Overview
Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Bradley Schmitz
La reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) coinvolge lo stesso processo della PCR convenzionale : temperatura ciclica per amplificare gli acidi nucleici. Tuttavia, mentre la PCR convenzionale amplifica solo gli acidi desossiribonucleici (DNA), la RT-PCR consente l'amplificazione degli acidi ribonucleici (RNA) attraverso la formazione di DNA complementare (cDNA). Ciò consente di analizzare gli organismi a base di RNA trovati nell'ambiente utilizzando metodi e tecnologie progettati per il DNA.
Molti virus presenti nell'ambiente usano l'RNA come materiale genetico. Diversi patogeni virali a base di RNA, come il Norovirus,e organismi indicatori, come il virus della chiazze lievi del pepe (PMMoV), non hanno metodi di rilevamento basati sulla coltura per la quantificazione. Al fine di rilevare la presenza di questi virus a RNA in campioni ambientali provenienti da suolo, acqua, agricoltura, ecc.,I saggi molecolari si basano sulla RT-PCR per convertire l'RNA in DNA. Senza RT-PCR, i microbiologi non sarebbero in grado di saggiare e ricercare numerosi virus a base di RNA che presentano rischi per la salute umana e ambientale.
La RT-PCR può anche essere impiegata come strumento per misurare l'attività microbica nell'ambiente. L'RNA messaggero (mRNA) è il modello a singolo filamento per la traduzione delle proteine e la misurazione dei livelli di diversi mRNA indica quali geni da cui i microbi vengono espressi nell'ambiente. L'analisi dell'espressione genica fornisce indizi su quali percorsi biologici vengono utilizzati dagli organismi per sopravvivere in diverse condizioni ambientali. In alcuni casi, l'espressione genica può essere utilizzata per determinare quali organismi possono sopravvivere meglio in condizioni difficili e hanno capacità di biorisanamento del suolo o dell'acqua contaminati.
Principles
La PCR si basa sull'amplificazione di modelli di DNA, che ne limita l'uso nel rilevamento di RNA dagli organismi. Tuttavia, RT-PCR fornisce un mezzo per utilizzare l'RNA per produrre cDNA utilizzando enzimi specializzati, noti come trascrittasi inversa (RT). Questo cDNA può quindi essere utilizzato come modello di partenza per la successiva amplificazione con PCR convenzionale (Figura 1).
La trascrizione inversa può essere controllata per amplificare solo i prodotti desiderati o un'intera comunità di acidi nucleici trovati all'interno di un campione ambientale, a seconda dei primer utilizzati per la sintesi del cDNA. Questo è importante, poiché i campioni di suolo e acqua sono spesso saturi di vari acidi nucleici che non sono desiderati per analisi specifiche. I primer casuali, che possono legarsi a sequenze di RNA presenti in qualsiasi tipo di microbi, possono essere utilizzati in RT-PCR per rilevare la maggior parte dell'RNA, in modo che il campione possa essere analizzato per la presenza e l'abbondanza relativa di più organismi nell'ambiente. D'altra parte, i primer specifici della sequenza avviano la sintesi del cDNA per sequenze precise che si trovano solo in uno o pochi organismi. Ciò consente di testare un campione ambientale per uno scopo specifico, ad esempio determinare se il Norovirus,che può causare malattie gastrointestinali nell'uomo, è presente nell'acqua.
Figura 1. Processo passo-passo di analisi RT-PCR di campioni di RNA ambientale.
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Procedure
1. Raccolta del campione: campione di terreno
- Trova una posizione di esempio tramite GPS, coordinate o vista.
- Per il campionamento casuale, scegli punti casuali all'interno di un'area per ottenere un censimento generale degli habitat microbici. Il campionamento del transetto raccoglie da punti lungo una linea retta, ad esempio, adiacenti a un letto di torrente. I campioni della griglia vengono prelevati sistematicamente da punti a intervalli regolari e sono utili per mappare le comunità microbiche in un'area sconosciuta o variabile.
