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Analytical Chemistry
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JoVE Science Education Analytical Chemistry
High-Performance Liquid Chromatography (HPLC)
  • 00:00Overview
  • 01:22Principles of HPLC
  • 05:05Preparation of the Mobile Phase
  • 06:08Preparation of Component and Standard Solutions
  • 07:25HPLC Setup
  • 09:25Diet Soda Samples
  • 10:16Results
  • 11:27Applications
  • 12:44Summary

La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP)

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Overview

Source : Dr Paul Bower – Purdue University

Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une méthode d’analyse importante couramment utilisée pour séparer et quantifier les composants d’échantillons liquides. Dans cette technique, une solution (première phase) est pompée à travers une colonne contenant un emballage de petites particules poreuses avec une deuxième phase liée à la surface. Les solubilités différentes les composants de l’échantillon dans les deux phases causent les composants pour vous déplacer dans la colonne avec des vitesses moyennes différentes, créant ainsi une séparation de ces composants. La solution de pompage est appelée la phase mobile, tandis que la phase de la colonne est appelée la phase stationnaire.

Il existe plusieurs modes de chromatographie en phase liquide, selon le type de phase stationnaire ou mobile utilisée. Cette expérience utilise la chromatographie en phase inversée, où la phase stationnaire est non polaire et la phase mobile est polaire. La phase stationnaire devant être utilisés est C18 liés à des particules de silice de 3 µm, tandis que la phase mobile est un tampon aqueux avec un modificateur organique polaire (acétonitrile) ajouté à varier sa force d’élution des groupes hydrocarbonés. Sous cette forme, la silice peut être utilisée pour les échantillons qui sont solubles dans l’eau, fournissant un vaste éventail d’applications. Dans cette expérience, les mélanges de trois éléments fréquemment trouvés dans le régime alimentaire des boissons non alcoolisées (caféine, benzoate et l’aspartame) sont séparés. Sept solutions préparées contenant des quantités connues de ces trois espèces sont utilisées et leur chromatogramme est ensuite enregistrés.

Principles

Pendant une expérience HPLC, une pompe à haute pression prend la phase mobile provenant d’un réservoir à travers un injecteur. Il traverse ensuite une colonne en phase inverse C18-emballés pour la séparation des composants. Enfin, la phase mobile se déplace dans une cellule du détecteur, où l’absorbance est mesurée à 220 nm et se termine dans une bouteille pour eaux usées. La quantité de temps qu’il faut pour un composant de voyager depuis le port de l’injecteur au niveau du détecteur est appelée temps de rétention.

Un chromatographe en phase liquide est utilisé dans cette expérience, où la séparation est effectuée sur une colonne en phase inverse. Les dimensions de la colonne sont de 3 mm (d.i.) x 100 mm et la silice d’emballage (granulométrie de 3 µm) est fonctionnalisée avec C18 octadécylsilane (ODS). Une valve de 6 ports rotatif injection Rheodyne sert à stocker au départ l’échantillon dans une petite boucle et introduit l’échantillon à la phase mobile à la rotation de la soupape.

La détection est par spectroscopie d’absorption à une longueur d’onde de 220 nm. Cette expérience peut être exécutée à 254 nm, si un détecteur n’est pas variable. Les données du détecteur dispose d’une sortie analogique de tension, qui est mesurée à l’aide d’un multimètre numérique (DMM), et lu par un ordinateur doté d’un programme d’acquisition de données. Le chromatogramme obtenu a une crête pour chaque composant dans l’échantillon. Pour cette expérience, les trois composantes éluer à 5 min.

Cette expérience utilise une seule phase mobile et la pompe, qu’on appelle une phase mobile isocratique. Pour les échantillons qui sont difficiles à séparer, une phase mobile dégradée peut être utilisée. C’est lors de la phase initiale du mobile est principalement un aqueux, et au fil du temps, une phase mobile deuxième organique est progressivement ajoutée à la phase mobile dans l’ensemble. Cette méthode déclenche la polarité de cette phase au fil du temps, ce qui diminue les temps de rétention des éléments et fonctionne de manière similaire à un gradient de température sur un chromatographe en phase gazeuse. Il y a certains cas où la colonne est chauffée (habituellement à 40 ° C), qui enlève toute rétention d’erreurs associé à un changement de la température ambiante.

