Rilevamento dei microrganismi ambientali tramite PCR ed elettroforesi su gel

La premessa di base della PCR è quella di utilizzare cicli ripetuti di variazioni di temperatura sequenziali per ottenere l'amplificazione esponenziale del DNA. La sintesi del DNA viene effettuata da enzimi della DNA polimerasi che sono ottenuti da batteri che vivono in sorgenti termali, come Thermus aquaticus (Taq). Queste polimerasi sono stabili al calore, consentendo loro di resistere alle alte temperature utilizzate durante la PCR.

La sequenza bersaglio, nota come amplicon, viene amplificata dal modello di DNA utilizzando due brevi tratti di nucleotidi noti come "primer". A causa dell'elevata specificità del legame degli acidi nucleici complementari, i primer consentono l'amplificazione mirata di sequenze di interesse molto specifiche. Progettando primer che amplificheranno solo una sequenza unica (o una combinazione unica di sequenze) da un organismo di interesse, la PCR può essere utilizzata per rilevare in modo differenziale la presenza del DNA di quell'organismo tra tutti i materiali genetici presenti in un campione ambientale complesso.

Per eseguire la PCR, viene utilizzata una macchina nota come termociclatore per scorrere automaticamente le diverse temperature richieste per la reazione. Ogni ciclo è diviso in tre fasi. La prima, nota come "denaturazione", è solitamente impostata sopra i 92 °C e dura circa 30 s. La denaturazione viene utilizzata per rompere le molecole di DNA in singoli filamenti, per consentire alla reazione di amplificazione di procedere.

La seconda fase, la "ricottura", è impostata 2-3 °C al di sotto della temperatura di fusione inferiore dei due primer, solitamente tra i 50-65 °C, e dura anche circa 30 s. La temperatura di fusione è la temperatura alla quale il 50% del DNA a doppio filamento si è separato in singoli filamenti, e quindi la fase di ricottura consente ai primer di legarsi ai loro siti bersaglio nel modello di DNA.

La terza fase di un ciclo PCR è "allungamento" o "estensione", quando la DNA polimerasi si lega al duplex primer-template e catalizza la sintesi del prodotto. Impostato a 72 °C per la Taq polimerasi, la durata di questa fase dipende dalla lunghezza dell'amplicon, solitamente 30 s / 500 bp. Dopo ogni ciclo, il DNA amplificato viene nuovamente denaturato e funge da nuovo modello, portando ad un aumento esponenziale della quantità di prodotti PCR.

Una volta completata la reazione, i prodotti PCR possono essere risolti per dimensione su un "gel" solitamente costituito dal polimero agarose, un processo noto come elettroforesi. Un campo elettrico viene applicato attraverso il gel e le cariche negative nella spina dorsale delle molecole di DNA le fanno migrare verso l'estremità positiva del campo. In generale, le molecole di DNA lineare che sono più grandi impiegheranno più tempo a viaggiare attraverso la matrice del gel.

1. Raccolta dei campioni

1. Raccogli il terreno usando una coclea o una pala fino a una determinata profondità. Se si raccoglie il terreno dalla rizosfera (la stretta regione del suolo circostante e influenzata dalle radici delle piante e dai loro microbi associati), raccogliere solo direttamente dalle radici delle piante colpendo il terreno in un barile di raccolta.
2. Raccogliere il campione d'acqua immergendo una bottiglia di plastica sterile nell'acqua tenendo l'estremità del bastoncino di immersione.

2. Estrazione e preparazione degli acidi nucleici

1. Raccogli organismi e virus dal campione ed estrai DNA e RNA da loro. Per i dettagli, si prega di fare riferimento al video Di JoVE Science Education sull'estrazione dell'acido nucleico della comunità.
2. Conservare il DNA estratto in tubi di microfuga etichettati. Se il DNA deve essere conservato durante la notte o per periodi di tempo più lunghi, congelarlo a -20 °C e scongelare i tubi a temperatura ambiente quando sono pronti per l'uso.
3. Se il materiale genetico da dosare è l'RNA (che si tratti del genoma dei virus a RNA o dell'RNA trascritto degli organismi cellulari), eseguire la trascrizione inversa (RT) sul campione per creare DNA complementare (cDNA) prima di procedere alla PCR. Per i dettagli, fare riferimento al video JoVE Science Education su RT-PCR.