- Il campionamento all'interno di una profondità di 3-6 pollici (7,5-15 cm) fornisce l'accesso all'attività microbica più abbondante che è vicina, ma non all'interno, la rizosfera (la stretta regione del suolo direttamente interessata dalle radici delle piante e dai loro microrganismi associati).
- Per raccogliere il campione di terreno, spingere e ruotare una coclea a mano nel terreno alla profondità predeterminata.
- Sollevare la coclea. Il terreno si trova all'interno del gambo cavo della coclea.
- Raschiare il terreno sul fondo della coclea in un sacchetto di raccolta del terreno. Assicurati di non toccare o contaminare il terreno.
- Etichetta correttamente la borsa con posizione, nome, data e ora.
- In laboratorio, passare il terreno attraverso un setaccio di 2 mm per rimuovere ghiaia e roccia.
- Analizzare una parte del terreno per il contenuto di umidità del suolo. Per i dettagli di questo passaggio, fare riferimento al video di JoVE Science Education sull'umidità del suolo.
2. Raccolta del campione: campione d'acqua
- Trova la posizione di esempio tramite GPS, coordinate o vista.
- Raccogli l'acqua in una bottiglia di stoccaggio. Registrare il volume d'acqua raccolto; se i microbi nel campione sono analizzati quantitativamente, la concentrazione microbica può essere determinata in base al volume raccolto.
- Testare immediatamente l'acqua per eventuali parametri richiesti per l'esperimento (temperatura, pH, conducibilità, salinità, contenuto di azoto e fosforo, ecc.) utilizzando le apposite sonde elettroniche.
- Posizionare la bottiglia contenente il campione d'acqua in un dispositivo di raffreddamento con ghiaccio. Trasferire il dispositivo di raffreddamento in laboratorio.
3. Estrazione dell'RNA
- Per raccogliere e concentrare i microrganismi dal campione ambientale, fare riferimento al video Di educazione scientifica JoVE sull'estrazione di acidi nucleici della comunità.
- Estrarre l'RNA dai virus utilizzando un kit di estrazione commerciale secondo le istruzioni del produttore.
- In breve, prima mescolare i campioni con tampone di lisi integrato con etanolo, quindi aggiungere i campioni in colonne di spin.
- Centrifugare le colonne a circa 12.000 x g, scartare il flowthrough. Aggiungere il tampone di lavaggio alle colonne e centrifugare di nuovo.
- Aggiungere acqua priva di RNasi alle colonne e centrifugare per 30 s per eluire l'RNA in tubi sterili da microfuga a bassa adesione da 1,5 mL.
4. Trascrizione inversa - PCR
- Recuperare i seguenti reagenti dal congelatore a -20 °C: dNTP, buffer di trascrizione inversa concentrato(ad esempio,10x), primer (in questo esempio, primer casuali). Scongelarli sul ghiaccio o a temperatura ambiente all'interno di una cappa pulita e tenerli sul ghiaccio una volta scongelati. Recupera anche la trascrittasi inversa e l'inibitore della RNasi e tienili sul ghiaccio.
- Calcolare i volumi di reagenti necessari per realizzare un "master mix" che combini tutti i reagenti costanti tra ogni reazione (vedere tabella 1 per una reazione del campione). Preparare abbastanza master mix per ogni campione, così come un controllo positivo (utilizzando un modello di trascrizione noto) e un controllo negativo(ad esempio,senza trascrittasi inversa, con solo acqua come modello, ecc.) reazioni. Includi un ulteriore 10% in volume.
- Assemblare la miscela principale in tubi microfuga a bassa adesione da 1,5 ml. Ciò riduce al minimo il legame delle molecole di reagente alle pareti di plastica dei tubi.
