Overview
מקור: המעבדה של ג'ף סלקופ - אוניברסיטת מסצ'וסטס אמהרסט
המוצר של מיצוי ממס אורגני, תמצית שומנים מוחלטת (TLE), הוא לעתים קרובות תערובת מורכבת של מאות, אם לא אלפים, של תרכובות שונות. החוקר מעוניין לעתים קרובות רק קומץ של תרכובות או, אם מעוניין רבים, ייתכן שיהיה צורך להסיר מרכיבים לא רצויים כי הם "בדרך" או שיתוף פעולה. לדוגמה, הריכוזים של תרכובות בודדות במדגם נקבעים לעתים קרובות על כרומטוגרפיה גז בשילוב גלאי מייננות להבה (GC-FID), כי הקשר בין תגובת FID (ב- pA) לבין כמות המתחם במדגם (למשל,ng / μL) הוא ליניארי ורגיש. החלק GC של המכשיר מפריד תרכובות שונות במדגם המבוסס על נקודת הרתיחה שלהם, מבנה כימי, זיקה עם שלב מוצק שיכול להשתנות בהתאם ליישום. התוצאה היא כרומטוגרמה(Figure 1), המציגה את ההפרדה בין מרכיבים כימיים שונים בזמן, כמו גם את הריכוז היחסי שלהם (המחושב כאזור שמתחת לעקומה). עם זאת, לפעמים יותר ממתחם אחד חומק את GC בכל פעם(תאנהure 1). במקרה זה, טיהור מדגם נדרש לפני תרכובות ניתן לכמת בביטחון.
איור 1. כרומטוגרמה המציגה את ההפרדה בין מרכיבים כימיים שונים לאורך זמן ואת הריכוז היחסי שלהם (שטח מתחת לעקומה). פסגות דו-שלות ומופרדות מוצגות.
Principles
FAMEs (אסטרים מתיל חומצת שומן) הם מרכיבים חשובים של חיידקים יבשתיים וימיים משמשים לעתים קרובות, בשילוב עם טכניקות גנטיות, כדי לתאר מגוון מיקרוביאלי מערכת אקולוגית במערכות מודרניות ועתיקות. עם זאת, נוכחות של FAMEs במדגם לא תמיד מועיל. בשל גודלם והכימיה הדומים, משפחות FAMEs נקראו אלקנונטים בשיתוף פעולה עם אלקיל קטונים ארוכי שרשרת, הנקראים אלקנונים(איור 2). התפלגות האלקנונים במדגם מתייחסת למידע על טמפרטורת פני הים באותה עת ו/או על המקום בו נלקחה המדגם, ולכן אפיונם המדויק והמדויק חשוב.
Saponification היא טכניקת טיהור נפוצה המשמשת להמרת FAMEs לחומצות שומן, ובכך לשנות את המאפיינים הכימיים שלהם מספיק כדי להסיר אותם מן האלקוטיה המשותפת עם אלקנונים (איור 3). סאפוניפיקציה היא סוג של הידרוליזה. בהידרוליזה, מים משמשים לפיצול מולקולות. סאפוניפיקציה היא הידרוליזה המואצת בנוכחות בסיס, כגון אשלגן הידרוקסיד (KOH). KOH מתמוסס לתוך K+ ו- OH- במים. אניון הידרוקסיד (OH- ,יון טעון שלילית) מוסיף לאטום הפחמן השלישי הטעון מעט, חיובי בלב FAME(איור 3, למעלה). עם זאת, תצורה כימית זו אינה יציבה, (פחמן נקשר לאטומים רבים מדי אחרים) ואת alkoxide (ROH-) הוא גורש. אבל H של בסיס מצומד זה צורות גירוש במהירות עובר אל אלקסיד כדי ליצור את מתנול אלכוהול וחומצת שומן מלח אשלגן(איור 3,אמצע). בשלב זה, התהילה הפוגענית (alkenoate) הוסב כימי שכבר לא משתף פעולה עם זה. עם זאת, אם רוצים גם לנתח את הכימיה FAME, הם יכולים להיות reclaimed על ידי תוספת של חומצה (HCl) לפתרון, עד pH מגיע ~ 2. ב- pH זה, חומצת השומן מלח אשלגן מפוצלת כדי ליצור חומצה קרבוקסילית ומלח יוני (KCl; איור 3, למטה).
