Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

ניתוח RNA של דגימות סביבתיות באמצעות RT-PCR
 
Click here for the English version

ניתוח RNA של דגימות סביבתיות באמצעות RT-PCR

Overview

מקור: מעבדות של ד"ר איאן פפר וד"ר צ'ארלס גרבה - אוניברסיטת אריזונה
מחבר מפגין: בראדלי שמיץ

תגובת שרשרת תמלול-פולימראז הפוכה (RT-PCR) כרוכה באותו תהליך כמו PCR קונבנציונלי - טמפרטורת רכיבה על אופניים כדי להגביר חומצות גרעין. עם זאת, בעוד PCR קונבנציונאלי רק מגביר חומצות deoxyribonucleic (DNA), RT-PCR מאפשר הגברה של חומצות ריבונוקלאיות (RNA) באמצעות היווצרות של DNA משלים (cDNA). זה מאפשר לאורגניזמים מבוססי RNA שנמצאו בסביבה להיות מנותחים תוך שימוש בשיטות וטכנולוגיות המיועדות לדנ"א.

וירוסים רבים שנמצאו בסביבה משתמשים ברנ"א כחומר הגנטי שלהם. מספר פתוגנים ויראליים מבוססי RNA, כגון Norovirus, ואורגניזמים אינדיקטור, כגון וירוס mottle קל פלפל (PMMoV), אין שיטות זיהוי מבוססות תרבות לכימות. על מנת לזהות את נוכחותם של נגיפי RNA אלה בדגימות סביבתיות מאדמה, מים, חקלאות וכו ',בדיקות מולקולריות מסתמכות על RT-PCR כדי להמיר RNA ל- DNA. ללא RT-PCR, מיקרוביולוגים לא יוכלו לחקור ולחקור וירוסים רבים מבוססי RNA המהווים סיכונים לבריאות האדם והסביבה.

RT-PCR יכול לשמש גם ככלי למדידת פעילות מיקרוביאלית בסביבה. Messenger RNA (mRNA) היא התבנית החד-גדילית לתרגום חלבונים, ומדידת רמות ה-mRNAs השונות מציינת אילו גנים מהם מתבטאים חיידקים בתוך הסביבה. ניתוח ביטוי גנים נותן רמזים אילו מסלולים ביולוגיים משמשים אורגניזמים כדי לשרוד בתנאים סביבתיים שונים. במקרים מסוימים, ביטוי גנים יכול להיות מנוצל כדי לקבוע אילו אורגניזמים עשויים לשרוד בצורה הטובה ביותר בתנאים קשים ויש להם יכולות לתיקון ביולוגי של קרקע מזוהמת או מים.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PCR מבוסס על הגברה של תבניות DNA, אשר מגביל את השימוש בו בזיהוי RNA מאורגניזמים. עם זאת, RT-PCR מספק אמצעי לשימוש ברנ"א לייצור cDNA באמצעות אנזימים מיוחדים, המכונה תמלול הפוך (RT). לאחר מכן ניתן להשתמש ב- cDNA זה כתבנית ההתחלתית להגברה עוקבת עם PCR קונבנציונלי (איור 1).

ניתן לשלוט בתעתיק הפוך כדי להגביר רק את המוצרים הרצויים או קהילה שלמה של חומצות גרעין שנמצאות בתוך מדגם סביבתי, בהתאם לפריימרים המשמשים ליצירת סינתזת cDNA. זה חשוב, כמו דגימות קרקע ומים הם לעתים קרובות רוויים עם חומצות גרעין שונות שאינם רצויים עבור ניתוחים ספציפיים. פריימרים אקראיים, אשר יכול לאגד רצפי RNA שנמצאו בכל סוג של חיידקים, ניתן להשתמש RT-PCR כדי לזהות את רוב RNA, כך הדגימה ניתן לנתח עבור נוכחות ושפע יחסי של אורגניזמים מרובים בסביבה. מצד שני, פריימרים ספציפיים לרצף ליזום סינתזת cDNA עבור רצפים מדויקים שנמצאו רק אורגניזמים אחד או כמה. זה מאפשר מדגם סביבתי להיבדק למטרה מסוימת, כגון קביעת אם Norovirus, אשר יכול לגרום למחלות במערכת העיכול בבני אדם, נמצא במים.