- Quando i reagenti vengono scongelati, aggiungere volumi calcolati al tubo del microfuga. Vortice delicato e centrifuga ogni tubo prima dell'aggiunta. Assicurarsi di cambiare le punte delle pipette tra l'aggiunta di ciascun reagente per evitare la contaminazione.
- Dopo aver aggiunto tutti i reagenti, vortice e centrifuga la miscela principale per garantire una miscela omogenea. Rimettere i reagenti in deposito a -20 °C.
- Preparare ed etichettare strisce PCR a 8 tubi, designando una provetta per ogni campione o reazione di controllo.
- Aliquota di un volume uguale di miscela master in ciascun tubo. Quindi, aggiungere componenti specifici della reazione, come gli estratti di RNA.
- Posizionare saldamente il tappo della striscia sulla striscia PCR e centrifugare in una minicentrifuga con un adattatore per tubo strisciante per assicurarsi che tutto il liquido venga raccolto sul fondo di ciascun tubo (Figura 2).
- Posizionare saldamente la striscia PCR nel termociclatore. Premere verso il basso per assicurarsi che i tubi siano fissati.
- Impostare il termiciclo per eseguire il programma appropriato per l'RT utilizzato (vedere la Tabella 2 per un protocollo di esempio). Al termine del programma, i tubi conterranno prodotti cDNA, che potranno quindi essere sottoposti ad amplificazione PCR. Per i dettagli, fare riferimento ai video di JoVE Science Education sulla PCR e la PCR quantitativa. Conservare il cDNA a -20 °C fino all'uso.
Figura 2. Striscia a 8 tubi con cappuccio contenente miscela principale ed estratto.
| Reagente | Volume per 1 reazione (μL) |
| Buffer RT 10x | 2.0 |
| 25x dNTP | 0.8 |
| 10x Primer casuale | 2.0 |
| Multiscrivito | 1.0 |
| Inibitore della rnasi | 1.0 |
| Grado molecolare H2O | 3.2 |
| Volume totale | 10 |
Tabella 1. RT Master Mix Ingredienti.
| Fase 1 | Fase 2 | Fase 3 | Fase 4 |
| 25 °C , 10 min | 37 °C , 120 min | 85 °C , 5 min | 4 °C , ∞ |
Tabella 2. Programma termociclatore a reazione RT.
La reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa, o RT-PCR, consente il rilevamento di virus a RNA e l'espressione genica microbica nell'ambiente.
A differenza degli organismi cellulari, dagli esseri umani ai batteri, che usano il DNA come materiale genetico, alcuni virus hanno genomi fatti di RNA, tra cui molti virus patogeni come l'influenza, l'Ebola e l'HIV. Mentre alcuni virus possono essere rilevati osservando il fenotipo patogeno che si sviluppa quando viene utilizzato per infettare le cellule in coltura cellulare, la maggior parte non ha metodi di caratterizzazione basati sullacoltura. RT-PCR può essere utilizzato per rilevare la presenza di questi virus nell'ambiente con alta sensibilità.
Allo stesso tempo, gli organismi con genomi basati sul DNA "esprimono" le informazioni genetiche codificate nei loro genomi del DNA "trascrivendoli" in messenger o "m"RNA, che possono quindi essere "tradotti" in proteine per svolgere funzioni enzimatiche o strutturali nelle cellule. Poiché i microbi rispondono e si adattano ai cambiamenti nell'ambiente attivando o disattivando vari percorsi genetici, la RT-PCR può essere utilizzata per monitorare tali alterazioni nell'espressione genica per fungere da potenziali valutatori dell'ecosistema.
Questo video esaminerà i principi alla base della RT-PCR, delineerà una procedura generalizzata per eseguire questa tecnica e, infine, esaminerà alcuni dei modi in cui questo metodo viene applicato oggi nella microbiologia ambientale.
Ci sono due parti chiave di questa procedura: l'estrazione dell'RNA da campioni biologici, seguita dalla sua trascrizione inversa nel DNA.
