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환경 검체에서 박테리오파지 검출
 
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환경 검체에서 박테리오파지 검출

Overview

출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 - 애리조나 대학교
데모 저자: 알렉스 와시미

바이러스는 진핵생물과 대핵생물을 모두 감염시키는 생물학 실체의 유일한 그룹입니다. 그(것)들은 신진 대사 능력이 없는 의무 기생충이고, 복제하기 위하여, 호스트 물질 대사에 의지하여 호스트 세포 안쪽에 자기 조립하는 바이러스성 부분을 생성합니다.

바이러스는 초미세이며, 전자 현미경의 더 큰 해상도로만 볼 수있는 가벼운 현미경으로 볼 수 없을 정도로 작습니다. 바이러스 성 입자는 단백질 하위 단위 또는 카포머로 구성된 캡슐화로 알려진 단백질 코트로 둘러싸인 DNA 또는 RNA 인 핵산 게놈으로 구성됩니다. 좀 더 복잡한 바이러스에서 캡시드는 추가 지질 봉투로 둘러싸여 있으며 일부는 스파이크 모양의 표면 부속물이나 꼬리를 가지고 있습니다.

인간과 동물의 장관을 감염시키는 바이러스는 장 바이러스로 알려져 있습니다. 배설물에서 배설되어 국내 폐수에서 분리될 수 있습니다. 박테리아를 감염시키는 바이러스는 박테리오파주로 알려져 있으며, 대장균 균을 감염시키는 바이러스는 대장균(도1)이라고합니다. 대장균 박테리아의 파지는 대장균 박테리아가 발견되는 곳이면 어디에서나 발견됩니다.

Figure 1
그림 1. 대장균 T2.

Principles

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박테리오파지는 생물학적 시스템의 중요한 구성 요소이기 때문에 환경 과학에서 연구됩니다. 그들은 지구상에서 가장 풍부한 생물학적 실체이며 세균 성 인구, 식품 웹 프로세스, 생지구 화학 적 주기를 제어하고 수평 유전자 전송을 통해 원핵 다양성을 향상시키기 때문에 중요합니다. 파지는 또한 fecally 전송하지만 분석하기 어려운 질병을 일으키는 장 바이러스에 대한 신뢰할 수있는 대리 지표라는 증거가있다. 박테리아를 열거하는 비교적 빠르고 저렴한 방법의 가용성은 환경 샘플에서 배설물 오염의 평가를위한 매력적인 도구를 만든다.

물 속의 대장균은 성장의 로그 단계에서 대장균의 문화와 함께 부드럽거나 오버레이 한가르에 샘플을 첨가하여 분석된다. 파지는 세균 세포에 부착하고 박테리아를 lyse. 박테리아는 파지가 성장하고 박테리아를 lysed 영역을 제외하고 성장의 수렴 잔디를 생산. 이러한 결과 명확한 영역은 플라크로 알려져 있습니다. 부드러운 한천 오버레이는 바이러스의 물리적 확산을 제한하는 데 사용되므로 박테리아에서 리싱하면 이웃 세균 세포로만 퍼질 수 있습니다.

최적의 플라크 형성을 얻으려면 숙주 박테리아가 성장의 로그 단계에 있는 것이 중요합니다. 이것은 모든 파지 가 살아있는 박테리아에 붙어 있고 자성을 생성하는 것을 보장합니다. 이것은 숙주 박테리아의 문화가 분석이 수행되는 매일 준비될 것을 요구합니다. 일반적으로 문화는 분석 전날 배양되어 고정 단계에 있을 수 있습니다. 분석 당일, 배양은 분석법에 대한 로그 단계에서 충분한 숙주 박테리아를 얻기 위해 배양되는 국물을 접종하는 데 사용됩니다(일반적으로 35-37°C에서 흔들리는 수조에서 2-3h의 배양을 필요로 합니다).