Figure 1
איור 1. תהליך שלב אחר שלב של ניתוח RT-PCR של דגימות RNA סביבתיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. איסוף דוגמאות: דגימת קרקע

  1. מצא מיקום לדוגמה באמצעות GPS, קואורדינטות או מראה.
  2. לדגימה אקראית, בחרו נקודות אקראיות בתוך אזור כדי לקבל מפקד כללי של בתי גידול מיקרוביאליים. דגימה טרנסקטית אוספת מנקודות לאורך קו ישר, למשל,בסמוך לאפיק נחל. דגימות רשת נלקחות באופן שיטתי מנקודות במרווחי זמן קבועים, והן שימושיות למיפוי קהילות מיקרוביות באזור לא ידוע או משתנה.
  3. דגימה בעומק של 7.5-15 ס"מ מספקת גישה לפעילות המיקרוביאלית הנפוצה ביותר הקרובה, אך לא בתוך, הריזוספירה (האזור הצר של האדמה המושפע ישירות משורשי הצמח והמיקרואורגניזמים הקשורים אליהם).
  4. כדי לאסוף את דגימת הקרקע, לדחוף ולסובב את היד auger לתוך הקרקע לעומק קבוע מראש.
  5. תרים את האוגר. האדמה נמצאת בתוך הגבעול החלול של האוגר.
  6. מגרדים את האדמה בתחתית האוגר לתוך שקית איסוף אדמה. הקפד לא לגעת או לזהם את האדמה.
  7. סמן את התיק כראוי עם מיקום, שם, תאריך ושעה.
  8. במעבדה, להעביר את האדמה דרך מסננת 2 מ"מ כדי להסיר כל חצץ וסלע.
  9. לנתח חלק מהאדמה עבור תוכן לחות הקרקע. לקבלת פרטים על שלב זה, אנא עיין בסרטון החינוך המדעי JoVE על לחות הקרקע.

2. איסוף דוגמאות: דגימת מים

  1. מצא את המיקום לדוגמה באמצעות GPS, קואורדינטות, או ראייה.
  2. לאסוף את המים בבקבוק אחסון. תיעד את נפח המים שנאספו; אם חיידקים במדגם נעשים כמותית, אז הריכוז המיקרוביאלי יכול להיקבע על סמך הנפח שנאסף.
  3. בדוק מיד את המים עבור כל הפרמטרים הנדרשים לניסוי (טמפרטורה, pH, מוליכות, מליחות, חנקן ותכולת זרחן וכו ') באמצעות הבדיקות האלקטרוניות המתאימות.
  4. מניחים את הבקבוק המכיל את דגימת המים לתוך צידנית עם קרח. מעבירים את הצידנית למעבדה.

3. מיצוי RNA

  1. כדי לאסוף ולרכז מיקרואורגניזמים מהדגימה הסביבתית, אנא עיין בסרטון החינוך המדעי JoVE על מיצוי חומצת גרעין קהילתית.
  2. לחלץ RNA מווירוסים באמצעות ערכת מיצוי מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
  3. בקצרה, תחילה לערבב את הדגימות עם חיץ תמה בתוספת אתנול, ולאחר מכן להוסיף את הדגימות לתוך עמודות ספין.
  4. צנטריפוגות העמודות בערך 12,000 x g, להשליך flowthrough. הוסף שוב מאגר כביסה לעמודים וצנטריפוגה.
  5. הוסיפו מים נטולי RNase לעמודים וצנטריפוגה למשך 30 s כדי לחמוק מ- RNA לצינורות מיקרופוגה סטריליים של 1.5 מ"ל עם הידבקות נמוכה.