En HPLC en phase inversée, la phase stationnaire de colonne d’emballage est généralement un C4, C8 ou C18 d’emballage. Les colonnes de C4 sont principalement des protéines de grands poids moléculaire, tandis que les colonnes C18 sont des peptides et des échantillons élémentaires de bas poids moléculaire.

Détection par spectroscopie d’absorption est très majoritairement la méthode de détection de choix, comme les spectres d’absorption des composants sont tous facilement accessibles. Certains systèmes utilisent des mesures électrochimiques, telles que la conductivité ou ampérométrie, tant que leur méthode de détection.

Pour cette expérience, la phase mobile est principalement de 20 % d’acétonitrile et 80 % purifié l’eau désionisée (DI). Une petite quantité d’acide acétique est ajoutée pour baisser le pH de la phase mobile, ce qui maintient le silanol dans la phase stationnaire d’emballage dans un État non dissocié. Cela réduit le pic de l’adsorption de résidus, donnant des pics plus étroits. Ensuite, le pH est ajusté avec 40 % d’hydroxyde de sodium pour augmenter le pH et aider à diminuer les temps de rétention des éléments.

Chaque groupe utilise un jeu des 7 flacons contenant différentes concentrations des solutions étalons (tableau 1). Les 3 premiers sont utilisés pour identifier chaque pic, et les 4 derniers sont pour la création d’un graphique d’étalonnage pour chaque composant. Normes 1-3 sont également utilisés pour le tableau de calibrage.

Nombre Caféine (mL) Benzoate de (mL) Aspartame (mL)
1 4 0 0
2 0 4 0
3 0 0 4
4 1 1 1
5 2 2 2
6 3 3 3
7 5 5 5

Le tableau 1. Volumes des étalons utilisés pour préparer les 7 étalons de travail fourni (volume total de chaque norme est de 50 mL).