איור 2. המבנים הכימיים של אלקונון עם 37 אטומי פחמן ו -2 קשרים כפולים (למעלה) והתהילה האלקנואט הקשורה אליו (למטה).
איור 3. סכמטי של סאפוניפיקציה של חומצה פלמיטית באמצעות אשלגן הידרוקסיד (KOH) כדי להגדיל את שיעור ההידרוליזה (http://www.mpbio.com/).
Saponification היא טכניקה המשמשת בדרך כלל להסרת אסטרים מתיל חומצות שומן מתערובת אורגנית מורכבת.
דגימות אורגניות מורכבות מנותחות לעתים קרובות על ידי כרומטוגרפיה גז, אשר משמש כדי לקבוע את הריכוזים היחסיים של רכיבים בודדים.
עם זאת, תרכובות דומות בגודל ובמבנה לא ניתן להבחין על ידי המכשיר, מוטה את התוצאות. לכן, תרכובות לא רצויות המייצרות אותות חופפים יש להסיר על מנת לקבל תוצאות מדויקות.
וידאו זה מכסה את השימוש סאפוניפיקציה כדי לטהר אלקנונים עבור פליאוקלימטולוגיה. זהו הראשון בסדרה המפרטת את הטיהור של דגימות סמנים ביולוגיים מורכבות. זה יכסה את ההליך, כמו גם כמה שימושים אחרים של הטכניקה.
קטונים אלקיל קטונים ארוכי שרשרת רב בלתי רוויים, הנקראים אלקנונים, הוכחו כמספקים מידע שימושי על טמפרטורת פני הים בעבר.
עם זאת, האורגניזמים המייצרים אלקנונים לעתים קרובות ליצור חומצת שומן מתיל אסטרים דומים בגודל ומבנה כימי, הנקרא אלקנואטים. בגלל קווי דמיון אלה, יש להסיר אלקנואטים לפני שניתן יהיה להשיג ניתוח מדויק.
סאפוניפיקציה היא טכניקה נפוצה המשמשת למניעת שיתוף פעולה של מולקולות אלה. סאפוניפיקציה משתמשת במים כדי לפצל את הקשר המולקולרי של אסתר. בסיס מתחבר לפחמן בלב האלקנואט. תגובת תוספת זו יוצרת ביניים לא יציב, ואת אלקוקסיד מסולק.
המימן מהחומצה החדשה שנוצרה עובר לאלקוידיד שגורש, וכתוצאה מכך אניון קרבוקסילט יוצר קשר יוני עם הקיטון מהבסיס. התוצאה היא אלכוהול ומלח חומצת שומן. הוספת חומצה חזקה תיצור מחדש את החומצה קרבוקסילית. בשלב זה, האלקנואט הפוגע הומר לצורה שכבר לא משתף פעולה עם האלקונון של עניין.
עכשיו שאתה מבין איך saponification יכול לשמש כדי לטהר תערובת אורגנית, אתה מוכן להתחיל את ההליך.
ראשית, לרכוש תמצית שומנים סה"כ מיובש - או TLE - שהושג באמצעות שיטת מיצוי ממס. לאחר מכן, הכן את פתרונות הספוניפיקציה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. ודא כי כל הרכיבים טהורים וללא פחמימנים. לאחר הכנת הפתרונות, מוסיפים את ה- TLE היבש ל בקבוקון זכוכית בורוסיליקט 60 מ"ל. מוסיפים 2 מ"ל של 2 אשלגן הידרוקסידי רגיל, ולאטום את המשחקון. לאחר מכן, לחמם את הוויאל ל 60 °C (60 °F) במשך 2.5 שעות כדי לבקע את קשר אסתר. כאשר זה הושלם, לאפשר לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר המדגם התקרר, להוסיף 2 מ"ל של 5% פתרון נתרן כלורי למצחקינה. מכסים את הקטוריון ומנערים בקצרה. יש להוסיף 6 N חומצה הידרוכלורית טיפה חכמה עד להגעה ל-pH של 2 - באמצעות נייר pH לבדיקה. התוספת של חומצה זו תיצור את אניון קרבוקסילט כדי ליצור את המוצר הסופי - חומצה קרבוקסילית יציבה.