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Procedure

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  1. 대장균을 함유한 하수 또는 물의 샘플을 가져옵니다.
  2. Tris 버퍼를 사용하여 샘플을 1:10 및 1:100으로 희석합니다. 1.0mL의 배양을 트리스 버퍼9mL로 전송한 다음 두 번째 10배 희석을 수행합니다.
  3. 부드러운 한천 튜브 3개(3mL 튜브당 0.7% 영양소 천 또는 트립티케이스 대두 아가르)를 한증탕이나 오토클레이브에 넣음으로써 녹입니다.
  4. 한천의 온도가 45°C로 조정되도록 15분 동안 45-48°C의 수조에 한천을 놓습니다.
  5. 첫 번째 튜브에, 희석되지 않은 시료의 대장균1 및 1 mL의 로그 상 국물 배양1mL을 추가한다.
  6. 수조에서 튜브를 제거하고 부드럽게 2-3 s에 대한 서스펜션을 혼합손 사이에 바위.
  7. 종이 타월로 튜브에서 물을 닦고 바닥 한천 (일반 영양소 한천 또는 트립티 케이스 대두 사가르)가 들어있는 이전에 준비된 페트리 접시 위에 한천을 붓습니다.
  8. 플레이트를 빠르게 회전하여 상단 한천을 펼치게 합니다. 한천이 표면 전체를 덮는지 확인합니다.
  9. 5-8단계는 각 시료 희석의 박테리아 1mL 및 1mL를 사용하여 다른 두 개의 연한 천튜브와 함께 반복한다(그림2).
  10. 한천이 굳어진 후 페트리 접시를 반역하고 37°C에서 48h로 배양한다. 페트리 접시 뚜껑에서 습기를 떨어 뜨려 줍니다. 수분 방울이 플라크에 떨어지면 바이러스가 천 표면에 퍼집니다.
  11. 인큐베이션 후, 각희석(도 3)에플라크 수를 계산하고 원래 샘플에서 파지의 농도를 계산한다. 플라크의 크기 나 모양의 주요 차이점을 기록합니다.

Figure 2
그림 2. 대장균 열거를 위한 최고 한고를 사용하여 세균 잔디의 준비를위한 절차.

Figure 3
그림 3. 세균 잔디에 파지 플라크.

1대장균 균주 ATCC 15597은 일반적으로 하수 샘플에서 가장 많은 수의 플라크를 생성합니다. 250mL 에렌마이어 플라스크에서 영양분이나 트립티케이스 콩 육물을 100mL로 함유하고 파지 분석 이1mL을 100mL의 영양또는 시도용 수량37°C의 신선한 플라스크로 접종하기 전에 35°C.3h의 흔들림 조건에서 배양해야 한다. 이것은 박테리아가 성장의 로그 단계에 있는지 확인합니다.

바이러스는 많은 질병, 감기 및 독감, 간염 및 HIV에 책임 있는 전염성 있는 생물학 입자입니다.

바이러스는 DNA 또는 RNA 게놈으로 구성된 생물학적 입자이며, 캡시드로 알려진 단백질 코트 안에 감싸고 때로는 추가 지질 봉투를 가지고 있습니다. 바이러스는 그들 자신에 신진 대사 또는 생식 능력이 없습니다, 그리고 살아있는 세포를 침략 하 고 그들의 셀 룰 러 기계를 납치 하 고 그들의 더 많은 복사본을 만들기 위해.

박테리아와 같은 각막 세포와 인간과 같은 진핵 세포는 바이러스의 특정 클래스에 의해 감염될 수 있습니다. 특히, 박테리오파지는 박테리아를 감염시키는 바이러스입니다. 예를 들어, 대장균은 대장균,일반적인 창자 박테리아, 식중독을 유발할 수 있는 일부 균주를 감염시키는 파지이며, 이는 물 공급의 배설물 오염의 표시입니다.

파지 자체는 일반적으로 인간에서 병원성 것으로 알려져 있지 않지만, 그들은 또한 fecally 전송하지만 분석하기 어려운 질병을 일으키는 장외 바이러스에 대한 신뢰할 수있는 대리 지표라는 증거가있다. 박테리아를 열거하는 비교적 빠르고 저렴한 방법의 가용성은 환경 샘플에서 배설물 오염의 평가를위한 매력적인 도구를 만든다.

이 비디오는 파지 열거 뒤에 원리를 소개합니다; 플라크 분석으로 알려진 파지 정량화 프로토콜을 시연; 마지막으로 파지 및 기타 바이러스의 탐지 및 계수를 위한 여러 환경 과학 응용 프로그램을 살펴보십시오.