4. תמלול הפוך - PCR

  1. אחזר את ריאגנטים הבאים מן המקפיא -20 °C: dNTP, מרוכז (למשל,10x) מאגר תמלול הפוך, פריימרים (בדוגמה זו, פריימרים אקראיים). הפשירו אותם על קרח או בטמפרטורת החדר בתוך מכסה המנוע הנקי, ושמירו אותם על קרח לאחר שהופשרו. גם לאחזר את התמלול ההפוך ומעכב RNase ולשמור אותם על קרח.
  2. חשב את אמצעי האחסון הריאגנט הדרושים כדי ליצור "תערובת אב" המשלבת את כל הריאגנטים הקבועים בין כל תגובה (ראה טבלה 1 לתגובה לדוגמה). הכן תערובת אב מספיק עבור כל מדגם, כמו גם פקד חיובי (באמצעות תבנית תעתיק ידועה) ושליטה שלילית (למשל,ללא תמלול הפוך, עם רק מים כתבנית, וכו ') תגובות. כלול 10% נוספים בנפח.
  3. להרכיב את תערובת האב בצינורות מיקרו-הידבקות נמוכה 1.5 מ"ל. זה ממזער את הכריכה של מולקולות ריאגנט לקירות הפלסטיק של הצינורות.
  4. כאשר ריאגנטים מופשרים, הוסף נפחים מחושבים לצינור המיקרו-פוגה. מערבולת בעדינות צנטריפוגה כל צינור לפני תוספת. הקפד לשנות טיפים pipette בין הוספת כל ריאגנט כדי למנוע זיהום.
  5. לאחר כל ריאגנטים נוספו, מערבולת וצנטריפוגות תערובת מאסטר כדי להבטיח תערובת הומוגנית. החזירו ריאגנטים לאחסון ב-20 מעלות צלזיוס.
  6. הכן וסמן רצועות PCR עם 8 צינורות, וייעד צינור אחד לכל דגימה או תגובת בקרה.
  7. Aliquot נפח שווה של תערובת מאסטר לתוך כל צינור. לאחר מכן, הוסף רכיבים ספציפיים לתגובה, כגון תמציות ה- RNA.
  8. הניחו את מכסה הרצועה בבטחה על רצועת ה-PCR, וצנטריפוגה במיניצנטריפוגה עם מתאם צינור פסים כדי להבטיח שכל הנוזלים יאספו בתחתית כל צינור(איור 2).
  9. מקם את רצועת ה- PCR בבטחה בתרמוסקלר. לחץ למטה כדי להבטיח צינורות מאובטחים.
  10. הגדר את התרמו-מחזור להפעלת התוכנית המתאימה לשימוש ב- RT (ראה טבלה 2 עבור פרוטוקול לדוגמה). כאשר התוכנית הושלמה, הצינורות יכילו מוצרי cDNA, אשר לאחר מכן יכול להיות נתון להגברת PCR. לפרטים, עיין בסרטוני החינוך המדעי של JoVE ב- PCR וב- PCR כמותי. יש לאחסן את cDNA ב- -20 °C (70 °F) עד לשימוש.

Figure 2
איור 2. רצועת 8 צינורות עם כתרים המכילה תערובת ותמצית מאסטר.

מגיב עוצמת קול לתגובה אחת (μL)
מאגר RT 10x 2.0
25x dNTPs 0.8
פריימר אקראי 10x 2.0
ריבוי מנויים 1.0
מעכב רנאז 1.0
כיתה מולקולריתH 2 O 3.2
נפח כולל 10

טבלה 1. RT מאסטר לערבב מרכיבים.