Procedure

1. rendre la Phase Mobile Préparer la phase mobile en ajoutant 400 mL d’acétonitrile à environ 1,5 L d’eau purifiée de DI. Ajouter avec précaution 2,4 mL d’acide acétique glacial à cette solution. Diluer la solution d’un volume total de 2.0 L dans une fiole jaugée avec de l’eau purifiée DI. La solution obtenue doit avoir un pH entre 2,8 à 3,2. Ajuster le pH à 4,2 en ajoutant 40 % d’hydroxyde de sodium, titration à l’aide d’un pH-mètre numérique calibré. Ajouter très lentement lorsque le pH atteint 4.0. Cela devrait prendre environ 50 gouttes d’accomplir. Filtrer la phase mobile à travers un filtre de membrane de Nylon 66 0,47 µm sous vide pour dégazer la solution et pour éliminer les solides qui pouvaient brancher la colonne chromatographique. Il est important de dégazer la phase mobile pour éviter d’avoir une bulle, ce qui pourrait provoquer un vide dans la phase stationnaire à l’entrée de la colonne ou faire son chemin dans la cellule du détecteur, causant l’instabilité avec l’absorbance UV. 2. créer les Solutions composant Les trois composantes qui doivent être apportées sont la caféine (0,8 mg/mL), benzoate de potassium (1,4 mg/mL) et l’aspartame (ester méthylique de L-aspartyl-L-phénylalanine) (6,0 mg/mL). Ces concentrations, une fois diluées de la même façon, mettent les normes aux niveaux trouvés dans les échantillons de soude. Ajouter 0,40 g de caféine dans une fiole jaugée de 500 mL, puis diluer à la marque 500 mL avec de l’eau distillée. Ajoutez 0,70 g de benzoate dans une fiole jaugée de 500 mL, puis diluer à la marque 500 mL avec de l’eau distillée. Ajouter 0,60 g d’aspartame dans une fiole jaugée de 100 mL, puis diluer à la marque de 100 mL avec l’eau distillée. Place cette solution dans un réfrigérateur pour éviter la décomposition pendant l’entreposage. 3. rendre les Solutions Standard 7 Tous les trois composantes ont des coefficients de distribution différents, qui influe sur la manière dont chacun interagit avec tous les deux des phases. Plus le coefficient de distribution, le temps plus que le composant passe dans la phase stationnaire, ce qui entraîne une rétention plus longue fois pour atteindre le détecteur. Suivant le tableau dans le tableau 1, pipette une quantité suffisante de chaque composant dans une fiole jaugée de 50 mL. Diluer chaque solution stock à la marque 50 mL sur les fioles jaugées avec la phase mobile. Versez chaque solution étalon dans étiquetées petites fioles dans un rack d’échantillon. Rangez les grilles des échantillons dans un réfrigérateur, ainsi que les autres solutions dans les fioles jaugées de 50 mL. 4. vérifier les paramètres initiaux du système HPLC Confirmer que la conduite d’écoulement est dans un conteneur à déchets et n’est pas recyclage dans la phase mobile. Vérifiez que le débit de la phase mobile est défini sur 0,5 mL/min. C’est suffisamment élevé pour permettre tous les pics à éluer à moins de 5 min et ralentir suffisamment pour permettre une résolution agréable. Vérifier que la pression minimale et maximale et la vitesse d’écoulement sont définies pour les valeurs correctes sur le panneau avant du système solvant (la pompe). Réglage de la pression minimale : 250 lb/po2 (c’est à l’arrêt de la pompe, si une fuite se produit). Réglage de la pression maximale : 4 000 lb/po2 (c’est pour protéger la pompe contre la rupture, si une forme de sabot). Appuyez sur « zéro » sur la façade du détecteur afin de mettre à l’essai à blanc (le blanc est la phase mobile pure). Rincez une seringue de 100 µL d’eau déionisée, puis avec plusieurs volumes d’un étalons de travail pour être analysés et remplissez la seringue avec cette solution. Commencez avec les 3 échantillons mono-composant, qui permet d’identifier le pic de chaque composant d’intérêt. 5. manuellement par injection de l’échantillon et la collecte de données Avec le stylo injecteur dans la position de chargement, injecter lentement 100 µL de solution via le port de la cloison. Vérifiez que le programme de collecte de données est défini pour recueillir des données pour 300 s, ce qui permet de suffisamment de temps pour tous les 3 pics à éluer à travers le détecteur. Lorsque vous êtes prêt à commencer le procès, tourner la manivelle d’injecteur au poste inject (qui injecte l’échantillon dans la phase mobile) et cliquez sur « Commencer le procès » sur le programme de collecte de données ordinateur immédiatement. Pour les normes 1-3, seul les trois pics séquentielles apparaissent sur l’écran pendant la course (Figure 1). Une fois 300 s ont passé, la collecte de données envoie une invite à enregistrer le fichier de données. Enregistrer les données sous un nom de fichier approprié (par exemple, STD #1). Remarque la durée en secondes pour le sommet de chaque essai, qui est utilisé pour identifier ce composant. Retirer la seringue de la cloison et répétez le processus pour toutes les normes de travail restant, en utilisant le même temps par le chromatogramme comme déterminé à partir de la première manche. Figure 1. Le chromatogramme des 3 composants. De gauche à droite, ils sont la caféine, l’aspartame et le benzoate. 6. les échantillons de boissons gazeuses diète Diet Coke et Pepsi diète Coke Zero sont les « inconnues ». Ils ont été laissés dans des conteneurs ouverts toute la nuit pour se débarrasser de la carbonatation, comme les bulles ne sont pas bonnes pour le système de CLHP. Suffisamment, il se débarrasse de tout le gaz dans les échantillons. Attirer environ 2 mL de soda de la diète dans une seringue en plastique. Fixez l’extrémité du filtre à la seringue par l’intermédiaire de Luer-Lok en le tournant en place. Pousser le liquide dans la seringue à travers le filtre et dans un flacon de verre. Il se débarrasse des particules indésirables qui pourraient potentiellement bloquer la colonne de séparation. Diluer chaque échantillon avec une quantité égale de l’eau distillée, afin qu’ils soient à 50 % de pureté. Injecter 100 µL de l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage et exécuter des essais avec les mêmes paramètres que pour les standards. 7. les calculs D’après les concentrations des solutions composant, calculer la concentration de tous les composants dans les normes, basés sur les dilutions qui ont été faites pour les 7 échantillons. Déterminer des pics sur les chromatogrammes pour chaque étalon et les échantillons inconnus par la méthode triangulaire, ce qui équivaut à périodes de hauteur, la largeur à ½ hauteur (Figure 2). Après avoir déterminé quel pic correspond à chaque composant basé sur le temps que nécessaire pour chaque composant montrer leur apogée respectif, entrer dans ces domaines de pointe dans un tableur informatique. Créer des courbes d’étalonnage de la surface du pic vs concentration (mg/L) dans les normes pour chacune des trois composantes. Définir les méthode des moindres carrés pour chaque courbe d’étalonnage. Calculer la concentration de chaque composante dans les boissons gazeuses diète de la montré dans les essais de la CLHP pour les échantillons de surface des pics. N’oubliez pas que le soda diète a été dilué par un facteur de 2 avant l’injection dans le système de CLHP. Calculer la quantité, en mg/L, de chaque composante dans les boissons gazeuses diète. Selon les résultats, calculer la milligrammes de chaque composant dans une canette de 12 onces de soude. Supposons que 12 oz = 354,9 mL. La figure 2. Un exemple de base d’une courbe hauteur et largeur, qui doivent être multipliés (hauteur du pic fois largeur à ½ de la hauteur).