עכשיו, כשהפתרון החומצי נטול אסתר, הוסף 5 מ"ל של הקסאן. מכסים ומנערים במרץ במשך 5 שניות כדי לחלץ את התרכובות האורגניות מהמים. אפשר לפתרון לנוח עד שהשלבים האורגניים והמ מימיים ייפרדו לחלוטין. מלחים, יונים וחומצה הידרוכלורית לא מתויקת יישארו בשלב מימי, בעוד תרכובות אורגניות ייפרדו לתוך ההקסאן. לאחר השלבים נפרדו לחלוטין, להסיר כ 75% של הקסאן באמצעות pipette, ולחלק לתוך עוד 40 מ"ל בוחן. חזור על תהליך החילוץ הזה פעמיים נוספות, הוספת 5 מ"ל של הקסאן בכל פעם. לאחר השלמת זה, להשליך את הפתרון מימי שנותר לתוך מיכל פסולת תקין. יש לסמן את הנקניקיון המכיל את השלב האורגני הטרי. חומצות קרבוקסיליות המיוצרות לא ניתן להזריק לתוך המכשירים הנפוצים לניתוח אלקנון ללא טיהור נוסף. חומצות קרבוקסיליות המוזרקות לכרומטוגרפיה גז מצטברות במהירות ומחורבות פתחים, תוחמי כניסה והקצה הקדמי של העמודים. כדי להסיר חומצות אלה, המדגם צריך תחילה לעבור טכניקת טיהור נוספת: הפרדה באמצעות כרומטוגרפיה עמודה.
סאפוניפיקציה יש מספר יישומים בהפקה וטיהור של מולקולות אורגניות.
Saponification יכול לשמש לא רק כדי להפריד סמנים ביולוגיים, אלא גם כדי לחלץ רכיבים בודדים לשימוש במוצרים מסחריים. בדוגמה זו, תרכובות מעץ הטבק - ניקוטיאנה גלאוקה - בודדו ונותחו כדי לחקור את הפוטנציאל שלהם כמזון למגוון רחב של מוצרים מבוססי ביו, כגון דלק, חום, ומגוון של תרכובות כימיות.
העלים היו תחילה הומוגניים, לאחר מכן צנטריפוגות, כדי לרכז את המולקולות של עניין. החומר הצמחי המרוכז היה אז saponified. החומר שחולץ נותח עם ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה נוזלית, כדי לקבוע את הריכוז של טוקופרול - משפחה של תרכובות ויטמין E שנמצאות בדרך כלל בצמחים.
החומר שחולץ יכול גם להיות מחדש במבחנה להרכב המקורי שלה. בדוגמה זו, saponification שימש כדי לחלץ קרוטנואידים מצמחי תרד, כדי להיות מחדש מאוחר יותר במבחנה. התרד היה תחילה הומוגני, לאחר מכן צנטריפוגה, כדי לקצור את מולקולות הפיגמנט. מולקולות אלה הושעו אז בתמיסה של אשלגן הידרוקסיד במשפך מפריד, ייזום סאפוניפיקציה. הקרוטנואידים הספוניים מופרדים לשכבת אתר, שנאספה ויבשה. באמצעות סדרה של מאגרי פתרון, הקרוטנואידים - ומולקולות פיגמנטציה אחרות - שוחזרו מאוחר יותר במבחנה. טיהור זה אפשר ניתוח של פיגמנטים אלה ללא הפרעה של תרכובות אורגניות מובנות באופן דומה.
בגלל היכולת שלה hydrolyze אסטרים, saponification יכול לשמש "חינם" תרכובות כי הם קשורים אחרת macromolecules. בדוגמה זו, צעד saponification נטול מים משמש להמיר אתיל 4-פלואורובנזואט למלח חומצה קרבוקסילית של אשלגן4-פלואורובנזואט. הגנה זו באמצעות סאפוניפיקציה מאפשרת ייצור של SFB גולמי - תגובה שלא הייתה אפשרית אם המולקולה הייתה נשארת "תקועה".