שלב 1 שלב 2 שלב 3 שלב 4
25 °C (5°F), 10 דקות 37 °C (77 °F), 120 דקות 85 °C (5 דקות), 5 דקות 4 °C (5%), ∞

טבלה 2. תוכנית תרמוציקלר תגובת RT.

תגובת שרשרת פולימראז תמלול הפוך, או RT-PCR, מאפשרת זיהוי של וירוסי RNA וביטוי גנים מיקרוביאליים בסביבה.

שלא כמו אורגניזמים תאיים מבני אדם ועד חיידקים, המשתמשים בדנ"א כחומר הגנטי שלהם, יש וירוסים מסוימים שיש להם גנומים העשויים מרנ"א, כולל וירוסים פתוגניים רבים כגון שפעת, אבולה ו- HIV. בעוד וירוסים מסוימים ניתן לזהות על ידי התבוננות פנוטיפ פתוגניים המתפתח כאשר נעשה שימוש להדביק תאים בתרבית התא, לרוב אין שיטות אפיון מבוססות תרבות. RT-PCR יכול לשמש כדי לזהות את נוכחותם של וירוסים אלה בסביבה עם רגישות גבוהה.

יחד עם זאת, אורגניזמים עם גנומים מבוססי DNA "מבטאים" את המידע הגנטי המקודד בגנומי ה- DNA שלהם על ידי "תעתיק" אותם לשליח או "m"RNA, אשר לאחר מכן ניתן "לתרגם" לחלבונים כדי לבצע תפקוד אנזימטי או מבני בתאים. כאשר חיידקים מגיבים ומסתגלים לשינויים בסביבה על ידי הפעלה או כיבוי של מסלולים גנטיים שונים, ניתן להשתמש ב- RT-PCR כדי לעקוב אחר שינויים כאלה בביטוי גנים כדי לשמש שמאי מערכת אקולוגית פוטנציאליים.

וידאו זה יעבור על העקרונות שמאחורי RT-PCR, יתווה הליך כללי לביצוע טכניקה זו, ולבסוף, יבחן כמה מהדרכים שבהן שיטה זו מיושמת במיקרוביולוגיה סביבתית כיום.

ישנם שני חלקים מרכזיים בהליך זה: הפקת RNA מדגימות ביולוגיות, ואחריו התמלול ההפוך שלו לדנ"א.

הבידוד של RNA כרוך lysing תאים במדגם על ידי הוספת חומר ניקוי שמפרק שומנים וחלבונים, ואחריו הפרעה מכנית. חילוץ RNA מווירוסים דורש בדרך כלל תוספת של חלבונים, שהם אנזימים מעכלי חלבונים, כדי לפרק את הקפסידים של הנגיפים - מעילי החלבון הקשוחים היוצרים את החלקיק הנגיפי. מצד שני, בעת קבלת RNA מאורגניזמים תאיים, ייתכן שיהיה צורך לטפל ב- lysate באנזימים משפילים לדנ"א, או DNAases, כדי למנוע תוצאות במורד הזרם להיות מבולבל על ידי נוכחות של DNA דומה מבחינה כימית.

לאחר מכן ניתן לטהר את הרנ"א מליסאטים באחת משתי דרכים. בשיטה אחת, המכונה חומצה guanidinium thiocyanate-פנול-כלורופורם מיצוי, ליסאט מעורבב עם תערובת אורגנית-מימית כי הוא אז צנטריפוגה כדי להפריד את השלבים. חלבונים יחלקו לשלב האורגני, פסולת תאים תותבת לתוך אינטרפאזה מעונן, וחומצות גרעין לתוך השלב מימי. השלב מימי העליון ניתן לאסוף לאחר מכן, וRNA הוא מזועזז על ידי תוספת של אלכוהול כגון איזופרופנול, אשר מקטין את המסיסות של חומצת הגרעין במים.

