Overview
Fonte: Laboratório de Jeff Salacup - Universidade de Massachusetts Amherst
A distribuição de um grupo de biomarcadores orgânicos chamados glicerol-dialkyl-tetraethers (GDGTs), produzidos por um conjunto de arqueias e bactérias, foram encontrados em sedimentos modernos para mudar de forma previsível em resposta à temperatura do ar ou da água1,2. Portanto, a distribuição desses biomarcadores em uma sequência de sedimentos da idade conhecida pode ser usada para reconstruir a evolução da temperatura do ar e/ou da água em escalas de tempo decadal para milenar(Figura 1). A produção de longos registros de alta resolução de climas passados, chamados de paleoclimatologia, depende da rápida análise de centenas, possivelmente milhares de amostras. Técnicas de extração mais antigas, como sônica ou Soxhlet, são muito lentas. No entanto, a mais nova técnica de Extração de Solventes Acelerados foi projetada com eficiência em mente.
Figura 1. Um exemplo de um registro paleoclima mostrando mudanças na temperatura da superfície do mar (SST) no Mar Mediterrâneo oriental durante os últimos ~27.000 anos3. Este registro compreende ~115 amostras e é baseado no proxy TEX86 SST baseado em GDGT isootero.
Principles
A extração acelerada de solventes é um método de extração (Thermo Scientific Dionex) que utiliza altas temperaturas (~100 °C) e pressões (~1.200 psi) para aumentar a cinética do processo de extração. O extrator, chamado de Extrator de Solvente Acelerado, ou ASE(Figura 2),pode conter até 24 amostras individuais. Uma vez que o ASE esteja carregado e definido para ser executado, ele é completamente automatizado. O ASE permite o controle eletrônico de todo o processo de extração: temperatura de extração, pressão, volume de solvente, mistura de solvente, duração, lavagem e repetição são todos ajustáveis de amostra para amostra. A maioria dos laboratórios de geoquímica orgânica agora usa o ASE como método padrão de extração de solventes.
Figura 2. Um Extrator de Solvente Acelerado (ASE).
A extração acelerada de solventes é uma técnica rápida, eficiente e de alto rendimento usada para separar biomarcadores orgânicos de um grande número de amostras de sedimentos geológicos.
Tradicionalmente, métodos de extração como sonicação ou Soxhlet são usados, no entanto, a desvantagem com esses protocolos é que eles são muito lentos para processar material suficiente para reconstrução detalhada do paleoclima. Uma técnica mais recente, o método Accelerated Solvent Extraction, ou ASE, foi desenvolvido com eficiência e alto rendimento em mente.
O método ASE usa uma combinação de altas temperaturas e alta pressão para extrair amostras e pode realizar várias amostras em uma única e relativamente rápida preparação.
Este vídeo é o terceiro de uma série detalhando como extrair biomarcadores de sedimentos. Ele cobrirá o procedimento e fornecerá informações sobre os méritos da ASE sobre a sônica ou extração de Soxhlet.
Na extração acelerada de solventes, as amostras são carregadas em células de aço que são então carregadas em um carrossel. Os frascos de coleta para cada célula amostral também são carregados em um carrossel separado. O instrumento carrega uma célula de amostra em um forno interno. O solvente é bombeado de uma garrafa de solvente através de uma série de válvulas até que uma pressão suficiente seja alcançada.
Esta pressão é mantida por um período de tempo ditada pela amostra e analito. Em seguida, o solvente é lavado da célula amostral através de uma linha de aço no frasco de coleta correspondente. O processo pode ser repetido várias vezes. A temperatura, pressão e duração podem ser personalizadas para a amostra.
A alta temperatura utilizada aumenta a cinética da extração, enquanto a alta pressão impede que o solvente volatize. O frasco de coleta agora contém um extrato lipídedo total, e o que resta na célula amostra é chamado de resíduo. Compreende material não orgânico, bem como material orgânico que não é extraível de solvente, chamado kerogen.
Agora que estamos familiarizados com os princípios por trás da extração acelerada de solventes, vamos dar uma olhada em como isso é realizado em laboratório.