הרגע צפית בהקדמה של JoVE לטיהור דגימות37 של Ukבאמצעות סאפוניפיקציה. עכשיו אתה צריך להבין איך saponification עובד, וכיצד להשתמש בו כדי לטהר alkenones בתמצית שומנים מוחלטת. תהליכי טיהור נוספים יתבטאו בסרטונים הבאים.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. התקנה והכנת חומרים
- להשיג תמצית שומנים הכוללת (TLE) באמצעות שיטת מיצוי ממס (Sonication, Soxhlet, או מיצוי ממס מואץ (ASE)).
- הכן פתרון של 2 N KOH ב 5% H2O במתנול.
- KOH ומתנול ניתן לרכוש מקמעונאים כימיים. כימיקלים אלה צריכים להיות טהורים וללא פחמימנים.
- המסה הטוחנת של KOH היא ~ 56 אמו מניב 1 מול של OH- עבור כל מול של KOH. לכן, כדי להשיג ריכוז 2 N, להמיס 112 גרם של KOH ב 0.95 ליטר של מים טהורים 0.05 L של מתנול.
- שים לב כי פירוק KOH במים הוא אקסותרמי ויוצר כמות גדולה של חום. יש להקפיד להוסיף את כדורי KOH למים לאט כדי למנוע תגובה אלימה.
- ממיסים 112 גרם כדורי KOH ל-0.95 ליטר של מים טהורים על צלחת ערבוב אוטומטית.
- הוסיפו 0.05 ליטר של מתנול לאחר שכל KOH מומס כדי לסייע בפירוק הסמנים הביולוגיים האורגניים לתמיסה מימית.
- KOH ומתנול ניתן לרכוש מקמעונאים כימיים. כימיקלים אלה צריכים להיות טהורים וללא פחמימנים.
- הכן פתרון של 6 N חומצה הידרוכלורית (HCl) ב H2O.
- HCl ניתן לרכוש מקמעונאים כימיים. כימיקל זה צריך להיות טהור וללא פחמימנים.
- HCl בדרך כלל מגיע מרוכז כמו 13 N. לכן, תערובת 1:1 של HCl ומים טהורים מייצרת תערובת של 6.5 N של HCl, אשר קרוב מספיק ל 6 N למטרות ניסוי זה.
- הקפד להוסיף את HCl למים ולא להיפך, כמו הוספת מים HCl מרוכז הוא אקסותרמי ומייצר חום. הדבר עלול לגרום HCl להתיז.
- בעדינות ובאיטיות לשפוך 100 מל HCl לתוך המכילה 100 מל מים טהורים, מערבולת את התערובת בין תוספות של HCl.
- הכן פתרון של 5% NaCl (מלח שולחן) ב H2O.
- NaCl ניתן לרכוש מקמעונאים כימיים. כימיקל זה צריך להיות טהור וללא פחמימנים.
- חשב ושקל את מסת המלח הדרושה כדי להפוך ~ 1 ליטר של 5% פתרון (w / w). 1 ליטר מים שוקל ~ 1 ק"ג או 1,000 גרם. לכן, 50 גרם של NaCl מומס לתוך 950 מ"ל נותן פתרון 5% (50 גרם + 950 גרם = 1,000 גרם; 50 גרם / 1,000 גרם = 0.05 או 5%).
- מוסיפים בעדינות 50 גרם של NaCl למים טהורים על צלחת ערבוב אוטומטית וממתינים שהוא יתמוסס.
- להשיג את החומרים הבאים: 2 נקיים ובהבוים (550 °C (550 °C עבור 6 שעות) 40 מ"ל בקבוקוני זכוכית בורוסיליקט עם מכסה מצופה PTFE; תנור חימום או בלוקי חימום; נשרף (550 °C (6 שעות) צינורות זכוכית בורוסיליקט ונורות; סרט pH (טווח חומצי); Hexane (hexane ניתן לרכוש מקמעונאים כימיים. כימיקל זה צריך להיות אופטימה כיתה או שווה ערך).
2. שיטות
- התחל עם TLE מיובש (המכיל אסטרים) באחד בקבוקוני זכוכית בורוסיליקט 40 מ"ל.
- הוסף כ 10 מ"ל של 2 N KOH ל- TLE וכובע.