בבידוד RNA מבוסס טורים, lysate מעורבב עם אלכוהול ולאחר מכן עבר דרך עמוד סינון ג'ל עם שרף טעון שלילית, כגון סיליקה. הליסאט מוכן כך שיונים טעונים באופן חיובי בצורת חיץ "גשרי מלח" המאפשרים לעמוד השדרה הפוספט הטעון השלילי של חומצות גרעין להיקשר לשרף. כל המזהמים האחרים נשטפים לאחר מכן. חומצות הגרעין "נלבות" מהעמוד באמצעות חיץ או מים בעלי מלח נמוך. מכיוון שלרנ"א חד-גדילי יש פחות מטענים שליליים מאשר לדנ"א דו-גדילי, ניתן לחמוק ממנו באופן מועדף באמצעות מאגרים של ריכוזים ספציפיים.

לאחר בידוד, הרנ"א הופך לדנ"א יציב יותר מבחינה כימית. מדענים רתמו אנזים המקודד באופן טבעי על ידי רטרווירוסים כמו HIV. אנזים זה ידוע בשם תמלול הפוך, או "RT".

RT מסונתז משלים או "c"DNA מרצועת קצרה של נוקלאוטידים המכונה פריימר. פריימר זה יכול להיות רצפים שונים, בהתאם למטרת הניסוי. לדוגמה, פריימר יכול להיות מתוכנן יש רצף מסוים, על מנת לזהות גנים ספציפיים או אורגניזמים. לאחר מסונתז, זה "גדיל ראשון" cDNA יכול להיות מוגבר על ידי PCR רגיל.

עכשיו שיש לנו הבנה של העקרונות מאחורי RT-PCR, בואו נסתכל על פרוטוקול לביצוע טכניקה זו על דגימות RNA שנאספו מהסביבה.

כדי להתחיל בהליך, מצא מיקום איסוף לדוגמה באמצעות קואורדינטות GPS או מראה. בחר נקודות אקראיות בתוך אזור כדי לקבל סקר כללי של בתי גידול מיקרוביאליים.

כדי לאסוף את המדגם המוצק, לדחוף ולסובב את היד auger לתוך הקרקע עד לעומק קבוע מראש. כאשר האוגר מורם, ניתן למצוא אדמה בתוך הגבעול החלול של האוגר.

אדמה זו מגרדת ישירות לתוך שקית איסוף קרקע ואת התיק מסומן עם המיקום, שם, תאריך, שעת האיסוף וכל מידע נחוץ אחר.

מעבירים את הקרקע למעבדה ומעבירים את האדמה דרך מסננה 2 מ"מ כדי להסיר חצץ וסלע. לנתח מדגם של הקרקע עבור תוכן לחות, אשר יכול להיות אינפורמטיבי על רמת הפעילות המיקרוביאלית בקרקע. כדי לעשות זאת, עיין בסרטון של אוסף זה "קביעת תכולת הלחות של האדמה".

לאיסוף דגימות מים, בחרו אתר מעניין הדומה לאיסוף קרקעות, ואוספים מים לבקבוק פלסטיק סטרילי עם קירות עבים. שים לב לנפח המים שנאספו. בדוק את המים באופן מיידי עבור פרמטרים כמו טמפרטורה, pH, ומליחות, אשר יכול לספק מידע חשוב על רמות מיקרוביאלי צפוי במדגם. לאחר מכן, מניחים את הבקבוק בצידנית ומעבירים למעבדה.

מיקרואורגניזמים כגון וירוסים נאספים ומרוכזים מהדגימה הסביבתית.

ניתן לחלץ RNA מהוירוסים שנאספו בשיטת טור הספין באמצעות ערכות חילוץ RNA מסחריות בהתאם להוראת היצרן. חיץ ליזה, בתוספת אתנול, מעורבב תחילה עם המדגם. מקם את המספר המתאים של עמודות ספין בצינורות איסוף ולאחר מכן החל את הדגימות על מטריצת העמודות. צנטריפוגות העמודות בערך 12,000 x g במשך 1-2 דקות כדי לתת חומצות הגרעין להיקשר לעמוד, ולהשליך את הזרימה הנוזלית דרך.

