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Chromatographie en phase liquide à haute Performance (CLHP)
 

Chromatographie en phase liquide à haute Performance (CLHP)

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Chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC, est une technique très polyvalente qui sépare les composants d’un mélange liquid basés sur leurs différentes interactions avec une phase stationnaire.

HPLC est une adaptation de la chromatographie sur colonne. En chromatographie sur colonne, une colonne est remplie de perles de micro-échelle appelés la phase stationnaire. Les perles de la phase stationnaire sont fonctionnalisés avec des groupes chimiques qui induisent une interaction entre le talon et les composants d’un mélange situé dans la phase liquide, ou mobile. Que le mélange s’écoule à travers la colonne, les composants interagissent différemment avec la phase stationnaire.

En HPLC, chromatographie sur colonne est effectué à un débit plus élevé taux et donc plus élevée pression, que la chromatographie sur colonne classique. Cela permet d’utiliser de petites perles de phase stationnaire avec une plus grande surface au rapport de volume, ce qui augmente considérablement l’interaction de la phase stationnaire et les composants dans la phase mobile.

Cette vidéo mettra en place les bases du fonctionnement du HPLC en démontrant la séparation d’éléments de différentes de boissons gazeuses diète.

Il existe deux types de HPLC utilisé en laboratoire : analytique et préparative. En HPLC analytique, l’instrument est utilisé pour identifier les composants d’un petit volume, et l’échantillon analysé est ensuite jeté comme un déchet. HPLC préparative, l’instrument est utilisé pour purifier un mélange et une quantité désirée de chaque composant est recueillie dans les fractions.

L’instrumentation HPLC consiste en une série de composants simples. Tout d’abord, la phase mobile, qui s’est tenue dans les réservoirs de solvants, est pompée à travers le système par une ou plusieurs pompes à débit constant. L’échantillon est injecté dans le courant de phase mobile par l’injecteur de l’échantillon. L’échantillon dilué par la phase mobile, est ensuite transmis à la colonne HPLC, où les composants de l’échantillon sont séparés. Les composants sont ensuite analysées par le détecteur et soit sauvé dans les fractions pour une utilisation ultérieure, soit transféré dans une bouteille pour eaux usées.

La colonne HPLC est le composant clé du système. Il est composé d’un cylindre en métal ou en plastique, rempli de perles de micro-échelle de phase stationnaire, ou chromatographie sur résine. Le mélange de l’échantillon s’écoule à travers le lit de particules emballés à un débit constant et chaque composant interagit avec la phase stationnaire, telle qu’elle circule par.

Les composés interagissent avec la phase stationnaire différemment et par conséquent voyages sur toute la longueur de la colonne dans le détecteur à un rythme différent. Le temps requis pour un composant quitter la colonne ou éluer, s’appelle le temps de rétention. Le résultat est une parcelle de temps de rétention vs intensité ou un chromatogramme. Le temps de rétention est utilisé pour identifier le composant. La taille de pointe, en particulier la région sous le pic, est utilisée pour quantifier la quantité du composé dans la solution initiale.

Le choix de la phase stationnaire dépend des propriétés des composants dans le mélange de l’échantillon. La phase stationnaire plus couramment utilisée est perles de silice, car ils sont un matériau inerte et non polaire qui se forme à micro-échelle perles et permet d’obtenir une densité suffisante d’emballage. Le type le plus commun de HPLC est la chromatographie en phase inversée, qui utilise une phase stationnaire hydrophobe, généralement des perles de silice avec des chaînes de C18 collés sur surface des perles. Les composants sont éluées par ordre décroissant de polarité.

La phase mobile utilisée en chromatographie en phase inversée est généralement un mélange d’eau et d’un solvant organique, l’acétonitrile. Selon l’échantillon, la phase mobile peut rester un ratio constant de l’eau et de solvant organique, appelée mode isocratique. Toutefois, cela peut conduire à des pics larges, dans le cas de haute teneur, en eau ou des pics qui se chevauchent — dans le cas de la haute teneur en matières organiques.