3. Reazione a catena della polimerasi

1. Posizionare l'enzima PCR(ad esempio, Taq polimerasi) sul ghiaccio e scongelare gli altri reagenti (tampone PCR, dNTP, primer) all'interno di una cappa "pulita" designata a temperatura ambiente. L'enzima viene immagazzinato a -20 °C ma non si congela mai. È sensibile alla temperatura e quindi deve essere mantenuto fresco e la sua esposizione alla temperatura ambiente ridotta al minimo
2. Calcolare il volume di ciascun reagente necessario per fare un "master mix" di tutti i reagenti che sono costanti tra tutte le reazioni (Tabella 1). Assicurati di tenere conto dei controlli positivi(ad esempio,un modello noto per contenere la regione di destinazione) e negativi(ad esempio,nessun modello) nei calcoli. Aggiungere un ulteriore 10% al volume finale per tenere conto dell'errore di pipettaggio. I volumi di primer dipendono dai saggi per organismi specifici; fare riferimento alla letteratura pubblicata per i valori appropriati.
3. Utilizzando un tubo di microfuga a bassa legatura, che riduce al minimo l'adesione delle molecole di reagente alle pareti di plastica, aggiungere i volumi calcolati di ciascun reagente per assemblare la miscela principale. Vortice delicato e centrifuga ogni reagente prima di aggiungerlo. Una volta preparata la miscela master, vortice per mescolare e raccogliere per centrifugazione
4. Preparare strisce PCR a 8 tubi. Designare una provetta per ciascun campione, compresi i controlli positivi e negativi
5. Erogare il volume appropriato di miscela PCR in ciascun tubo della striscia
6. Aggiungere il volume appropriato di modello di DNA dai campioni, così come 5 μL del modello positivo e 5 μL di acqua di grado molecolare come controllo negativo, nei rispettivi tubi PCR.
7. Posizionare saldamente il tappo sulla striscia a 8 tubi e centrifugare per alcuni secondi utilizzando una minicentrifuga
8. Posizionare la striscia a 8 tubi in un termociclatore
9. Impostare il programma PCR appropriato per l'esecuzione sul termociclatore. Un programma tipico è costituito dai seguenti
   1. Denaturazione a 94 °C per 3 min.
   2. 30-40 cicli di amplificazione: denaturazione a 94 °C per 30 s, ricottura a temperatura specifica del primer (di solito tra 50-60 °C) per 30 s ed estensione a 72 °C per 30 s / 500 bp.
   3. Estensione finale a 72 °C per 7-10 min.

4. Preparazione del gel di agarose

1. In base al volume di gel desiderato e alla concentrazione di gel (Tabella 2), pesare la quantità appropriata di acarosio in polvere in un matraccio Erlenmeyer da 125 mL.
2. Aggiungere il volume appropriato di tampone gel-running nel matraccio e ruotare il pallone a mano.
3. Riscaldare la miscela tampone-agarose in un forno a microonde ad alta potenza per 1 minuto.
4. Togliere il pallone dal microonde e ruotare a mano per assicurarsi che tutto l'agarose si sia sciolto. Se l'agarose non si è completamente dissolto, ripetere il microonde con incrementi di 30 secondi.
5. Dopo aver fissato saldamente il tappo sul matraccio, raffreddarlo a 50 °C ruotando sotto l'acqua corrente fredda.
6. Aggiungere 1 μL di bromuro di etidio (EtBr) alla miscela di agarose usando una micropippetta designata per EtBr. EtBr è un colorante che lega gli acidi nucleici a doppio filamento e l'arancione quando illuminato con luce UV. Si noti che EtBr è potenzialmente cancerogeno, quindi i dispositivi di protezione individuale (occhiali, camice da laboratorio, guanti resistenti all'EtBr) devono essere indossati.
7. Versare il gel fuso in un vassoio di fusione del gel per elettroforesi. Assicurati che nessuna bolla sia intrappolata all'interno dell'agarose. Mettere un pettine nel gel e bloccare saldamente. Attendere circa 20-30 minuti affinché il gel si solidifichi.
8. Una volta che il gel si è solidificato, rimuovere il pettine con attenzione senza causare strappi nel gel. Il pettine crea dei pozzi nel gel per il caricamento dei campioni.