Após a coleta de amostras de interesse; congelar, homogeneizar e descontaminar como demonstrado em outro vídeo desta série.
Uma vez que todas as amostras tenham sido preparadas, monte uma célula para cada uma ser extraída, e uma extra para um branco. Para fazer isso, dane-se uma tampa final no corpo da célula. Usando pinças enxaguadas com solvente, coloque um filtro de fibra de vidro queimado em cima de cada uma delas. Pressione lentamente e suavemente o filtro para baixo com o êmbolo.
Rotule os corpos celulares por número para cada amostra e rotule o branco separadamente. Coloque uma lata de pesagem queimada em uma escala de laboratório e tare. Enxágüe uma espátula com solvente, em seguida, use-a para transferir de 5 a 10 g de amostra para a lata de pesagem, e grave a massa.
Transfira todo o material na lata de pesagem para sua célula correspondente. Coloque outro filtro de fibra de vidro por cima e tampe suavemente até chegar ao topo da amostra.
Adicione um dispersante, como terra diatomácea ou areia, até que esteja quase cheio, tomando cuidado para evitar colocar detritos nos fios do corpo celular. Cubra a parte superior da célula com outra tampa final. Repita estes passos para cada amostra e o em branco.
Rotule cada frasco de coleta com o número de uma célula amostral correspondente ou em branco, e tampa com uma tampa de frasco. Coloque cada célula em uma ranhura numerada na bandeja ASE superior. Defina os parâmetros para o método de extração usando o teclado no ASE para extrair a 100 °C e 1.200 psi. Extrair cada amostra 3 vezes com um porão estático de 10 minutos e lave o corpo celular com 50% de seu volume total entre as porões estáticos.
Em seguida, certifique-se de que a garrafa de solvente contém o suficiente para extrair todas as amostras. Enxágüe as linhas de instrumentos 3 vezes antes de iniciar a corrida. Finalmente, comece a imprensa.
Remova o frasco do ASE. Agora que os biomarcadores foram extraídos, eles devem ser purificados antes da análise.
A Extração acelerada de solventes é uma técnica versátil, que pode ser utilizada para uma variedade de aplicações, algumas das quais são exploradas aqui.
A extração acelerada de solventes também pode ser usada em outros tipos de amostra, incluindo alimentos. A análise de resíduos para testar a contaminação por agrotóxicos é realizada com frequência em instalações regulatórias e industriais para verificar a segurança e a qualidade de produtos alimentícios, como frutas ou hortaliças. O ASE pode ser usado para extrair pesticidas organocloritos de amostras de alimentos, e determinar os tipos ou níveis de resíduo presentes nos produtos. Essas informações podem então ser usadas para estabelecer se o produto é adequado para o consumo humano ou animal. Por exemplo, o dieldrin deve ser encontrado dentro de 0 a 0,1 partes por milhão em alimentos, dependendo do produto.
Componentes nutricionais alimentares também podem ser extraídos usando ASE. Por exemplo, produtos como o chocolate, que pode ter alto teor de gordura gravimétrica, podem ser extraídos. Utilizando o ASE com éter de petróleo como solvente, a gordura pode ser separada das amostras de chocolate e submetida à análise quantitativa para determinar um teor percentual preciso de gordura por quantidade conhecida de chocolate. Usando essas informações, os órgãos reguladores podem verificar reivindicações feitas por fabricantes de chocolate, ou os fabricantes podem obter informações para criar rótulos de alimentos precisos.
Você acabou de assistir a introdução da JoVE à extração de biomarcadores lipídicos usando extração acelerada de solventes, ou ASE. Métodos para posterior processamento e análise podem ser encontrados em vídeos subsequentes.
Obrigado por assistir!
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Procedure
1. Coleta dos Materiais Necessários
- Extrair amostras. As amostras (neste caso, sedimentos) são congeladas, congeladas, esmagadas e homogeneizadas antes da extração, e extraídas em grupos para maximizar a eficiência.
- Dependendo do tamanho da amostra, utilize frascos de coleta com volumes de 40 ou 60 mL. Para este experimento, são utilizados frascos de vidro borossilicato (40 mL) e tampas seguras de solventes. Frascos de combustão, pipetas de vidro borossilicato e latas de pesagem a 550 °C por 6h antes de garantir a remoção de possíveis contaminantes orgânicos.