Le rapport de la phase mobile peut également être modifié linéairement ou progressivement au cours de la séparation, pour créer un gradient de phase mobile. Une élution gradient peut empêcher pic élargissement des composants moins polaires, améliorant ainsi la séparation et raccourcir le temps d’élution.

Maintenant que les bases de l’HPLC ont été décrites, la technique HPLC sera démontrée en laboratoire. Dans cette expérience, HPLC servira à séparer et à quantifier les trois composants communs de gazeuses diètes.

Tout d’abord, pour préparer la phase mobile, ajouter 400 mL d’acétonitrile à 1,5 L d’eau déionisée purifiée. Puis ajouter avec précaution 2,4 mL d’acide acétique glacial. Diluer la solution d’un volume total de 2 L. La solution obtenue doit avoir un pH entre 2.8 et 3.2.

Ajuster le pH à 4,2 en ajoutant 40 % NaOH, goutte-à-goutte pour la solution en remuant, à l’aide d’un pH-mètre calibré.

Filtrer la phase mobile à travers un filtre à membrane 0,47 μm sous vide pour dégazer la solution et retirer les solides qui pouvaient brancher la colonne. Il est important de dégazer la solution, comme les bulles peuvent causer des vides dans la phase stationnaire, ou faire leur chemin à la cellule du détecteur et provoquer une instabilité dans les mesures.

Préparer trois solutions composant de caféine, benzoate et l’aspartame, qui comporte trois volets typiques des boissons gazeuses diète. Ces solutions de composant sont ensuite utilisées pour préparer les solutions qui seront utilisées pour déterminer les inconnues. Préparer 500 mL des caféine et du benzoate de solutions.

Préparation de 100 mL de la solution de composant de l’aspartame. Conserver la solution dans le réfrigérateur lorsque vous ne l’usage afin d’éviter la décomposition.

Ensuite, préparer 7 solutions étalons, chacun avec différentes concentrations de caféine, benzoate et l’aspartame. Ajouter la quantité appropriée de chaque composant dans une fiole jaugée et diluer à la marque 50 mL avec la phase mobile.

Les 3 premières solutions chaque contiennent un seul composant, afin de permettre l’identification des pics. Les 4 autres solutions contiennent une gamme de concentrations de tous les 3 composants, afin de corréler la hauteur du pic de concentration.

Versez chaque solution étalon dans un flacon étiqueté dans un rack d’échantillon. Magasin le panier de l’échantillon avec les échantillons et les solutions restantes dans le réfrigérateur.

Tout d’abord, mettre en place la phase mobile et les conteneurs à déchets. S’assurer que les canalisations sont introduites dans un conteneur à déchets et recyclent pas dans la phase mobile. Veiller à ce que la conduite d’aspiration de la phase mobile est alimentée dans le récipient de la phase mobile.

Vérifiez que le débit de la phase mobile est défini sur 0,5 mL/min. Ce débit permettra à tous les composants éluer à moins de 5 min, mais il est assez lent pour assurer la résolution des sommets individuels.

Ensuite, vérifiez les pressions minimales et maximales sur le système de livraison solvant. Ces paramètres arrête la pompe en cas de fuite ou de colmatage, respectivement.

Appuyez sur « zéro » sur le panneau avant de détecteurs, de mettre à l’essai à blanc. Rincer à l’eau désionisée, puis avec plusieurs volumes de 1 7 étalons de travail, une seringue de 100 μL. Puis remplissez la seringue avec cette solution. Commencer avec les 3 échantillons de composant unique afin d’identifier le pic de chaque composant.

Ensuite, manuellement, injecter la solution, en plaçant l’injecteur poignée en position de charge. Injecter lentement le 100 μL de solution via le port de la cloison.