박테리오파지, 모든 바이러스처럼, 살아있는 세포를 기생해야, 이 경우 박테리아, 재현하기 위해.

파지는 착륙하여 세균세포 표면에 부착하고 유전 물질을 세포에 주입함으로써 그렇게 합니다. 일단 세포 안쪽에, 바이러스성 게놈은 복제되고 바이러스 성 capsid의 단백질 분대는 호스트 세포의 생화학 기계를 사용하여, 생성됩니다. 파지 입자가 조립되면, 그들은 종종 호스트를 lysing하고 파열하여 박테리아에서 방출되어 그 과정에서 숙주 세포를 죽입니다.

샘플에서 파지 농도를 결정하는 데 널리 사용되는 방법은 이러한 리틱 활성을 활용한다. 이 기술에서, 샘플에서 파지는 박테리아와 부드러운 한천과 혼합된다. 이 혼합물은 일반 한천을 기판으로 페트리 접시에 부어, 상단 층은 오버레이를 형성한다.

박테리아는 연속 잔디를 형성 하는 이러한 높은 농도에. 박테리아는 파지 감염모든 박테리아가 살아 있고 파지가 자권을 생성 할 수 있도록, 성장의 로그 단계에있는 문화에서 얻어야한다.

파지 입자가 박테리아를 감염시키고 리세스할 때, 파지 자손은 가까운 세균성 세포로 퍼지고 감염을 계속할 것입니다. 부드러운 한천은 파지 입자의 확산을 제한합니다. 결국, 플라크로 알려진 청산 영역이 형성될 것입니다.

파지 충분히 낮은 농도로 희석 하는 경우, 다음 이산, 개별 플라크 세균성 잔디밭에서 관찰 될 수 있습니다. 이들은 계산하고 원래 견본의 mL 당 파지의 플라크 형성 단위, 또는 PfUs의 수를 계산하기 위하여 이용될 수 있습니다.

이제 파지가 박테리아를 어떻게 감염시키는지, 그리고 이 활동이 파지 농도를 측정하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 이해하게 되었으므로, 환경 용수 샘플에서 파지를 열거하기 위해 플라크 분석법을 사용하는 프로토콜을 살펴보겠습니다.

어느 날 분석작업을 수행하기 전에, 250mL 에렌마이어 플라스크에서 100mL의 트립티케이스 대두 국물에 대장균 균주 ATCC 15597의 식민지를 접종한다. 하룻밤 사이에 35 °C에서 흔들어 서 배양하십시오.

3 시간 전에 분석, 하룻밤 대장균 문화의 1 mL을 신선한 100 mL의 국물에 접종한다. 이 새로운 문화를 35~37°C 의 온도에서 흔들리는 수조에 넣습니다. 이것은 분석이 시작될 때 박테리아가 성장의 로그 단계에 있다는 것을 보장합니다.

플라크 분석법을 시작하려면 트리스 버퍼 9mL를 사용하여 물 샘플의 10- 및 100 배 직렬 희석을 만듭니다.

한증탕을 사용하여 5mL 튜브 3개에 0.7% 소프트 탑 한천을 녹여 트라이피케이스 콩이나 영양천을 섭취하십시오. 녹으면, 한천의 온도가 45°C로 떨어지면 45 내지 48°C의 수조에 놓습니다.

소프트 한천의 첫 번째 튜브에, 이전에 준비된 로그 상 대장균 배양의 1mL과 희석되지 않은 물 샘플의 1mL을 추가한다. 수조에서 튜브를 제거하고 부드럽게 서스펜션을 혼합하기 위해 2-3 s에 대한 손 사이에 바위.

이전에 준비된 페트리 접시위에 트라이피케이스 콩이나 영양사 로 부드러운 한천을 붓습니다. 플레이트를 빠르게 회전시켜 퍼지므로 전체 표면을 덮습니다.

희석된 각 시료의 1mL를 사용하여 다른 두 튜브에 대한 접종 및 도금을 반복합니다.

상단 한천이 굳어지면 요리를 반전시키고 37°C에서 48h로 배양합니다.

잠복 후 각 플레이트의 전염병 수를 계산합니다. 카운트에서, 원래 샘플에서 파지 농도를 계산

예를 들어, 10배 희석 플레이트로부터 9개의 플라크를 획득한 경우, 원래 물 샘플에서 9회 10mL또는 90PUs/mL로 나누어진다.