- מחממים בתנור או על בלוק חימום ל-60 מעלות צלזיוס למשך 2.5 שעות כדי לבקע את קשר אסתר(איור 3).
- הסר את הדגימה מהחום ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
- הוסף כ-10 מ"ל מפתרון NaCl של 5% ל-TLE (איור 3). זה עוזר לשמור על הממשק בין השלב מימי ואורגני (להתווסף) מקצף. כובע ולנער בקצרה.
- הוסיפו 6 N HCl ל-TLE המלוח עד להגעה ל-pH 2 כדי ליצור פרוטונים שלה-O - וליצור את המוצר הסופי, חומצה קרבוקסילית יציבה (איור 3;השתמשו בנייר pH לבדיקה). אם TLE היה צבוע, ייתכן שיש שינוי בצבע בקנה אחד עם pH 2.
- הוסף כ 20 מ"ל של hexane לתמיסה חומצית, אשר כעת ללא אסתר. מכסים ומנערים במרץ במשך 5 s כדי לחלץ תרכובות אורגניות מהמים.
- אפשר להגדיר עד שלבים מימיים ואורגניים נפרדים לחלוטין. מלחים, יונים, מים ו- HCl לא נפרע נשארים בשלב מימי. תרכובות אורגניות נמצאות כעת בהקסאן.
- הסר כ -75% מהקסאן supernatant באמצעות pipette ולחלק לתוך בקבוקון זכוכית בורוסיליקט 40 מ"ל האחרים.
- חזור על 2.7 - 2.9 פעמיים, הוספת כ 10 מ"ל של hexane בכל פעם.
- יש להשליך שאריות תערובת מימית במיכל פסולת תקין.
- תייג את ה- Vial המכיל הקסאן ואורגני ללא אסתר "TLE - saponified.
Saponification היא טכניקה המשמשת בדרך כלל להסרת אסטרים מתיל חומצות שומן מתערובת אורגנית מורכבת.
דגימות אורגניות מורכבות מנותחות לעתים קרובות על ידי כרומטוגרפיה גז, אשר משמש כדי לקבוע את הריכוזים היחסיים של רכיבים בודדים.
עם זאת, תרכובות דומות בגודל ובמבנה לא ניתן להבחין על ידי המכשיר, מוטה את התוצאות. לכן, תרכובות לא רצויות המייצרות אותות חופפים יש להסיר על מנת לקבל תוצאות מדויקות.
וידאו זה מכסה את השימוש סאפוניפיקציה כדי לטהר אלקנונים עבור פליאוקלימטולוגיה. זהו הראשון בסדרה המפרטת את הטיהור של דגימות סמנים ביולוגיים מורכבות. זה יכסה את ההליך, כמו גם כמה שימושים אחרים של הטכניקה.
קטונים אלקיל קטונים ארוכי שרשרת רב בלתי רוויים, הנקראים אלקנונים, הוכחו כמספקים מידע שימושי על טמפרטורת פני הים בעבר.
עם זאת, האורגניזמים המייצרים אלקנונים לעתים קרובות ליצור חומצת שומן מתיל אסטרים דומים בגודל ומבנה כימי, הנקרא אלקנואטים. בגלל קווי דמיון אלה, יש להסיר אלקנואטים לפני שניתן יהיה להשיג ניתוח מדויק.
סאפוניפיקציה היא טכניקה נפוצה המשמשת למניעת שיתוף פעולה של מולקולות אלה. סאפוניפיקציה משתמשת במים כדי לפצל את הקשר המולקולרי של אסתר. בסיס מתחבר לפחמן בלב האלקנואט. תגובת תוספת זו יוצרת ביניים לא יציב, ואת אלקוקסיד מסולק.
המימן מהחומצה החדשה שנוצרה עובר לאלקוידיד שגורש, וכתוצאה מכך אניון קרבוקסילט יוצר קשר יוני עם הקיטון מהבסיס. התוצאה היא אלכוהול ומלח חומצת שומן. הוספת חומצה חזקה תיצור מחדש את החומצה קרבוקסילית. בשלב זה, האלקנואט הפוגע הומר לצורה שכבר לא משתף פעולה עם האלקונון של עניין.