L'isolamento dell'RNA comporta la lisi delle cellule nel campione mediante l'aggiunta di un detergente che scompone lipidi e proteine, seguito da interruzione meccanica. L'estrazione di RNA dai virus di solito richiede l'aggiunta di proteinasi, che sono enzimi che digeriscono le proteine, per abbattere i capsidi dei virus - i duri rivestimenti proteici che formano la particella virale. D'altra parte, quando si ottiene l'RNA da organismi cellulari, il lisato potrebbe dover essere trattato con enzimi che degradano il DNA, o DNAasi, per evitare che i risultati a valle siano confusi dalla presenza del DNA chimicamente simile.
L'RNA può quindi essere purificato dai lasati in uno dei due modi. In un metodo, noto come estrazione acida guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio, il lisato viene miscelato con una miscela organico-acquosa che viene quindi centrifugata per separare le fasi. Le proteine saranno suddivise nella fase organica, i detriti cellulari llisi nell'interfase torbidi e gli acidi nucleici nella fase acquosa. La fase acquosa superiore può quindi essere raccolta e l'RNA viene precipitato dall'aggiunta di alcol come l'isopropanolo, che diminuisce la solubilità dell'acido nucleico in acqua.
Nell'isolamento dell'RNA basato su colonna, il lisito viene miscelato con alcol e quindi fatto passare attraverso una colonna di filtrazione del gel con una resina caricata negativamente, come la silice. Il lisato viene preparato in modo che gli ioni caricati positivamente nel tampone formino "ponti di sale" che consentono alla spina dorsale fosfatica caricata negativamente degli acidi nucleici di legarsi alla resina. Tutti gli altri contaminanti vengono quindi lavati via. Gli acidi nucleici vengono "eluiti" dalla colonna usando un tampone a basso contenuto di sale o acqua. Poiché l'RNA a singolo filamento ha meno cariche negative rispetto al DNA a doppio filamento, può essere eluito preferenzialmente utilizzando tamponi di concentrazioni specifiche.
Una volta isolato, l'RNA viene trasformato nel DNA chimicamente più stabile. Gli scienziati hanno sfruttato un enzima codificato naturalmente da retrovirus come l'HIV. Questo enzima è noto come trascrittasi inversa, o "RT".
RT sintetizza DNA complementare o "c" da un breve tratto di nucleotidi noto come primer. Questo primer può avere sequenze diverse, a seconda dello scopo dell'esperimento. Ad esempio, il primer può essere progettato per avere una sequenza specifica, al fine di rilevare geni o organismi specifici. Una volta sintetizzato, questo cDNA "primo filamento" può essere amplificato dalla PCR regolare.
Ora che abbiamo una comprensione dei principi alla base della RT-PCR, diamo un'occhiata a un protocollo per eseguire questa tecnica su campioni di RNA raccolti dall'ambiente.
Per iniziare la procedura, trova una posizione di raccolta dei campioni utilizzando le coordinate GPS o la vista. Scegli punti casuali all'interno di un'area per ottenere un'indagine generale sugli habitat microbici.
Per raccogliere il campione solido, spingere e ruotare una coclea manuale nel terreno del terreno alla profondità predeterminata. Quando la coclea viene sollevata, il terreno può essere trovato all'interno del gambo cavo della coclea.
Questo terreno viene raschiato direttamente in un sacchetto di raccolta del terreno e il sacchetto è etichettato con la posizione, il nome, la data, l'ora di raccolta e qualsiasi altra informazione necessaria.
Trasferire il terreno al laboratorio e passare il terreno attraverso un setaccio di 2 mm per rimuovere ghiaia e roccia. Analizzare un campione del terreno per il contenuto di umidità, che può essere informativo sul livello di attività microbica nel terreno. Per fare ciò, fare riferimento al video di questa raccolta "Determinazione del contenuto di umidità del suolo".