- Diclorometano (DCM) e metanol são comuns na maioria dos laboratórios de geoquímica orgânica. Use-os individualmente , (primeiro metanol, seguido de DCM) para enxaguar ferramentas de laboratório e vidros antes de usar. Uma mistura de diclorometano ao metanol (MeOH; 9:1) é usada em muitos laboratórios para extrair biomarcadores eficientemente com uma ampla gama de polaridades. Os solventes devem estar livres de contaminantes orgânicos.
- Obtenha um Extrator de Solvente Acelerado para usar para este experimento.
2. Preparação de células amostrais
- Monte uma célula amostral para cada amostra a ser extraída, mais uma em branco.
- Para cada célula, enrosque uma tampa final em uma extremidade do corpo celular.
- Coloque um filtro de fibra de vidro queimado em cima de cada célula usando pinças enxaguadas com solventes. Em seguida, pressione suavemente e lentamente o filtro para dentro da célula usando o êmbolo do filtro.
- Rotule os corpos celulares por número (por exemplo, 1 - 22) para cada amostra e escreva "em branco" na célula em branco.
- Encha o branco com terra diatomácea (ou areia) e tampa com uma segunda tampa final. Aperte à mão.
3. Preparação de Amostras
- Coloque uma lata de pesagem queimada na escala do laboratório e depois na piche.
- Enxágüe a espátula de laboratório com solvente, em seguida, use-a para transferir uma massa apropriada de amostra para a lata de pesagem, e regissão a massa.
- A massa da amostra varia dependendo do seu teor de matéria orgânica. Material magro de matéria relativamente orgânica (lama marinha) pode exigir vários gramas, enquanto material rico em matéria orgânica (tecido de folha) pode exigir muito menos.
- Transfira todo o material na lata de pesagem para uma célula ASE preparada.
- Coloque outro filtro de fibra de vidro na parte superior da célula, depois pressione lentamente e suavemente até atingir a parte superior da amostra usando o êmbolo do filtro.
- Adicione terra diatomácea (ou areia) à célula até que esteja quase cheia. Tenha cuidado para remover quaisquer detritos dos fios do corpo celular.
- Cubra a parte superior da célula com outra tampa final.
- Repita as etapas 3.1 - 3.6 para cada amostra.
4. Preparação de frascos de coleta
- Rotule cada frasco com o número de uma célula correspondente (por exemplo, 1 - 22 ou em branco) e tampa com tampa de frasco de coleta ASE.
5. Extração
- Coloque cada célula de amostra em um slot numerado na bandeja ase superior.
- Coloque o frasco de coleta correspondente no mesmo slot numédlico na bandeja ase inferior.
- Crie o método de extração usando o teclado no ASE. Extrair a 100 °C e 1.200 psi. Extrair cada amostra 3x com um porão estático de 10 min e lavar o corpo celular com 50% de seu volume total entre as porões estáticos.
- Certifique-se de que a garrafa de solvente contém solvente suficiente para extrair todas as amostras.
- Enxágüe o ASE 3x antes de iniciar a corrida pressionando o botão "enxaguar" na almofada de controle ASE.
- Comece a pressionar.
A extração acelerada de solventes é uma técnica rápida, eficiente e de alto rendimento usada para separar biomarcadores orgânicos de um grande número de amostras de sedimentos geológicos.
Tradicionalmente, métodos de extração como sonicação ou Soxhlet são usados, no entanto, a desvantagem com esses protocolos é que eles são muito lentos para processar material suficiente para reconstrução detalhada do paleoclima. Uma técnica mais recente, o método Accelerated Solvent Extraction, ou ASE, foi desenvolvido com eficiência e alto rendimento em mente.
O método ASE usa uma combinação de altas temperaturas e alta pressão para extrair amostras e pode realizar várias amostras em uma única e relativamente rápida preparação.
Este vídeo é o terceiro de uma série detalhando como extrair biomarcadores de sedimentos. Ele cobrirá o procedimento e fornecerá informações sobre os méritos da ASE sobre a sônica ou extração de Soxhlet.