עכשיו שאתה מבין איך saponification יכול לשמש כדי לטהר תערובת אורגנית, אתה מוכן להתחיל את ההליך.
ראשית, לרכוש תמצית שומנים סה"כ מיובש - או TLE - שהושג באמצעות שיטת מיצוי ממס. לאחר מכן, הכן את פתרונות הספוניפיקציה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. ודא כי כל הרכיבים טהורים וללא פחמימנים. לאחר הכנת הפתרונות, מוסיפים את ה- TLE היבש ל בקבוקון זכוכית בורוסיליקט 60 מ"ל. מוסיפים 2 מ"ל של 2 אשלגן הידרוקסידי רגיל, ולאטום את המשחקון. לאחר מכן, לחמם את הוויאל ל 60 °C (60 °F) במשך 2.5 שעות כדי לבקע את קשר אסתר. כאשר זה הושלם, לאפשר לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר המדגם התקרר, להוסיף 2 מ"ל של 5% פתרון נתרן כלורי למצחקינה. מכסים את הקטוריון ומנערים בקצרה. יש להוסיף 6 N חומצה הידרוכלורית טיפה חכמה עד להגעה ל-pH של 2 - באמצעות נייר pH לבדיקה. התוספת של חומצה זו תיצור את אניון קרבוקסילט כדי ליצור את המוצר הסופי - חומצה קרבוקסילית יציבה.
עכשיו, כשהפתרון החומצי נטול אסתר, הוסף 5 מ"ל של הקסאן. מכסים ומנערים במרץ במשך 5 שניות כדי לחלץ את התרכובות האורגניות מהמים. אפשר לפתרון לנוח עד שהשלבים האורגניים והמ מימיים ייפרדו לחלוטין. מלחים, יונים וחומצה הידרוכלורית לא מתויקת יישארו בשלב מימי, בעוד תרכובות אורגניות ייפרדו לתוך ההקסאן. לאחר השלבים נפרדו לחלוטין, להסיר כ 75% של הקסאן באמצעות pipette, ולחלק לתוך עוד 40 מ"ל בוחן. חזור על תהליך החילוץ הזה פעמיים נוספות, הוספת 5 מ"ל של הקסאן בכל פעם. לאחר השלמת זה, להשליך את הפתרון מימי שנותר לתוך מיכל פסולת תקין. יש לסמן את הנקניקיון המכיל את השלב האורגני הטרי. חומצות קרבוקסיליות המיוצרות לא ניתן להזריק לתוך המכשירים הנפוצים לניתוח אלקנון ללא טיהור נוסף. חומצות קרבוקסיליות המוזרקות לכרומטוגרפיה גז מצטברות במהירות ומחורבות פתחים, תוחמי כניסה והקצה הקדמי של העמודים. כדי להסיר חומצות אלה, המדגם צריך תחילה לעבור טכניקת טיהור נוספת: הפרדה באמצעות כרומטוגרפיה עמודה.
סאפוניפיקציה יש מספר יישומים בהפקה וטיהור של מולקולות אורגניות.
Saponification יכול לשמש לא רק כדי להפריד סמנים ביולוגיים, אלא גם כדי לחלץ רכיבים בודדים לשימוש במוצרים מסחריים. בדוגמה זו, תרכובות מעץ הטבק - ניקוטיאנה גלאוקה - בודדו ונותחו כדי לחקור את הפוטנציאל שלהם כמזון למגוון רחב של מוצרים מבוססי ביו, כגון דלק, חום, ומגוון של תרכובות כימיות.
העלים היו תחילה הומוגניים, לאחר מכן צנטריפוגות, כדי לרכז את המולקולות של עניין. החומר הצמחי המרוכז היה אז saponified. החומר שחולץ נותח עם ספקטרומטריה כרומטוגרפיה-מסה נוזלית, כדי לקבוע את הריכוז של טוקופרול - משפחה של תרכובות ויטמין E שנמצאות בדרך כלל בצמחים.
