם. כל מקטורן מכיל כעת את החומר האורגני שניתן לחלץ ממ משקעים, אדמה או רקמת צמח. TLEs אלה ניתן לנתח, ואת המרכיבים הכימיים שלהם מזוהים וכימות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
TLEs של הדגימות שחולצו מכילים ספקטרום רחב של תרכובות אורגניות שונות, כולל GDGTs לשמש כדי לשחזר טמפרטורות עתיקות. גליצרי גליצרול-דיאלקיל הם חבילה גדולה של סמנים ביולוגיים המראים רגישות לטמפרטורות הצמיחה. ישנן שתי קבוצות של GDGTs, מסועף איזופרנואידים, אשר שונים באופי של דפוסי ההסתעפות על קבוצות אלקל הליבה (איור3). באוקיינוס, קבוצה קוסמופוליטית של ארכאה, הנקראת תאומרצ'אוטה, מייצרת GDGTs איזופרנואידלי4. GDGTs מסועף מיוצרים על קרקע בקרקעות5, אגמים, ובמכלי אגם6 על ידי חיידקים שעדיין לא זוהו, ככל הנראה Acidobacteria7. הן ארכיאה והן חיידקים מתאימים את מספר ענפי המתיל ומבני הטבעת בקבוצת האלקל הליבה בהתאם לטמפרטורת הצמיחה, ומכיוון ש- GDGTs יציבים משקעים במשך מיליוני שנים, רשומות ארוכות ברזולוציה גבוהה של שינוי האקלים נוצרות באמצעותם.
פרוקסי טמפרטורת המים פליאו TEX86 מבוסס על היחס של GDGTs איזופרנואידים מסוימים, כל אחד מכיל 86 אטומי פחמן בקבוצת האלקליבה העיקרית שלו (איור 3):
TEX86 = (GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4') /
(GDGT-1 + GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4')
טמפרטורת המים פליאו הוא לאחר מכן להסיק באמצעות כיול, כגון המשוואה המקורית:
TEX86 = 0.015T + 0.28 (R2 = 0.92)
הוצע על ידי שוטן ואח'. 1, שבו T הוא פליאוטמפרטורה. מספר כיולים אזוריים ומקומיים אחרים פותחו כדי לחדד עוד יותר את הפרוקסי לשימוש באגמים גדולים או באזורים הטרופיים, למשל.
איור 3. מבנים כימיים של איזופרנואידים וGDGTs מסועפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Schouten, S. et al. Distributional variations in marine crenarchaeotal membrane lipids: a new tool for reconstructing ancient sea water temperatures?, Earth and Planetary Science Letters, 204(1-2), 265-274 (2002).
- Weijers, J. W. H. et al. Environmental controls on bacterial tetraether membrane lipid distribution in soils, Geochimica et Cosmochimica Acta, 71(3), 703-713 (2007).
- Castaneda, I. S. et al. Millennial-scale sea surface temperature changes in the eastern Mediterranean (Nile River Delta region) over the last 27,000 years, Paleoceanography, 25, 13 (2010).
- Damste, J. S. S. et al. Crenarchaeol: the characteristic core glycerol dibiphytanyl glycerol tetraether membrane lipid of cosmopolitan pelagic crenarchaeota, J Lipid Res, 43(10), 1641-1651 (2002).
- Hopmans, E. C. et al. A novel proxy for terrestrial organic matter in sediments based on branched and isoprenoid tetraether lipids, Earth and Planetary Science Letters, 224(1-2), 107-116 (2004).
- Tierney, J. E., Russell J. M. Distributions of branched GDGTs in a tropical lake system: Implications for lacustrine application of the MBT/CBT paleoproxy, Organic Geochemistry, 40(9), 1032-1036 (2009).
- Damste, J. S. S. et al. 13,16-Dimethyl Octacosanedioic Acid (iso-Diabolic Acid), a Common Membrane-Spanning Lipid of Acidobacteria Subdivisions 1 and 3, Appl Environ Microb, 77(12), 4147-4154 (2011).
