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Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
 

Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)

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Cromatografía líquida de alta performance HPLC, es una técnica muy versátil que separa los componentes de una mezcla líquida basado en sus diversas interacciones con una fase estacionaria.

HPLC es una adaptación de la cromatografía de columna. En cromatografía de columna, una columna está llena de granos micro escala llamados la fase estacionaria. Los granos de la fase estacionaria son funcionalizados con grupos químicos que inducen a una interacción entre el talón y los componentes de una mezcla que se encuentra en la fase líquida, o móvil. Como la mezcla fluye a través de la columna, los componentes interactúan con la fase estacionaria diferente.

En HPLC, cromatografía de columna se realiza en un flujo de mayor velocidad y por lo tanto, mayor presión, que la cromatografía de columna clásica. Esto permite el uso de granos más pequeños de la fase estacionaria con un mayor área superficial al cociente del volumen, que aumenta en gran medida la interacción de los componentes y la fase estacionaria en la fase móvil.

Este video presenta los fundamentos de la operación de HPLC demostrando la separación de componentes de varios refrescos de dieta.

Hay dos tipos de HPLC utilizada en el laboratorio: analítica y preparativa. En HPLC analítico, el instrumento se utiliza para identificar los componentes de un pequeño volumen, y la muestra analizada es entonces descartada como basura. En HPLC preparativa, el instrumento se utiliza para purificar una mezcla y una cantidad deseada de cada componente se recoge en fracciones.

La instrumentación HPLC consiste en una serie de componentes simples. En primer lugar, la fase móvil, llevó a cabo en depósitos de disolvente, es bombeada a través del sistema por una o más bombas con un caudal constante. La muestra se inyecta en la corriente de fase móvil por el inyector de la muestra. La muestra, diluida por la fase móvil, se entrega entonces a la columna HPLC, donde se separan los componentes de la muestra. Los componentes son luego analizados por el detector y guardado en fracciones para su uso posterior, o transferido a una botella de residuos.

La columna HPLC es el componente clave del sistema. Se compone de un cilindro de metal o plástico, repleto de micro escala granos de fase estacionaria, o resina de cromatografía. La mezcla de la muestra fluye a través de la cama lleno de partículas a una velocidad de flujo constante y cada componente interactúa con la fase estacionaria como fluye por.

Los compuestos interactúan con la fase estacionaria diferente y por lo tanto viaja a lo largo de la columna al detector a una velocidad diferente. El tiempo requerido para que un componente salir de la columna, o procederá a la elución, se llama el tiempo de retención. El resultado es un diagrama de tiempo de retención vs intensidad o un cromatograma. El tiempo de retención se utiliza para identificar el componente. El tamaño del pico, específicamente el área bajo el pico, se utiliza para cuantificar la cantidad del compuesto en la solución inicial.

La elección de la fase estacionaria depende de las propiedades de los componentes de la mezcla de muestra. La fase estacionaria más utilizada es granos de sílice, ya que son un material inerte no polar que forma granos de micro escala y alcanza la densidad suficiente. El tipo más común de HPLC es la cromatografía de fase inversa, que utiliza una fase estacionaria hidrofóbica, típicamente granos de sílice con C18 cadenas adheridos a la superficie de los granos. Se eluyen los componentes en orden decreciente de polaridad.

La fase móvil en cromatografía de fase inversa es típicamente una mezcla de agua y un disolvente orgánico, como el acetonitrilo. Dependiendo de la muestra, la fase móvil puede seguir siendo una proporción constante de agua y solvente orgánico, conocido como modo isocrática. Sin embargo, esto puede conducir a grandes picos, en el caso de alto contenido, de agua o picos superpuestos, en el caso de alto contenido orgánico.

La relación de la fase móvil puede también cambiar linealmente o paso a paso durante la separación, para crear un gradiente de fase móvil. Una elución gradiente puede prevenir la máxima ampliación de los componentes menos polares, mejorando así la separación y acortando el tiempo de elución.

Ahora que han sido subrayados los fundamentos del HPLC, la técnica HPLC se demostrará en el laboratorio. En este experimento, se utilizará HPLC para separar y cuantificar tres componentes comunes de refresco de dieta.

En primer lugar, para preparar la fase móvil, añadir 400 mL de acetonitrilo a 1,5 L de agua purificada desionizada. Luego agregue cuidadosamente 2,4 mL de ácido acético glacial. Diluir la solución hasta un volumen total de 2 L. La solución resultante debe tener un pH entre 2.8 y 3.2.

Ajustar el pH a 4.2 agregando 40% NaOH, mediante goteo a la solución de agitación, con el uso de un medidor de pH calibrado.

Filtrar la fase móvil a través de un filtro de membrana de 0.47 μm bajo vacío para desgasificar la solución y eliminar sólidos que podrían conectar la columna. Es importante desgasificar la solución, como las burbujas pueden causar vacíos en la fase estacionaria, o trabajar su camino a la celda del detector y causar inestabilidad en las mediciones.

Preparar tres soluciones de componente de cafeína, benzoato y aspartame, que son tres componentes típico de sodas de dieta. Estas soluciones de componente entonces se utilizan para preparar las soluciones estándar que se utilizará para determinar a las incógnitas. Preparar 500 mL de las soluciones de cafeína y benzoato.

Preparar 100 mL de la solución de componente del aspartame. Almacene la solución en el refrigerador cuando no esté en uso para evitar la descomposición.

