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高性能液相色谱法 (HPLC)

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高性能液相色谱法或高效液相色谱法,是一种高度灵活的技术,分离液体混合物根据其不同与固定相交互的组件。

高效液相色谱法是适应的柱层析。在柱色谱柱填料是微尺度珠称为固定相。固定相珠是诱导珠和混合物的液体,或移动阶段位于组件之间的交互的化学基团羧基化。当混合物流经列,组件之间的交互与固定相以不同的方式。

在高效液相色谱法,柱层析法在更高的流量执行率,并因此更高的压力,比经典柱色谱法。这允许使用较小的固定相磁珠与更大的表面积与体积比,大大增加了在流动相中的固定相和组件交互。

这个视频将介绍基本的操作的高效液相色谱法,通过展示各种减肥苏打水组分的分离。

有的高效液相色谱法在实验室中使用的两种类型: 分析,和制备。在分析高效液相色谱法,确定组件的体积小,使用仪器和分析的样品然后丢弃废物作为。在制备型高效液相色谱法,仪器用于净化混合物和大量所需的每个组件收集馏分中。

高效液相色谱法检测由一系列的简单组件组成。第一,流动相,在溶剂水库举行被抽水通过系统由一个或多个泵在恒定流率。样品进样器通过注入流动相流。样品稀释的流动相,然后传送到高效液相色谱柱中, 的样品的成分组成的分隔开。然后分析组成,由探测器,及保存供以后使用,馏分中,或转移到废瓶。

高效液相色谱柱是该系统的关键组件。它是由一个金属或塑料圆筒,挤满了微尺度珠子的固定相或层析树脂组成。样品混合物流经填料的颗粒床在恒定流率与每个组件交互与固定相,如它的流动。

化合物与交互固定相不同,并因此沿到不同速度检测器的列的长度。要退出列,或洗脱,组件所需的时间称为保留时间。结果是一个阴谋的保留时间与强度或色谱图。保留时间用于标识该组件。峰值大小,峰下, 区专门用于量化初始解决方案中化合物的量。

固定相的选择取决于样品混合物中的组件的属性。最常用的固定相是二氧化硅微球,因为它们是一种惰性的非极性材料,形成微尺度珠,并且达到足够的堆积密度。高效液相色谱法的最常见类型是反相色谱,采用疏水性的固定相,通常硅珠与 C18 链珠子的表面。组件被洗脱依次降低极性。

反相色谱法中使用的流动相通常是水和有机溶剂,如乙腈的混合物。根据样品,流动相可以保持稳定比例的水和有机溶剂,称为等度模式。然而,这能导致广泛的山峰,在水分含量高或重叠峰 — — 在有机质含量高的情况下。

流动相的比例可以也改变线性或逐步分离,要创建流动相渐变过程。梯度洗脱可以防止峰展宽的低极性成分,从而提高分离洗脱时间缩短。

现在的概述了基本的高效液相色谱法,高效液相色谱技术将能证明在实验室里。在这个实验中,高效液相色谱法将用于分离和量化三个常见的减肥苏打水的部件。

首先,准备为流动相,添加乙腈 400 毫升到 1.5 L 的纯净的去离子水。然后小心地加入冰醋酸 2.4 mL。稀溶液到 2 L.总体积生成的解决方案应该有 2.8 和 3.2 之间的 ph 值。

通过添加 40%调整到 4.2 pH 氢氧化钠,落到搅拌的解决方案,使用校准的 pH 计。

通过真空脱气解决方案和删除可以插入列的固体 0.47 μ m 膜过滤器过滤流动相。它是重要脱气解决方案,如泡沫可以在固定相,导致空洞或他们的探测器单元格的方式工作和测量中导致不稳定。

准备三个组件解决方案的咖啡因、 苯甲酸和阿斯巴甜,三个典型组件减肥苏打水。这些组件解决方案然后用于准备将用来确定未知的标准解。准备 500 毫升的咖啡因和苯甲酸的解决方案。