Per la raccolta di campioni d'acqua, scegli un sito di interesse simile alla raccolta del suolo e raccogli l'acqua in una bottiglia di plastica sterile a pareti spesse. Prendi nota del volume d'acqua raccolto. Testare immediatamente l'acqua per parametri come temperatura, pH e salinità, che possono fornire informazioni importanti sui livelli microbici attesi nel campione. Quindi, posizionare la bottiglia nel dispositivo di raffreddamento e trasferirla in laboratorio.
I microrganismi come i virus vengono raccolti e concentrati dal campione ambientale.
L'RNA può essere estratto dai virus raccolti con il metodo della colonna di spin utilizzando kit di estrazione dell'RNA commerciali secondo le istruzioni del produttore. Il tampone di lisi, integrato con etanolo, viene prima miscelato con il campione. Posizionare il numero appropriato di colonne di rotazione in tubi di raccolta, quindi applicare i campioni sulla matrice di colonne. Centrifugare le colonne a circa 12.000 x g per 1-2 minuti per lasciare che gli acidi nucleici si leghino alla colonna ed eliminare il flusso del liquido.
Aggiungere il tampone di lavaggio alle colonne e centrifugare di nuovo. Posizionare le colonne in nuovi tubi sterili da 1,5 mL a microfughe a bassa adesione. Quindi, aggiungere acqua priva di RNasi, che sono enzimi che degradano l'RNA, alle colonne e centrifugare per 30 s per eluire l'RNA. L'RNA eluito può essere conservato a -80 °C fino all'uso.
Prima dell'esperimento, dovrebbero essere progettati primer appropriati per rilevare le sequenze di interesse, che possono servire come marcatori per la presenza di microrganismi specifici.
Esaurire i reagenti RT conservati a -20 °C e scongelare i reagenti congelati sul ghiaccio (o a temperatura ambiente). Questi includono nucleotidi, buffer di trascrizione inversa e primer. Una volta scongelati, tenere i reagenti sul ghiaccio; l'enzima trascrittasi inversa e l'inibitore della RNasi devono essere sempre tenuti sul ghiaccio.
Mentre i reagenti si scongelano, calcolare i volumi e le concentrazioni dei componenti della reazione. Una volta scongelati i reagenti, ruotare delicatamente e ruotare ogni tubo per assicurarsi che il contenuto sia ben miscelato.
Lavorando in una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni, assemblare i componenti in una miscela master da aggiungere a ciascun tubo PCR. Quando si assembla la miscela principale in un tubo Eppendorf, assicurarsi di cambiare le punte delle pipette tra ciascun reagente per evitare contaminazioni. Dopo che tutti i reagenti sono stati aggiunti al tubo di Eppendorf, ruotare delicatamente e ruotare verso il basso il tubo di miscelazione principale per garantire una miscela omogenea.
Etichettare un set di tubi PCR, assicurandosi di includere i controlli. Aliquotare un volume uguale della miscela master in ciascun tubo. Quindi, aggiungere componenti specifici della reazione, come gli estratti di RNA o l'acqua per il controllo negativo.
Una volta aggiunti tutti i componenti, posizionare i tubi in un termociclatore e impostare il programma di trascrizione inversa per l'esecuzione. Il cDNA può quindi essere sottoposto ad amplificazione PCR. Per una descrizione dettagliata di questo passaggio, fare riferimento al video di questa raccolta sulla PCR.
Quando la PCR è completa, parte del prodotto PCR può essere separato e visualizzato su un gel di agarose. Ad esempio, qui è stato utilizzato un primer gene-specifico per rilevare la presenza di un virus a RNA. Bande della dimensione prevista sono ottenute dalla reazione RT-PCR ma non dai controlli negativi, indicando la presenza di questo virus nel campione d'acqua da testare.
L'identificazione di microrganismi a base di RNA mediante RT-PCR consente l'analisi della salute ecologica, dei rischi ambientali e della conservazione della biodiversità.