Na extração acelerada de solventes, as amostras são carregadas em células de aço que são então carregadas em um carrossel. Os frascos de coleta para cada célula amostral também são carregados em um carrossel separado. O instrumento carrega uma célula de amostra em um forno interno. O solvente é bombeado de uma garrafa de solvente através de uma série de válvulas até que uma pressão suficiente seja alcançada.
Esta pressão é mantida por um período de tempo ditada pela amostra e analito. Em seguida, o solvente é lavado da célula amostral através de uma linha de aço no frasco de coleta correspondente. O processo pode ser repetido várias vezes. A temperatura, pressão e duração podem ser personalizadas para a amostra.
A alta temperatura utilizada aumenta a cinética da extração, enquanto a alta pressão impede que o solvente volatize. O frasco de coleta agora contém um extrato lipídedo total, e o que resta na célula amostra é chamado de resíduo. Compreende material não orgânico, bem como material orgânico que não é extraível de solvente, chamado kerogen.
Agora que estamos familiarizados com os princípios por trás da extração acelerada de solventes, vamos dar uma olhada em como isso é realizado em laboratório.
Após a coleta de amostras de interesse; congelar, homogeneizar e descontaminar como demonstrado em outro vídeo desta série.
Uma vez que todas as amostras tenham sido preparadas, monte uma célula para cada uma ser extraída, e uma extra para um branco. Para fazer isso, dane-se uma tampa final no corpo da célula. Usando pinças enxaguadas com solvente, coloque um filtro de fibra de vidro queimado em cima de cada uma delas. Pressione lentamente e suavemente o filtro para baixo com o êmbolo.
Rotule os corpos celulares por número para cada amostra e rotule o branco separadamente. Coloque uma lata de pesagem queimada em uma escala de laboratório e tare. Enxágüe uma espátula com solvente, em seguida, use-a para transferir de 5 a 10 g de amostra para a lata de pesagem, e grave a massa.
Transfira todo o material na lata de pesagem para sua célula correspondente. Coloque outro filtro de fibra de vidro por cima e tampe suavemente até chegar ao topo da amostra.
Adicione um dispersante, como terra diatomácea ou areia, até que esteja quase cheio, tomando cuidado para evitar colocar detritos nos fios do corpo celular. Cubra a parte superior da célula com outra tampa final. Repita estes passos para cada amostra e o em branco.
Rotule cada frasco de coleta com o número de uma célula amostral correspondente ou em branco, e tampa com uma tampa de frasco. Coloque cada célula em uma ranhura numerada na bandeja ASE superior. Defina os parâmetros para o método de extração usando o teclado no ASE para extrair a 100 °C e 1.200 psi. Extrair cada amostra 3 vezes com um porão estático de 10 minutos e lave o corpo celular com 50% de seu volume total entre as porões estáticos.
Em seguida, certifique-se de que a garrafa de solvente contém o suficiente para extrair todas as amostras. Enxágüe as linhas de instrumentos 3 vezes antes de iniciar a corrida. Finalmente, comece a imprensa.
Remova o frasco do ASE. Agora que os biomarcadores foram extraídos, eles devem ser purificados antes da análise.
A Extração acelerada de solventes é uma técnica versátil, que pode ser utilizada para uma variedade de aplicações, algumas das quais são exploradas aqui.
A extração acelerada de solventes também pode ser usada em outros tipos de amostra, incluindo alimentos. A análise de resíduos para testar a contaminação por agrotóxicos é realizada com frequência em instalações regulatórias e industriais para verificar a segurança e a qualidade de produtos alimentícios, como frutas ou hortaliças. O ASE pode ser usado para extrair pesticidas organocloritos de amostras de alimentos, e determinar os tipos ou níveis de resíduo presentes nos produtos. Essas informações podem então ser usadas para estabelecer se o produto é adequado para o consumo humano ou animal. Por exemplo, o dieldrin deve ser encontrado dentro de 0 a 0,1 partes por milhão em alimentos, dependendo do produto.