Results

The HPLC chromatograms are able to quantify each of the 3 components for all the samples based upon the calibration curves of the standards (Figure 3).

From this set of experiments, it was determined that a 12-oz can of these diet sodas contained the following amounts of each component:

Diet Coke: 50.5 mg caffeine; 217.6 mg aspartame; 83.6 mg benzoate.
Coke Zero: 43.1 mg caffeine; 124.9 mg aspartame; 85.3 mg benzoate.
Diet Pepsi: 34.1 mg caffeine; 184.7 mg aspartame; 79.5 mg benzoate.

Not surprisingly, all 3 had roughly the same amount of benzoate, as it is just a preservative. The Coke products had a bit more caffeine, and the Coke Zero had much less aspartame than the other two sodas, as it also includes citric acid for some flavoring.

The following numbers are the actual amounts of caffeine and aspartame in a 12-oz can of the 3 diet sodas (The caffeine content was obtained from the Coca-Cola and Pepsi websites. The aspartame content was obtained from both LiveStrong.com and DiabetesSelfManagement.com.):

Diet Coke: 46 mg caffeine; 187.5 mg aspartame
Coke Zero: 34 mg caffeine; 87.0 mg aspartame
Diet Pepsi: 35 mg caffeine; 177.0 mg aspartame

Sample Calculations (Table 2):

Concentration of caffeine in STD#1: The component solution for caffeine had 0.400 g of caffeine diluted to 500 mL = 0.500 L → 0.800 g/L = 0.800 mg/mL.

STD#1 had 1 mL of this solution diluted to 50.0 mL
0.800 mg/mL * (1.0 mL / 50.0 mL) = 0.016 mg/mL = 16.0 mg/L.

STD#2 had 2 mL of this solution diluted to 50.0 mL
0.800 mg/mL * (2.0 mL / 50.0 mL) = 0.032 mg/mL = 32.0 mg/L.

The results from the three calibration graphs (Figure 4) yielded the following equations:

Caffeine Peak Area = 0.1583*[Caffeine mg/L] – 0.574
Aspartame Peak Area = 0.02696*[Aspartame mg/L] – 0.405
Benzoate Peak Area = 0.1363*[Benzoate mg/L] – 1.192

Diet Coke: Caffeine Peak Area = 10.68 = 0.1583*[Caffeine mg/L] – 0.574

[Caffeine mg/L] = (10.68 + 0.574)/ (0.1583) = 71.1 mg/L in the injected sample.

Since the sample was diluted by a factor of 2, the Diet Coke had 141.2 mg/L caffeine.

The amount per 12-oz can = (141.2 mg/L)(0.3549 mL/12-oz can) = 50.5 mg caffeine/can.

Figure 3
Figure 3. The HPLC chromatograms of the 5 standards and the 3 samples.

Figure 4
Figure 4. The calibration curves for each of the 3 components.

Table 2
Table 2. The data tables for the HPLC trials used for generating the calibration curves.

Applications and Summary

HPLC is a widely-used technique in the separation and detection for many applications. It is ideal for non-volatile compounds, as gas chromatography (GC) requires that the samples are in their gas phase. Non-volatile compounds include sugars, vitamins, drugs, and metabolites. Also, it is non-destructive, which allows each component to be collected for further analysis (such as mass spectrometry). The mobile phases are practically unlimited, which allows changes to the polarity of pH to achieve better resolution. The use of gradient mobile phases allows for these changes during the actual trials.

There has been concern over the possible health issues that may be associated with the artificial sweetener aspartame. Current product labeling does not show the amount of these components inside of the diet beverages. This method allows for quantifying these amounts, along with the caffeine and benzoate.