החומר שחולץ יכול גם להיות מחדש במבחנה להרכב המקורי שלה. בדוגמה זו, saponification שימש כדי לחלץ קרוטנואידים מצמחי תרד, כדי להיות מחדש מאוחר יותר במבחנה. התרד היה תחילה הומוגני, לאחר מכן צנטריפוגה, כדי לקצור את מולקולות הפיגמנט. מולקולות אלה הושעו אז בתמיסה של אשלגן הידרוקסיד במשפך מפריד, ייזום סאפוניפיקציה. הקרוטנואידים הספוניים מופרדים לשכבת אתר, שנאספה ויבשה. באמצעות סדרה של מאגרי פתרון, הקרוטנואידים - ומולקולות פיגמנטציה אחרות - שוחזרו מאוחר יותר במבחנה. טיהור זה אפשר ניתוח של פיגמנטים אלה ללא הפרעה של תרכובות אורגניות מובנות באופן דומה.
בגלל היכולת שלה hydrolyze אסטרים, saponification יכול לשמש "חינם" תרכובות כי הם קשורים אחרת macromolecules. בדוגמה זו, צעד saponification נטול מים משמש להמיר אתיל 4-פלואורובנזואט למלח חומצה קרבוקסילית של אשלגן4-פלואורובנזואט. הגנה זו באמצעות סאפוניפיקציה מאפשרת ייצור של SFB גולמי - תגובה שלא הייתה אפשרית אם המולקולה הייתה נשארת "תקועה".
הרגע צפית בהקדמה של JoVE לטיהור דגימות37 של Ukבאמצעות סאפוניפיקציה. עכשיו אתה צריך להבין איך saponification עובד, וכיצד להשתמש בו כדי לטהר alkenones בתמצית שומנים מוחלטת. תהליכי טיהור נוספים יתבטאו בסרטונים הבאים.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
טיהור זה מייצר TLE ללא אסטרים שעשויים להיות שיתוף פעולה עם alkenones. עם זאת, הטיהור יצר חומצות קרבוקסיליות, אשר לא ניתן להזריק על מכשירים המשמשים בדרך כלל כדי לנתח דגימות עבור ריכוזי אלקנון בגלל התנודתיות הנמוכה שלהם. לדוגמה, נקודת הרתיחה של הקסאן, פחמימן 6 פחמן, הוא 68 °C (68 °F), אבל נקודת הרתיחה של החומצה שלה (חומצה hexanoic) הוא 205 °C (70 °F). רוב סמנים ביולוגיים מקובלים GC יש בין 20 ל 35 אטומי פחמן (נקודת רתיחה בדרך כלל עולה עם מספר גדל והולך של אטומים), ורוב תוכניות הטמפרטורה GC להפסיק סביב 300 °C (300 °F). חומצות קרבוקסיליות המוזרקות ל- GC מצטברות במהירות ומכניסות חורבות, תוחמי כניסה וקצה העמודים הקדמי. כדי להסיר חומצות אלה, המדגם צריך תחילה לעבור הפרדה טכניקת טיהור אחרת באמצעות כרומטוגרפיה עמודה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
כפי שהוזכר קודם לכן, saponification משמש בדרך כלל במעבדות גיאוכימיה אורגנית כדי להסיר אסטרים מתיל חומצות שומן (FAMEs) של אלקנונים, הנקראים alkenoates, אשר co-elute עם alkenones על כרומטוגרפים גז(איורure 1). Saponification משמש גם "חינם" חומצות שומן "מחויב" משקעים או macromolecules. ההשפלה והשימור של חומר אורגני וסמנים ביולוגיים משקעים כרוכה בהסרת קבוצות פונקציונליות (N, O ו- S) ופימור בסופו של דבר של סמנים ביולוגיים בודדים למקרומולקולטים ו / או ספיחה של סמנים ביולוגיים ומקרומולקולים על משטחים מינרליים. לא כל סמנים ביולוגיים בסביבה הופכים מחויבים, והיחס בין סמנים ביולוגיים מחויבים ללא תשלום עשוי להשתנות על ידי הגדרה וגיל משפע מסיבות שעדיין לא מוסברות במלואן. Saponification, לפעמים בטמפרטורות גבוהות יותר מאלה שנדונו כאן (>200 °C (200 °F), משמש כדי לשחרר סמנים ביולוגיים קשורים אלה במאמץ לתאר אותם, המקור שלהם, ואת המנגנונים האחראים על הטבע הכבול שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