Componentes nutricionais alimentares também podem ser extraídos usando ASE. Por exemplo, produtos como o chocolate, que pode ter alto teor de gordura gravimétrica, podem ser extraídos. Utilizando o ASE com éter de petróleo como solvente, a gordura pode ser separada das amostras de chocolate e submetida à análise quantitativa para determinar um teor percentual preciso de gordura por quantidade conhecida de chocolate. Usando essas informações, os órgãos reguladores podem verificar reivindicações feitas por fabricantes de chocolate, ou os fabricantes podem obter informações para criar rótulos de alimentos precisos.
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Results
No final da extração, há um extrato lipídudo total (TLE) para cada amostra. Cada frasco agora contém a matéria orgânica extraível de um sedimento, solo ou tecido vegetal. Estes TLEs podem ser analisados, e seus componentes químicos identificados e quantificados.
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Applications and Summary
Os TLEs das amostras extraídas contêm um amplo espectro de diferentes compostos orgânicos, incluindo os GDGTs a serem usados para reconstruir temperaturas antigas. Gliceol-dialkyl gliceol-tetraethers são uma grande suíte de biomarcadores que mostram sensibilidade às temperaturas de crescimento. Existem dois grupos de GDGTs, ramificados e isooeróides, que diferem no caráter dos padrões ramificados nos grupos alquila núcleo (Figura3). No oceano, um grupo cosmopolita de arqueia, chamado Thaumarchaeota, produz GDGTs isorenoidais4. GDGTs ramificados são produzidos em terra em solos5, lagos, e em sedimentos de lago6 por bactérias ainda não identificadas, provavelmente Acidobacteria7. Tanto a arqueia quanto as bactérias ajustam o número de ramos de metila e estruturas de anéis no grupo alquila núcleo de acordo com a temperatura de crescimento, e como os GDGTs são estáveis em sedimentos por milhões de anos, registros de alta resolução de mudanças climáticas são gerados usando-os.
O proxy da temperatura da água paleo TEX86 é baseado na razão de certos GDGTs isoorenoidais, cada um contendo 86 átomos de carbono em seu grupo de alquila núcleo (Figura 3):
TEX86 = (GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4') /
(GDGT-1 + GDGT-2 + GDGT-3 + GDGT-4')
A temperatura da água paleo é então inferida usando uma calibração, como a equação original:
TEX86 = 0,015T + 0,28 (R2 = 0,92)
Proposto por Schouten et al. 1, onde T é paleotemperatura. Várias outras calibrações regionais e locais foram desenvolvidas para refinar ainda mais o proxy para uso em grandes lagos ou nos trópicos, por exemplo.
Figura 3. Estruturas químicas de GDGTs isoooteros e ramificados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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References
- Schouten, S. et al. Distributional variations in marine crenarchaeotal membrane lipids: a new tool for reconstructing ancient sea water temperatures?, Earth and Planetary Science Letters, 204(1-2), 265-274 (2002).
- Weijers, J. W. H. et al. Environmental controls on bacterial tetraether membrane lipid distribution in soils, Geochimica et Cosmochimica Acta, 71(3), 703-713 (2007).
- Castaneda, I. S. et al. Millennial-scale sea surface temperature changes in the eastern Mediterranean (Nile River Delta region) over the last 27,000 years, Paleoceanography, 25, 13 (2010).
- Damste, J. S. S. et al. Crenarchaeol: the characteristic core glycerol dibiphytanyl glycerol tetraether membrane lipid of cosmopolitan pelagic crenarchaeota, J Lipid Res, 43(10), 1641-1651 (2002).
- Hopmans, E. C. et al. A novel proxy for terrestrial organic matter in sediments based on branched and isoprenoid tetraether lipids, Earth and Planetary Science Letters, 224(1-2), 107-116 (2004).
- Tierney, J. E., Russell J. M. Distributions of branched GDGTs in a tropical lake system: Implications for lacustrine application of the MBT/CBT paleoproxy, Organic Geochemistry, 40(9), 1032-1036 (2009).
- Damste, J. S. S. et al. 13,16-Dimethyl Octacosanedioic Acid (iso-Diabolic Acid), a Common Membrane-Spanning Lipid of Acidobacteria Subdivisions 1 and 3, Appl Environ Microb, 77(12), 4147-4154 (2011).