A continuación, preparar soluciones estándar 7, cada uno con diferentes concentraciones de aspartamo, cafeína y benzoato. Pipetear la cantidad adecuada de cada componente en un matraz aforado y diluir hasta la marca de 50 mL con fase móvil.

Las 3 primeras soluciones contienen un componente, para permitir la identificación del pico. Las otras 4 soluciones contienen una gama de concentraciones de todos los 3 componentes, con el fin de correlacionar la altura del pico de concentración.

Vierta cada solución en un frasco rotulado en una gradilla de muestras. Guardar la gradilla de muestras con las muestras y las soluciones restantes en la nevera.

En primer lugar, definir la fase móvil y contenedores de residuos. Asegúrese de que las líneas de residuos se introducen en un contenedor de residuos y no se recicla en la fase móvil. Asegúrese de que la línea de fase móvil de entrada se introduce en el envase de la fase móvil.

Verificar que el caudal de la fase móvil se establece en 0, 5 mL/min. Este caudal de permitirá a todos los componentes a fin de eluir dentro de 5 minutos, pero es lento para asegurar la resolución de los picos individuales.

A continuación, compruebe las presiones máximas y mínimas en el sistema de solvente. Estos ajustes apagan la bomba en caso de fugas u obstrucción, respectivamente.

Pulsa el "cero" en el panel frontal de detectores, para definir el espacio en blanco. Enjuague una jeringa de 100 μL de agua desionizada, luego con varios volúmenes de 1 de los 7 estándares de trabajo. Luego llene la jeringa con la solución. Comenzar con las muestras del solo-componente 3 para identificar el pico de cada componente.

A continuación, manualmente inyectar la solución, colocando el inyector de la manija en la posición de carga. Lentamente inyectar 100 μL de solución a través del puerto de tabique.

Verificar que el programa de recolección de datos está configurado para recopilar datos para 300 s, que permite suficiente tiempo para que todos los 3 picos a fin de eluir a través del detector. Cuando esté listo para comenzar el juicio, gire la manija del inyector a la posición de inyectar, para inyectar la muestra en fase móvil. Inmediatamente, haga clic en "Iniciar prueba" en el programa de recolección de datos. Cuando la exploración haya terminado, repita el proceso para cada una de las soluciones estándar 7. Cada una de las primeras 3 normas, sólo uno de los 3 picos aparece. Tenga en cuenta la ubicación del pico, que se utiliza para identificar el componente.

3 seleccionar muestras de soda de la dieta y que puedan sentarse en contenedores abiertos durante la noche para quitar la carbonatación.

Después de la desgasificación, dibujar aproximadamente 3 mL de cada soda de dieta en una jeringa de plástico. A continuación, coloque un filtro a la jeringa y empuje la soda a través del filtro en un frasco de vidrio, con el fin de eliminar cualquier partículas sólidas.

Diluir 2 mL de cada muestra con 2 mL de la fase móvil para disminuir la concentración de sodio a la mitad.

Dibujar 100 μL de una de las muestras de soda en una jeringa e inyecte en el bucle de muestra. Ejecutar la prueba con idénticos parámetros a las soluciones estándar. Repetir para cada muestra de soda.

En primer lugar, relacionar las áreas del pico de las muestras estándar a concentraciones conocidas. Para ello, determinar las áreas de pico en los Cromatógrafos para cada muestra estándar usando el método triangular. Calcular los tiempos de máxima altura con el ancho de la mitad de la altura y utilizar este valor como el área de pico.

Utilizando el área de pico y concentraciones conocidas de crear una curva de calibración para cada componente y determinar que los mínimos de la cuadrados aptos para cada curva de calibración.

Calcular la concentración de cada componente en los refrescos de dieta de las áreas de pico. Recuerde que los refrescos se diluyeron por un factor de 2 antes de la inyección en el HPLC. Basado en estos resultados, calcular lo mg de cada componente en una lata de 12 onzas de soda.

Como era de esperar, todos los 3 refrescos probados contienen aproximadamente la misma cantidad del conservante benzoato. Sin embargo, los productos de Coca Cola contienen más cafeína. Los valores calculados para todos los componentes correlacionan bien a valores reportados por los fabricantes.

HPLC es un instrumento muy versátil, que se utiliza en una amplia gama de análisis.

HPLC se utiliza a menudo para purificar moléculas peptídicas. En este ejemplo, complejos péptido transmembrana se prepararon y luego estabilizaron por reticulación oxidativo las proteínas con enlaces disulfuro.

Las proteínas entonces se disolvieron en ácido fórmico y purificado usando invertido fase HPLC. La muestra se eluyó entonces usando un degradado lineal de dos disolventes, y la pureza confirmó con espectrometría de masas.

HPLC puede utilizarse también para identificar compuestos orgánicos sintetizados en el laboratorio. En el experimento de Miller-Urey, se estudió la síntesis abiótica de compuestos orgánicos en la tierra primordial. Gases primordiales, tales como metano y amoníaco, se introdujeron a un matraz que contenga agua, simulando los primeros océanos. Descarga eléctrica se aplicó entonces, imitar el rayo en la tierra primordial.

El agua entonces se analizó mediante HPLC acoplada con espectrometría de masas y en comparación con estándares conocidos aminoácidos. 23 aminoácidos fueron sintetizados e identificadas en este experimento.

Sólo ha visto introducción de Zeus para HPLC. Ahora debe comprender los conceptos básicos de la ejecución del instrumento y análisis de los datos resultantes.

¡Gracias por ver!

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