L'uso di microrganismi per ripulire idrocarburi e solventi dal suolo e dall'acqua inquinati rappresenta un'alternativa di bonifica ecosostenibile. Comprendere l'espressione genica microbica nativa può evidenziare specifici percorsi microbici che abbattono i contaminanti in queste condizioni. RT-PCR è spesso utilizzato per amplificare l'mRNA da tali campioni ambientali.
Le misure di sanità pubblica spesso richiedono una rapida sorveglianza delle fonti virali di infezione nell'ambiente. L'influenza aviaria, ad esempio, è altamente infettiva e può diffondersi rapidamente al pollame, al bestiame e persino agli esseri umani. In questo particolare esempio, i ricercatori hanno cercato la minaccia della diffusione dell'influenza aviaria da parte degli uccelli selvatici.
Utilizzando una configurazione e un apparato RT-PCR portatile, hanno esaminato una serie di uccelli selvatici, anche in aree remote, per rilevare precocemente le infezioni e prevenire la trasmissione.
Infine, la RT-PCR può essere utilizzata per caratterizzare i "biopesticidi" in fase di sviluppo per colpire parassiti come il tiratore scelto dalle ali vitree, Homalodisca vitripennis, l'ospite di una malattia che danneggia gravemente la vite in Nord America. Un nuovo virus a RNA a singolo filamento è in fase di sviluppo come agente per infettare questo insetto. Utilizzando una combinazione di coltura cellulare homalodisca e conferma RT-PCR della carica virale, questi autori sono stati in grado di propagare un'alta concentrazione di virus per l'uso come agente di controllo biologico.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'analisi degli organismi ambientali basati sull'RNA da parte della RT-PCR. Ora dovresti capire la teoria alla base del protocollo, come applicare la tecnica alla tua ricerca e alcuni dei modi in cui viene utilizzata sul campo oggi. Grazie per l'attenzione!
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Results
Quando rt-PCR è completa, parte del prodotto PCR può essere separato e visualizzato su un gel di acarosio (Figura 3). In questo esempio, è stato utilizzato un primer gene-specifico per rilevare la presenza di un virus a RNA. Bande della dimensione prevista sono ottenute da due dei campioni e dalla reazione di controllo positiva, ma non dal controllo negativo, indicando la presenza di questo virus in due dei campioni di acqua sottoposti a test.
Figura 3. Elettroforesi su gel di prodotti RT-PCR. M: marcatore delle dimensioni del DNA; P: controllo positivo; N: controllo negativo. Le reazioni che utilizzavano l'RNA di quattro campioni d'acqua sono state eseguite nelle corsie 1, 2, 3 e 5.
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Applications and Summary
RT-PCR è necessario per creare cDNA da un modello di RNA. Ciò consente di analizzare i microrganismi a base di RNA utilizzando saggi molecolari sviluppati per il DNA. Una volta sintetizzato il cDNA, i saggi PCR possono determinare la presenza o l'assenza di microrganismi a base di RNA all'interno di un campione ambientale. Ciò consente ulteriori analisi a valle per determinare l'ecologia microbica, i rischi per la salute e i rischi ambientali.
RT-PCR può anche essere utilizzato per saggiare l'mRNA come mezzo per osservare quali geni vengono espressi in un ambiente. Ciò fornisce informazioni su quali proteine e percorsi i microbi fanno affidamento per sopravvivere in particolari condizioni ambientali. Le analisi di espressione genica possono identificare percorsi microbici che scompoggono i contaminanti ambientali come idrocarburi o solventi clorurati e i microbi con questi percorsi possono essere sfruttati per il biorisanamento.
La valutazione del rischio incorpora la RT-PCR al fine di analizzare i rischi per la salute umana e ambientale. La combinazione di RT con PCR quantitativa consente di enumerare i virus a RNA all'interno dei campioni, in modo che l'esposizione umana e ambientale possa essere calcolata ai fini della valutazione quantitativa del rischio microbico (QMRA).
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