Other applications include determining the amounts of pesticides in water; determining the amount of acetaminophen or ibuprofen in pain reliever tablets; determining whether there are performance-enhancing drugs present in the bloodstream of athletes; or simply determining the presence of drugs in a crime lab. While the concentrations of these samples, and often the identity of the components, can be readily determined, the one limitation is that several samples could have close to identical retention times, resulting in co-eluting.

Transcript

High-performance liquid chromatography, or HPLC, is a highly versatile technique that separates components of a liquid mixture based on their different interactions with a stationary phase.

HPLC is an adaptation of column chromatography. In column chromatography, a column is packed with micro-scale beads called the stationary phase. The stationary phase beads are functionalized with chemical groups that induce an interaction between the bead and the components of a mixture located in the liquid, or mobile phase. As the mixture flows through the column, the components interact with the stationary phase differently.

In HPLC, column chromatography is performed at a higher flow rate, and therefore higher pressure, than classical column chromatography. This enables the use of smaller stationary phase beads with a greater surface area to volume ratio, which greatly increases the interaction of the stationary phase and components in the mobile phase.

This video will introduce the basics of the operation of HPLC by demonstrating the separation of components of various diet sodas.

There are two types of HPLC used in the laboratory: analytical, and preparative. In analytical HPLC, the instrument is used to identify components of a small volume, and the analyzed sample is then discarded as waste. In preparative HPLC, the instrument is used to purify a mixture and a desired amount of each component is collected in fractions.

The HPLC instrumentation consists of a series of simple components. First, the mobile phase, held in solvent reservoirs, is pumped through the system by one or more pumps at a constant flow rate. The sample is injected into the mobile phase stream by the sample injector. The sample, diluted by the mobile phase, is then delivered to the HPLC column, where the components of the sample are separated. The components are then analyzed by the detector, and either saved in fractions for later use, or transferred to a waste bottle.

The HPLC column is the key component to the system. It is composed of a metal or plastic cylinder, packed with micro-scale beads of stationary phase, or chromatography resin. The sample mixture flows through the packed particle bed at a constant flow rate and each component interacts with the stationary phase as it flows by.

The compounds interact with the stationary phase differently, and therefore travels down the length of the column to the detector at a different rate. The time required for a component to exit the column, or elute, is called the retention time. The result is a plot of retention time vs. intensity, or a chromatogram. The retention time is used to identify the component. The peak size, specifically the area under the peak, is used to quantify the amount of the compound in the initial solution.

The choice of stationary phase depends on the properties of the components in the sample mixture. The most commonly used stationary phase is silica beads, as they are an inert nonpolar material that forms micro-scale beads, and achieves sufficient packing density. The most common type of HPLC is reversed-phase chromatography, which utilizes a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the beads’ surface. The components are eluted in order of decreasing polarity.

The mobile phase used in reversed-phase chromatography is typically a mixture of water and an organic solvent, such as acetonitrile. Depending on the sample, the mobile phase can remain a constant ratio of water and organic solvent, known as isocratic mode. However, this can lead to broad peaks, in the case of high water content, or overlapping peaks—in the case of high organic content.

The mobile phase ratio can also be changed linearly or stepwise during the separation, to create a mobile phase gradient. A gradient elution can prevent peak broadening of the less polar components, thereby improving the separation and shortening the elution time.

Now that the basics of HPLC have been outlined, the HPLC technique will be demonstrated in the laboratory. In this experiment, HPLC will be used to separate and quantify three common components of diet soda.

First, to prepare the mobile phase, add 400 mL of acetonitrile to 1.5 L of purified deionized water. Then carefully add 2.4 mL of glacial acetic acid. Dilute the solution to a total volume of 2 L. The resulting solution should have a pH between 2.8 and 3.2.

Adjust the pH to 4.2 by adding 40% NaOH, drop-wise to the stirring solution, with the use of a calibrated pH meter.

Filter the mobile phase through a 0.47-μm membrane filter under vacuum to degas the solution and remove solids that could plug the column. It is important to degas the solution, as bubbles can cause voids in the stationary phase, or work their way to the detector cell and cause instability in measurements.

Prepare three component solutions of caffeine, benzoate, and aspartame, which are three typical components of diet sodas. These component solutions are then used to prepare the standard solutions that will be utilized to determine the unknowns. Prepare 500 mL of the caffeine and benzoate solutions.