Vérifiez que le programme de collecte de données est défini pour recueillir des données pour 300 s, ce qui permet de suffisamment de temps pour tous les 3 pics à éluer à travers le détecteur. Lorsque vous êtes prêt à commencer le procès, tourner la manivelle de l’injecteur à la position d’insertion, afin d’injecter l’échantillon dans la phase mobile. Immédiatement, cliquez sur « Commencer le procès » sur le programme de collecte de données. Lorsque l’analyse est terminée, répétez le processus pour chacune des solutions étalons 7. Pour chacune des 3 premières normes, seulement un des 3 sommets apparaît. Notez l’emplacement du pic, qui est utilisé pour identifier le composant.

Choisissez 3 régime échantillons de soude et leur permettre de s’asseoir dans des conteneurs ouverts toute la nuit pour enlever la carbonatation.

Après une nuit de dégazage, attirer environ 3 mL de chaque régime de soude dans une seringue en plastique. Ensuite, attachez une extrémité du filtre à la seringue et pousser la soude à travers le filtre dans un flacon en verre, afin d’éliminer les particules solides.

Diluer 2 mL de chaque échantillon avec 2 mL de la phase mobile pour diminuer la concentration de soude par moitié.

Attirer 100 μL de l’un des échantillons de soude dans une seringue et l’injectent dans la boucle d’échantillonnage. Exécuter l’essai avec des paramètres identiques aux solutions standards. Répétez pour chaque échantillon de soude.

Tout d’abord, établir une corrélation entre la surface des pics des échantillons standards à des concentrations connues. Pour ce faire, déterminer la surface des pics sur les chromatographes pour chaque échantillon standard à l’aide de la méthode triangulaire. Calculer les heures de pointe hauteur avec la largeur à la moitié de la hauteur et utiliser cette valeur comme la surface du pic.

À l’aide de l’aire des pics et des concentrations connues créer une courbe d’étalonnage pour chaque composant et définir les méthode des moindres carrés pour chaque courbe d’étalonnage.

Calculer la concentration de chaque composante dans les boissons gazeuses diète de la surface des pics. N’oubliez pas que le sodas ont été dilué par un facteur de 2 avant injection dans la CLHP. Selon ces résultats, calculer le mg de chaque composant dans une canette de 12 onces de soude.

Sans surprise, tous les 3 sodas testés contenaient à peu près la même quantité du conservateur benzoate. Toutefois, les produits Coke contient plus de caféine. Les valeurs calculées pour tous les composants en corrélation bien aux valeurs rapportées par les fabricants.

HPLC est un instrument très polyvalent, qui est utilisé dans une large gamme d’analyses.

HPLC est souvent utilisé pour purifier les molécules peptidiques. Dans cet exemple, peptide transmembranaire complexes ont été préparés et puis stabilisé par réticulation oxydante des protéines avec des ponts disulfures.

Les protéines sont ensuite dissous dans l’acide formique et purifiée en utilisant renversée phase HPLC. L’échantillon est ensuite éluée utilisant un gradient linéaire de deux solvants et la pureté confirmé avec la spectrométrie de masse.

HPLC permet également d’identifier des composés organiques synthétisés dans le laboratoire. Dans l’expérience de Miller-Urey, a étudié la synthèse abiotique des composés organiques sur la terre primordiale. Gaz primordiales, comme le méthane et d’ammoniac, ont été introduits dans une fiole contenant de l’eau, simulant des Océans au début. Décharge électrique a ensuite été appliqué, imitant la foudre sur la terre primordiale.

L’eau a été analysée puis à l’aide de HPLC couplée à la spectrométrie de masse et par rapport aux normes connues des acides aminés. 23 acides aminés ont été synthétisés et identifiés dans cette expérience.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à l’HPLC. Vous devez maintenant comprendre les rudiments de l’instrument en cours d’exécution et d’analyser les données résultantes.

Merci de regarder !

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