파지 플라크 애약이 어떻게 수행되는지 보았으니, 플라크 애사서를 사용하여 파지 및 다양한 출처의 다른 유형의 바이러스를 열거하는 방법을 살펴보겠습니다.

플라크 분석 기반 방법은 토양과 같은 다른 환경 샘플로부터 박테리오파지를 분리하는 데 사용될 수 있다. 이 예에서, 연구원은 여과에 의해 토양에서 파지를 처음 수집했습니다. 파지는 그 때 플라크 분석에서 일반적인 토양 박테리아 Arthrobacter를 감염시키기 위하여 이용되었습니다. 파지는 개별 플라크에서 수확하고 새로운 천판에 줄무늬, 다음 박테리아가 함유 된 상단 한천으로 오버레이. 파지 농도는 줄무늬의 길이를 따라 감소하므로 단일 유형의 파지에 의해 형성 될 가능성이있는 이산 플라크가 얻을 수 있습니다. 이러한 개별 플라크는 그 때 내파를 더 분석하기 위하여 선택될 수 있었습니다.

박테리오파지 이외에, 플라크 소사는 포유류를 감염시키는 인플루엔자와 같은 다른 바이러스와 함께 수행될 수 있습니다. 이렇게 하기 위해 포유류 세포는 조직 배양 접시에 단층으로 처음 성장합니다. 바이러스를 포함하는 매체는 그 때 세포가 젤 같이 아가로즈와 같은 고정 매체로 오버레이되기 전에 감염이 생기도록 세포에 추가됩니다. 최대 2주까지 지속될 수 있는 잠복기 후에, 감염된 세포는 플라크를 시각화하고 계산할 수 있도록 고정되고 염색됩니다.

마지막으로, 환경에서 수집된 샘플 외에도 플라크 어필은 감염된 개인의 조직 샘플에서 바이러스를 감지하고 열을 하는 데 유용합니다. 여기서, 연구원은 감마 헤르페스 바이러스에 감염된 마우스에게서 폐 조직을 얻고 균질화했습니다. 이 바이러스 함유 균동화는 포유류 세포 배양을 감염시키는 데 사용되었다. 플라크의 수는 감염된 폐 조직에서 바이러스 성 티터에 대한 견적을 제공하기 위해 계산 될 수있다.

환경 샘플에서 박테리오파지 검출에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 당신은 지금 파지의 기본 생물학을 이해해야한다, 환경 샘플에서 파지를 양으로 플라크 분석작업을 수행하는 방법, 플라크 분석은 환경 또는 임상 샘플에서 파지 및 기타 바이러스를 연구하는 데 사용할 수있는 방법. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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Results

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하수 시료 희석 = 10-1

획득한 플라크 수 = 9

따라서 하수 샘플의 파지 농도
= 10 x 9 ÷ 1mL
= 90 플라크 형성 단위 / mL

원시 하수는 일반적으로 mL 당 103 - 104 대장균을 포함하고, 범위는 102 – 10 mL 당8.

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Applications and Summary

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환경 지표로 대장균의 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 여기에는 하수 오염, 물 및 폐수 처리의 효율성, 환경 내 장 바이러스 및 박테리아의 생존의 지표로서의 사용이 포함됩니다. 장내 세균 및 동물 바이러스의 존재와 행동의 지표로 박테리오파지를 사용하는 것은 파지 애약과 관련된 검출의 용이성과 저렴한 비용으로 인해 항상 매력적이었습니다. 또한, 장내 바이러스에 대한 일 또는 주에 비해 24시간 이내에 환경 샘플에서 정량화될 수 있다.

1대장균 균주 ATCC 15597은 일반적으로 하수 샘플에서 가장 많은 수의 플라크를 생성합니다. 250mL 에렌마이어 플라스크에서 영양분이나 트립티케이스 콩 육물을 100mL로 함유하고 파지 분석 이1mL을 100mL의 영양또는 시도용 수량37°C의 신선한 플라스크로 접종하기 전에 35°C.3h의 흔들림 조건에서 배양해야 한다. 이것은 박테리아가 성장의 로그 단계에 있는지 확인합니다.

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