הוסף שוב מאגר כביסה לעמודים וצנטריפוגה. מקם את העמודים לתוך צינורות מיקרופוגה הידבקות נמוכה חדשים סטריליים 1.5 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף מים כי הוא ללא RNases, שהם אנזימים להשפיל RNA, לעמודים צנטריפוגה במשך 30 s כדי לחמוק RNA. ניתן לאחסן את הרנ"א הנלהב ב-80 °C (80 °F) עד לשימוש.

לפני הניסוי, פריימרים מתאימים צריכים להיות מתוכננים על מנת לזהות את רצפי העניין, אשר יכול לשמש סמנים לנוכחות של מיקרואורגניזמים ספציפיים.

מוציאים את ריאגנטים RT המאוחסנים ב -20 °C (70 °F), ולהפשיר את ריאגנטים קפואים על קרח (או בטמפרטורת החדר). אלה כוללים נוקלאוטידים, מאגר תמלול הפוך, פריימרים. לאחר שהופשר, שמור את ריאגנטים על קרח; האנזים הפוך תמלול, מעכב RNase תמיד צריך להישמר על קרח.

בעוד ריאגנטים מפשירים, לחשב את הנפחים והריכוזים של מרכיבי התגובה. לאחר ריאגנטים מופשרים, מערבולת בעדינות לסובב כל צינור כדי להבטיח את התוכן מעורב היטב.

עבודה במכסה המנוע של זרימת למינאר כדי למנוע זיהום, להרכיב את הרכיבים בתערובת מאסטר להוסיף לכל צינור PCR. בעת הרכבת תערובת האב בצינור אפנדורף, הקפד לשנות טיפים pipette בין כל ריאגנט כדי למנוע זיהום. אחרי כל הריאגנטים נוספו לצינור אפנדורף, מערבולת בעדינות לסובב את צינור תערובת מאסטר כדי להבטיח תערובת הומוגנית.

סמן סט של צינורות PCR, הקפד לכלול פקדים. Aliquot נפח שווה של תערובת האב לתוך כל צינור. לאחר מכן, הוסף רכיבים ספציפיים לתגובה, כגון תמציות RNA או מים לשליטה שלילית.

לאחר הוספת כל הרכיבים, הנח את הצינורות בתרמוסקלר והגדר את תוכנית התמלול ההפוכה לפעול. לאחר מכן ניתן יהיה לחשוף את ה- cDNA להגברת PCR. לקבלת תיאור מפורט של שלב זה, עיין בסרטון הווידאו של אוסף זה ב- PCR.

כאשר ה- PCR הושלם, ניתן להפריד ולדמיין חלק ממוצר ה- PCR על ג'ל אגרוז. לדוגמה, פריימר ספציפי לגנים שימש כאן כדי לזהות נוכחות של וירוס RNA. רצועות בגודל הצפוי מתקבלות מתגובת RT-PCR אך לא מהבקרות השליליות, המציינות את נוכחותו של וירוס זה בדגימת המים הנבדקת.

זיהוי מיקרואורגניזמים מבוססי RNA על ידי RT-PCR מאפשר ניתוח של בריאות אקולוגית, סיכונים סביבתיים ושימור המגוון הביולוגי.

השימוש במיקרואורגניזמים לניקוי פחמימנים וממסים מאדמה ומים מזוהמים מהווה חלופת תיקון ברת קיימא לסביבה. הבנת ביטוי גנים מיקרוביאליים מקוריים יכולה להדגיש מסלולים מיקרוביאליים ספציפיים שמפרקים מזהמים בתנאים אלה. RT-PCR מנוצל לעתים קרובות כדי להגביר mRNA מדגימות סביבתיות כאלה.