准备 100 毫升的阿斯巴甜组件解决方案。在不使用以避免分解时冰箱里存储解决方案。

接下来,准备 7 标准的解决方案,每个都有不同浓度的咖啡因、 苯甲酸和阿斯巴甜。吸管适量的每个组件的容量瓶,和稀释至 50 毫升马克与流动相。

第一次 3 解决方案每个包含一个组件,以使峰值识别。其他 4 的解决方案包含的所有 3 个成分,浓度范围为关联到浓度峰值高度。

每个标准溶液倒入一个标记的小瓶在样品架。放入冰箱储存样品架样品和剩余的解决方案。

首先,建立了流动相及废弃物容器。确保废物线送入废物容器,和不回收回流动相。确保入口流动相线被送入流动相容器。

验证的流动相流速设置为 0.5 m l/min。这种流量将启用所有组件在 5 分钟内洗脱却慢得足以确保各自的峰顶决议。

接下来,验证溶剂输送系统的最小值和最大压力。这些设置关闭泵泄漏或堵塞,分别。

探测器的前面板,设置空白上按"零"。冲洗用去离子水,然后用几卷 7 工作标准 1 100 μ L 注射器。然后注射器吸满这种解决办法。开始与 3 单组分样品以确定每个组件的高峰期。

接下来,手动注入的解决方案,通过放置注射器处理在负载的位置。慢慢地注入 100 μ L 的溶液通过隔膜端口。

验证数据采集程序被设置为收集数据为 300 s,允许足够的时间为所有 3 个波峰通过探测器洗脱。当准备好开始审判时,以样品注入流动相旋转注射位置,喷油器的句柄。立即,单击"开始审判"数据采集程序。扫描完成后,每个 7 标准溶液重复该过程。对于每个第一 3 标准,只有一个 3 峰出现。请注意峰,用来标识该组件的位置。

选择 3 饮食苏打水样品,并允许他们坐在打开容器一夜之间,以删除碳化。

隔夜的脱气后, 引入塑料注射器约 3 毫升的每个无糖苏打水。接下来,将香烟过滤嘴附加到注射器和苏打水通过过滤器推动以删除任何固体微粒的玻璃小瓶。

稀释 2 毫升的流动相,苏打水浓度减少一半的每个样品 2 毫升。

引入一个注射器,100 μ L 的苏打水样本之一和注入样品循环。运行审判具有相同参数的标准解决方案。对于每个苏打水样本重复。

第一,关联到已知浓度的标准样品的峰面积。要这样做,请确定为每个标准样品,采用三角形法色谱仪上的峰面积。计算在一半的高度,宽度与高度高峰和使用这个值作为峰面积。

使用已知的浓度与峰面积创建校准曲线的每个组件,并确定适合每个校准曲线的最小二乘法。

计算每个组件在汽水从峰面积的浓度。还记得苏打水都被稀释因子 2 之前注入高效液相色谱法。基于这些结果,计算毫克的 12 盎司罐汽水中每个组件。

意料之中的是,测试的所有 3 苏打水大致包含相同数量的防腐剂苯甲酸。然而,焦炭产品包含了更多的咖啡因。所有组件的计算的值好相关报告值由制造商。

高效液相色谱法是一高度通用的仪器,用在广泛的分析。

高效液相色谱法经常用于净化肽分子。在此示例中,跨膜多肽复合物制备,然后稳定氧化交联蛋白质二硫键。

这种蛋白质,然后溶解于蚁酸,和纯化用反相高效液相色谱法。样品洗脱时间然后使用线性渐变的两种溶剂和纯度证实与质谱。

高效液相色谱法也可以用于标识在实验室合成的有机化合物。在米勒 Urey 实验中,研究了有机物在原始地球上的生物合成。原始的气体,如甲烷和氨,被引进到一瓶含有水、 模拟早期海洋。然后采用了电火花,模仿原始地球上的闪电。

采用高效液相色谱质谱,和相对于已知的氨基酸标准然后分析了水。23 种氨基酸合成了在这个实验中确定。

你刚看了朱庇特的简介高效液相色谱法。现在,您应了解基本的运行仪器和分析结果数据。

谢谢观赏 !

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