Prepare 100 mL of the aspartame component solution. Store the solution in the refrigerator when not in use to avoid decomposition.

Next, prepare 7 standard solutions, each with different concentrations of caffeine, benzoate, and aspartame. Pipet the proper amount of each component into a volumetric flask, and dilute to the 50-mL mark with mobile phase.

The first 3 solutions each contain one component, to enable peak identification. The other 4 solutions contain a range of concentrations of all 3 components, in order to correlate peak height to concentration.

Pour each standard solution into a labeled vial in a sample rack. Store the sample rack with samples and the remaining solutions in the refrigerator.

First, set up the mobile phase and waste containers. Ensure that the waste lines are fed into a waste container, and are not recycling back into the mobile phase. Ensure that the inlet mobile phase line is fed into the mobile phase container.

Verify that the flow rate of the mobile phase is set to 0.5 mL/min. This flow rate will enable all components to elute within 5 min, but is slow enough to ensure resolution of individual peaks.

Next, verify the minimum and maximum pressures on the solvent delivery system. These settings shut the pump off in case of a leak or clog, respectively.

Press “zero” on the detectors front panel, to set the blank. Rinse a 100-μL syringe with deionized water, then with several volumes of 1 of the 7 working standards. Then fill the syringe with that solution. Begin with the 3 single-component samples in order to identify the peak of each component.

Next, manually inject the solution, by placing the injector handle in the load position. Slowly inject the 100 μL of solution through the septum port.

Verify that the data collection program is set to collect data for 300 s, which allows for enough time for all 3 peaks to elute through the detector. When ready to begin the trial, rotate the injector handle to the inject position, in order to inject the sample into the mobile phase. Immediately, click “Start Trial” on the data collection program. When the scan is complete, repeat the process for each of the 7 standard solutions. For each of the first 3 standards, only one of the 3 peaks appears. Note the location of the peak, which is used to identify the component.

Select 3 diet soda samples, and allow them to sit out in open containers overnight to remove the carbonation.

After overnight degassing, draw approximately 3 mL of each diet soda into a plastic syringe. Next, attach a filter tip to the syringe and push the soda through the filter into a glass vial, in order to remove any solid particulates.

Dilute 2 mL of each sample with 2 mL of the mobile phase to decrease the soda concentration by half.

Draw 100 μL of one of the soda samples into a syringe, and inject it into the sample loop. Run the trial with identical parameters to the standard solutions. Repeat for each soda sample.

First, correlate the peak areas of the standard samples to the known concentrations. To do so, determine the peak areas on the chromatographs for each standard sample using the triangular method. Calculate the peak height times with the width at half of the height, and use this value as the peak area.

Using the peak area and known concentrations create a calibration curve for each component, and determine the least-squares fit for each calibration curve.

Calculate the concentration of each component in the diet sodas from the peak areas. Remember that the sodas were all diluted by a factor of 2 prior to injection into the HPLC. Based on these results, calculate the mg of each component in a 12-oz can of soda.

Unsurprisingly, all 3 sodas tested contained roughly the same amount of the preservative benzoate. However, the Coke products contained more caffeine. The calculated values for all components correlated well to reported values by the manufacturers.

HPLC is a highly versatile instrument, which is used in a wide range of analyses.

HPLC is often used to purify peptide molecules. In this example, transmembrane peptide complexes were prepared, and then stabilized by oxidative crosslinking the proteins with disulfide bonds.

The proteins were then dissolved in formic acid, and purified using reversed phase HPLC. The sample was then eluted using a linear gradient of two solvents, and the purity confirmed with mass spectrometry.

HPLC can also be used to identify organic compounds synthesized in the lab. In the Miller-Urey experiment, the abiotic synthesis of organic compounds on primordial earth was studied. Primordial gases, such as methane and ammonia, were introduced to a flask containing water, simulating early oceans. Electrical discharge was then applied, imitating lightning on primordial earth.

The water was then analyzed using HPLC coupled with mass spectrometry, and compared to known amino acid standards. 23 amino acids were synthesized and identified in this experiment.

You’ve just watched JoVE’s introduction to HPLC. You should now understand the basics of running the instrument, and analyzing the resultant data.

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JoVE Science Education Database. JoVE Science Education. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). JoVE, Cambridge, MA, (2023).