5. Elettroforesi su gel

1. Posizionare il gel di agarose solidificato nella camera di elettroforesi.
2. Aggiungere il buffer di corsa appropriato nella camera fino a quando il gel non è appena immerso.
3. Su un pezzo di Parafilm, punti di pipetta di carico del colorante concentrato. Includere anche una scala DNA di una gamma adatta per le dimensioni previste dei prodotti PCR. In alternativa, utilizzare un nuovo set di provette per microfughe, una per ogni campione.
4. Una volta completata la PCR, recuperare quella striscia di 8 tubi dal termociclatore e centrifugare brevemente per raccogliere eventuali condensati. Aggiungere un volume appropriato di prodotto DNA al colorante di carico e pipettare su e giù per mescolare. Ad esempio, 2 μL di colorante di carico 10x vengono miscelati con 8 μL di campione per dare un volume finale di 10 μL, con il colorante a 1x.
5. Pipettare ogni miscela colorante-campione nei pozzette designati nel gel di agarose, facendo attenzione a non forare i pozzette.
6. Collegare gli elettrodi alla camera di elettroforesi. Il DNA è caricato negativamente, quindi "corre" verso l'elettrodo positivo. Pertanto, collegare l'elettrodo positivo al lato opposto della camera, dove sono stati caricati i pozzi. Impostare l'alimentatore su una tensione appropriata per il sistema tampone e le dimensioni della camera gel e impostarlo per funzionare. Piccole bolle dovrebbero essere visibili spostandosi verso l'alto i lati della camera se l'elettroforesi procede correttamente.
7. Una volta che il fronte del colorante è avanzato abbastanza in basso nel gel, spegnere l'alimentatore. Trasportare con attenzione il gel nel transilluminatore o nell'imager visivo e accendere la luce UV per visualizzare le bande di DNA sul gel.
8. Analizzare la dimensione della banda e le posizioni sul gel. Confrontare le posizioni delle bande dei campioni con il controllo positivo per determinare se il DNA dell'organismo di interesse è presente nel campione (Figura 1).

Tabella 1. Volumi di reagenti per miscela master PCR. *I volumi di primer variano a seconda del test dell'organismo. Regolare il volume di acqua di grado molecolare per rendere il volume finale 45 μL. I volumi di altri componenti non dovrebbero variare.

Tabella 2. Le dimensioni del frammento di DNA variano in modo ottimale da diverse percentuali di gel di agarose.

Nella Figura 1, la scala del DNA (corsia 1) fornisce un riferimento per le dimensioni e la concentrazione approssimativa per le bande dei prodotti PCR. Il controllo negativo (corsia 2) non contiene alcun materiale genetico, mentre il controllo positivo (corsia 3) è amplificato da modelli noti per contenere il DNA bersaglio per indicare le dimensioni e la posizione delle bande bersaglio. I campioni 4, 6, 8 e 9 mostrano un modello di banda simile a quello del controllo positivo, indicando quindi che questi campioni contengono il materiale genetico bersaglio. Si può dedurre che l'organismo è presente negli ambienti da cui sono stati ottenuti questi campioni.

Figura 1. Visualizzazione di bande su gel di acarosio dopo elettroforesi.

La PCR può essere impiegata per determinare rapidamente la presenza o l'assenza di agenti patogeni nell'ambiente. Ad esempio, i primer specifici per l'ameba mangia-cervello, Naegleria fowleri, amplificheranno il DNA e produrranno forti bande su un gel se l'organismo è presente in un campione. Se un singolo organismo non è l'interesse principale, ma piuttosto geni associati alla produzione di tossine da una varietà di organismi, la PCR può anche essere utilizzata per determinare la presenza o l'assenza di questi materiali genetici specifici.

La PCR può anche essere utilizzata come procedura di conferma quando si analizzano i microbi ambientali in laboratorio. Se un metodo di coltura non è in grado di distinguere tra determinati organismi presenti in un campione ambientale, allora la PCR potrebbe essere utilizzata per distinguere specificamente tra i microbi candidati.

La PCR convenzionale può essere modificata in diversi modi per particolari scopi sperimentali. La PCR può essere utilizzata per analizzare modelli di RNA a singolo filamento accoppiandosi a una fase di trascrizione inversa (RT-PCR). Oltre a una determinazione della presenza rispetto all'assenza, la PCR quantitativa (qPCR) può misurare la concentrazione per il DNA specifico di interesse.