אמצעי בריאות הציבור דורשים לעתים קרובות מעקב מהיר אחר מקורות ויראליים של זיהום בסביבה. שפעת העופות, למשל, מדבקת מאוד ויכולה להתפשט במהירות לעופות, לבעלי חיים ואפילו לבני אדם. בדוגמה הספציפית הזו, החוקרים חיפשו את האיום של שפעת העופות המופצת על ידי ציפורי בר.

באמצעות התקנה ומנגנון RT-PCR ניידים, הם הקרינו מגוון של ציפורי בר, אפילו באזורים מרוחקים, כדי לזהות זיהומים מוקדם ולמנוע שידור.

לבסוף, RT-PCR יכול לשמש כדי לאפיין "biopesticides" שפותחו כדי למקד מזיקים כגון צלף זכוכית כנף, Homalodisca vitripennis, המארח למחלה שפוגע קשות גפנים בצפון אמריקה. נגיף RNA חד-גדילי חדש מפותח כסוכן להדביק את החרק הזה. באמצעות שילוב של תרבית התא Homalodisca ואישור RT-PCR של עומס ויראלי, מחברים אלה הצליחו להפיץ ריכוז גבוה של וירוס לשימוש כסוכן בקרה ביולוגית.

הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE לניתוח אורגניזמים סביבתיים מבוססי RNA על ידי RT-PCR. עכשיו אתה צריך להבין את התיאוריה מאחורי הפרוטוקול, איך ליישם את הטכניקה למחקר שלך, וכמה דרכים שבהן הוא נמצא בשימוש בתחום היום. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עם השלמת RT-PCR, ניתן להפריד ולדמיין חלק ממוצר ה-PCR על ג'ל אגרוז(איור 3). בדוגמה זו, פריימר ספציפי לגנים שימש לזיהוי לנוכחות של וירוס RNA. רצועות בגודל הצפוי מתקבלות משתיים מהדגימות ותגובת השליטה החיובית, אך לא מהשליטה השלילית, המציינת את נוכחותו של וירוס זה בשתיים מדגימות המים הנבדקות.

Figure 3
איור 3. אלקטרופורזה ג'ל של מוצרי RT-PCR. M: סמן גודל DNA; P: שליטה חיובית; N: שליטה שלילית. תגובות באמצעות RNA מארבע דגימות מים בוצעו בנתיבים 1, 2, 3 ו-5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

RT-PCR נחוץ ליצירת cDNA מתבנית RNA. זה מאפשר ניתוח מיקרואורגניזמים מבוססי RNA באמצעות בדיקות מולקולריות שפותחו עבור DNA. לאחר cDNA מסונתז, בדיקות PCR יכול לקבוע את נוכחותם או היעדרם של מיקרואורגניזמים מבוססי RNA בתוך מדגם סביבתי. זה מאפשר ניתוח נוסף במורד הזרם כדי לקבוע אקולוגיה מיקרוביאלית, סיכונים בריאותיים, וסיכונים סביבתיים.

RT-PCR יכול גם להיות מנוצל כדי assay mRNA כאמצעי כדי לראות אילו גנים באים לידי ביטוי בסביבה. זה מספק מידע על אילו חלבונים ומסלולים חיידקים מסתמכים כדי לשרוד בתנאים סביבתיים מסוימים. ניתוחי ביטוי גנים יכולים לזהות מסלולים מיקרוביאליים המפרקים מזהמים סביבתיים כגון פחמימנים או ממיסים כלור, וניתן לרתום חיידקים עם מסלולים אלה לתווך ביולוגי.

הערכת סיכונים משלבת RT-PCR על מנת לנתח סיכונים בריאותיים אנושיים וסביבתיים. שילוב RT עם PCR כמותי מאפשר להיפטר מווירוסי RNA בתוך דגימות, כך שניתן לחשב חשיפה אנושית וסביבתית לצורך הערכת סיכונים מיקרוביאלית כמותית (QMRA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter