Overview
출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 - 애리조나 대학교
시연 저자: 브래들리 슈미츠와 루이사 이크너
표면 토양은 이차 골재를 형성하기 위해 함께 결합무기와 유기 입자의 이질 혼합물이다. 골재 안팎은 공기와 물을 시각적으로 포함하는 공극또는 모공이 있습니다. 이러한 조건은 박테리아에 대 한 이상적인 생태계를 만듭니다., 그래서 모든 토양 박테리아의 광대 한 인구를 포함, 일반적으로 이상 1 백만 토양의 그램 당.
박테리아는 프로카요테로 알려진 미생물의 가장 간단합니다. 이 대핵계 그룹 안에는 actinomycetes로 알려진 필라멘트 미생물이 있습니다. 액티노미세테는 실제로 박테리아이지만, 종종 자궁균을 형성하기 위해 함께 매달려 여러 세포로 구성된 필라멘티드 구조 때문에 박테리아분류 내에서 독특한 그룹으로 간주됩니다. 이 실험은 희석 및 도금 중에 액티노마이세테 콜로니를 선택하는 글리세롤 케이스 미디어를 사용합니다. 전형적으로, actinomycetes는 전체 세균성 인구의 대략 10%입니다. 박테리아와 액티노미세테는 지구상의 모든 환경에서 발견되지만 토양에 있는 이 미생물의 풍부하고 다양성은 비교할 수 없습니다. 이 세균은 또한 인간의 생활에 필수적이며 사람들이 먹고, 마시거나, 호흡하거나, 만지는지에 영향을 미칩니다. 또한, 사람을 감염시키고 질병을 일으킬 수 있는 세균성 종도 있으며, 사람을 치유할 수 있는 천연제품을 생산할 수 있는 박테리아가 있다. Actinomycetes는 연쇄상 구균과 같은 항생제를 생산하기 위해 특히 중요합니다. 박테리아는 영양 순환에 대 한 중요 한, 식물 성장, 그리고 유기 오염 물질의 저하.
박테리아는 토양에서 찾을 수 있는 종의 수측면에서 매우 다양, 부분적으로 그들은 생리및 대사 다양 하기 때문에. 박테리아는 이종성 위축될 수 있습니다, 그(것)들이 음식과 에너지를 위해 포도당과 같은 유기 화합물을 이용한다는 것을 의미합니다, 또는 autotrophic, 음식과 에너지를 위해 원소 황과 같은 무기 화합물을 이용한다는 것을 의미합니다. 그(것)들은 또한 호흡을 위한 산소를 이용하는, 또는 혐기성, 질산염 또는 황산염과 같은 산소의 결합한 양식을 이용하는, 호흡하기 위하여 호기성일 수 있습니다. 일부 박테리아는 산소 또는 산소의 결합 된 형태를 사용할 수 있으며, 능력 성 혐제로 알려져 있다.
Principles
토양 샘플에 존재하는 박테리아의 수를 열거하는 한 가지 방법은 희석 및 도금 방법론을 활용하는 것입니다. 이 방법론은 한천을 세균 성장을 위한 매체로 활용하며, "컬터리 테크놀로지"라고 불리는 공정입니다. 토양 내에서 발견되는 박테리아의 광대 한 숫자 때문에, 토양의 작은 샘플은 페트리 플레이트 내의 한천에 도금되기 전에, 물에 일련 적으로 희석된다. 전형적으로, 희석된 토양 현탁액의 0.1~ 1mL 내에 포함된 소량의 토양은 천판의 표면에 "확산"된다. 접시에는 뜨거운 때용융되는 한천이 들어 있지만 식으면 단단합니다. 한천 이외에, 펩톤 효모 또는R2A로 시판되는 제품과 같은 영양소는 이종성 균균의 성장을 허용하기 위해 배지에 첨가된다.
희석 및 도금은 토양 박테리아의 열거를 위한 저렴하고 비교적 간단한 기술입니다. 그러나 이 기술에는 몇 가지 단점이 있습니다. 희석 및 도금 해석과 관련된 몇 가지 일반적인 오류 및 가정은 다음과 같습니다 : 모든 단일 토양 박테리아가 식민지를 초래한다고 가정하지만 실제로는 식민지가 세포의 덩어리에서 발생할 수 있으며 진정한 컬터리 카운트의 과소 평가가 발생할 수 있습니다. 토양의 직렬 희석 하는 동안, 토양 입자 밖으로 정착할 수 있습니다 (바닥에 가을), 그래서 토양의 진정한 알리쿼트 다음 희석으로 전달 되지 않습니다. 많은 토양 미생물은 실행 가능하지만 비컬처입니다. 느린 성장 박테리아는 합리적인 기간 내에 눈에 보이는 식민지결과 하지 않을 수 있습니다 (1-2 주).
또한, 혐기성 박테리아는 호기성 조건하에서 자라지 않으며, 자라는 박테리아는 배지에 첨가된 영양소에 의해 선택된다. 따라서 R2A는 이종국균 박테리아를 선택하고 원소 유황은 자가 영양 황 산화제를 선택합니다. 전반적으로, 모든 토양 박테리아의 0.1~1%만이 배양될 수 있는 것으로 추정된다. 따라서 토양 박테리아의 희석 및 도금은 컬터리 박테리아를 차지하고 실제 가능한 토양 인구를 1~2배 의 크기로 과소평가합니다. 토양 희석 및 도금으로 인한 이종성 세균성 식민지의 예가 도 1에도시된다. 식민지가 육안으로 볼 수 있도록 약 1백만 개의 세균 세포가 필요합니다.
이 실험은 토양 샘플 내의 박테리아 수를 열거하는 데 사용되는 희석 및 확산 도금 방법론을 보여줍니다. 특히, 두 개의 미디어가 사용됩니다: 하나는 모든 박테리아를 위해 디자인되고, 다른 하나는 actinomycetes를 위해 선택합니다. 일단 세균성 식민지가 천판에서 성장하면, 줄무늬 플레이트 기술을 사용하여 선택된 식민지의 순수한 문화를 분리한다. 그런 순수한 문화는 특정 특성과 기능을 더 분석하고 특성화 할 수 있습니다.
그림 1. R2A 천 판에 이종국 식민지. 다양한 형태학을 가진 이산 식민지의 숫자는 희석 및 토양에서 도금 후에 생겨나고 있습니다. 아카데믹 프레스가 부여한 사용 허가.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. 토양 희석제 준비
- 절차를 시작하려면 토양 샘플 10g의 무게를 측정하고 95 mL의 탈온 화 물을 추가합니다. 서스펜션을 잘 흔들어 "A"라고 표시합니다.
- 토양이 정착하기 전에 멸균 파이펫으로 서스펜션 1mL를 제거하고 9mL 의 증분 비워로 옮기습니다. 소용돌이를 철저히 표시하고"B"로 라벨을 붙입니다.
- 이 희석 단계를 세 번 반복하며, 매번 이전 서스펜션의 1mL및 9mL 의 분수 블랭크를 반복한다. 이러한 레이블을 튜브 C, D 및 E로 순차적으로 라벨을 지정합니다. 이로 인해 mL당 10-1~10-5그램의 토양희석이 발생합니다.
2. 세균 문화를 위한 스프레드 플레이트 만들기
- 세균성 식민지를 성장시키기 위하여는, 3개의 미리 준비된 펩톤 효모 한천 판을 취하고 C, D 및 E. 소용돌이 견본 C, D 및 E, 및 파이펫 0.1 mL각 접시에 그(것)들을 레이블을 붙입니다. 이렇게 하면 희석 값을 10배 증가시킨다(C=10-3,D =10-4,E =10-5).
- 다음으로 유리 스프레더를 에탄올에 담급드세요. 스프레더를 화염에 몇 초 동안 놓고 에탄올을 점화하고 태워버린다. 이렇게 하면 스프레더가 소독됩니다.
- 불꽃이 꺼질 때까지 스프레더를 첫 번째 접시 위에 놓습니다. 뚜껑을 닫고 접시를 빠르게 엽니다. 스프레더를 접종(이노쿨룸 = 배양시 시작에 사용되는 세포)에서 멀리 떨어진 천에 터치한 다음, 자유 액체의 흔적이 사라질 때까지 천자의 표면 주위에 접종을 퍼뜨립니다. 플레이트 뚜껑을 교체합니다.
- 스프레더를 다시 불태우고 다음 플레이트로 프로세스를 반복하여 공기 중 유기체로 한고를 오염시키지 않도록 신속하게 작업합니다.
- 1 주일 동안 실온에서 박테리아 플레이트를 배양하십시오. 복어질 중에 플레이트가 반전되어 응축으로 인한 수분 방울이 천 표면에 떨어지는 것을 방지하십시오.
3. 액티노미세테스용 스프레드 플레이트 만들기
- 액티노마이세테를 성장시키기 위해 미리 준비된 글리세롤 카제인 플레이트 3개를 가지고 B, C 및 D. 이전에 도시된 기술을 사용하여 서스펜션 B, C 및 D에서 0.1 mL를 확산시니다. 저희석은 작용근세테가 전형적으로 세균 집단의 1/10th(B = 10-2, C =10-3,D = 10-4)로 존재하기 때문에 사용된다.
- 실온에서 액티노미세테 플레이트(반전)를 2주 동안 배양한다.
4. 세균 및 액티노미세테 카운트
- 인큐베이션 후 모든 박테리아 플레이트를 주의 깊게 살펴보고 식민지 크기와 모양의 차이를 주의하십시오. 한천에서 재배할 때 박테리아는 무색에서 밝은 오렌지, 노란색 또는 분홍색에 이르는 끈적끈적한 식민지를 생성합니다. 대조적으로, actinomycete 식민지는 백악질, 단단한, 가죽, 그리고 압력에서 중단됩니다, 그밖 세균성 식민지는 얼룩질 것입니다. 이를 통해 식민지는 멸균 루프와 접촉하여 구별할 수 있습니다.
- 계산 하 고 세균성 식민지의 수를 기록, 어떤 actinomycetes를 포함 하 여. 플레이트당 30-200개의 콜로니가 있는 플레이트만 계산합니다.
5. 순수한 문화의 고립
- 플레이트 중 하나에서 개별 세균 성 식민지를 선택합니다. 토양에 특별한 관심이 있는 경우 더 많은 식민지를 선택할 수 있습니다. 그것은 잘 분리 된 순수한 식민지를 가지고하는 경향이 있기 때문에, 높은 희석 판을 사용합니다. 이웃 식민지와 잘 분리된 식민지만 선택하고 서로 형태학적으로 구별되는 것처럼 보입니다.
- 알코올에 찍어 그것을 불타는하여 루프를 살균. 페트리 요리를 빠르게 열고 루프를 한천의 맨 자리에 터치하여 식힙니다. 그런 다음 루프에 소량의 관심 있는 콜로니를 제거합니다.
- 신선한 펩톤 효모 접시를 가지고, 한쪽에 몇 센티미터 길이의 줄무늬를 합니다. 살균하고 다시 식힌 다음 첫 번째 패스에서만 초기 연승을 가로지르는 연승을 만듭니다. 이 프로세스를 동일한 방식으로 두 번 더 반복합니다. 이 줄무늬 "희석"은 루프의 셀이 서로 분리되는 결과를 낳습니다. 2 주 동안 실온에서 배양하는 어두운 영역에 접시를 배치합니다.
환경 박테리아의 정확한 수를 결정하는 것은 토양 생태계의 건강을 평가하는 데 중요합니다. 이것은 적당한 희석으로 세균성 식민지를 배양하여 달성될 수 있습니다.
토양 박테리아는 분해, 질소 고정 및 영양소 순환에서 역할을 하는 건강한 토양 생태계의 중요한 부분입니다. 표면 토양은 공기 또는 물로 채우는 모공을 둘러싼 복잡한 매트릭스를 형성하는 유기 및 무기 입자의 기판입니다. 이러한 조건은 박테리아에 대 한 이상적인 생태계를 만들, 표면 토양 일반적으로 그램 당 백만 박테리아의 위쪽으로 포함.
박테리아의이 높은 농도 때문에, 희석 성장 매체에 도금 하기 전에 필요 하다. 직렬 희석은 단일 식민지가 미디어 플레이트에서 재배될 수 있을 만큼 낮은 수준으로 원래 토양 샘플의 농도를 감소시켜 토양 샘플에서 박테리아의 초기 수를 계산할 수 있게 한다.
이 비디오는 토양 샘플의 직렬 희석을 준비하는 방법, 이러한 세균 샘플을 플레이트하는 방법 및 희석 판에서 토양 세균 수를 계산하는 방법을 보여줍니다.
박테리아는 간단한 원핵 생물, 하지만 종과 생태계 측면에서 매우 다양 한. 액티노미세테스는 필라멘트 구조로 인해 독특한 그룹으로 자주 간주되는 박테리아의 하위 집합으로, 그들은 함께 매달려 져져 최해를 형성합니다.
전형적으로, actinomycetes는 토양에 있는 총 세균성 인구의 10%를 차지합니다. 박테리아와 액티노미세테스는 지구상의 거의 모든 환경에서 풍부하지만 비교할 수 없는 다양성과 토양의 풍부에서 발견됩니다.
토양 박테리아는 확대되고 희석 도금으로 잠재적으로 배양되고 식별됩니다. 여기서 토양 샘플은 연속적으로 물에 희석된 다음 천 성장 판에 분산됩니다. 그런 다음 결과 콜로니가 계산됩니다. 이 값은 희석 인자와 함께 토양에서 박테리아의 초기 농도를 해명하는 데 사용됩니다.
희석 도금은 세균 열거를 위한 일반적이고 저렴하며 간단한 방법이지만 여러 가지 단점으로 고통받고 있습니다. 토양은 편향된 성장으로 이어질 수 있는 희석 중에 정착할 수 없습니다. 일부 토양 박테리아는 접시에 문화하지 않습니다, 또는 관찰하기에 너무 느리게 성장. 추가적으로, 이 방법은 식민지가 단 하나 박테리아에서 형성된다는 것을 가정합니다, 그러나 다중 세포의 덩어리에서 생길 수 있습니다.
특정 세균성 종은 다른 성장 매체에 더 잘 성장합니다. 다양한 박테리아를 배양하는 일반적인 기판은 한천-펩톤 효모 플레이트이다. 액티노마이세테스는 글리세롤 카제인 기반 플레이트에서 우대적으로 자라며, 이는 이러한 필라멘트 박테리아의 성장에 더 잘 어울립니다.
이제 세균 열거의 개념을 이해하게 되었으므로 이 과정이 실험실에서 어떻게 수행되는지 살펴보겠습니다.
절차를 시작하려면 토양 샘플 10g의 무게를 측정하고 95 mL의 탈온 화 물을 추가합니다. 서스펜션을 잘 흔들어 "A"라고 표시합니다. 토양이 정착하기 전에 멸균 파이펫으로 서스펜션 1mL를 제거하고 9mL의 탈온화 된 물로 옮기습니다. 소용돌이를 철저히 표시하고"B"로 라벨을 붙입니다.
이 희석 단계를 3회 반복하며, 매번 이전 서스펜션의 1mL및 9mL의 탈온화된 물로 반복한다. 이러한 레이블을 튜브 C, D 및 E로 순차적으로 라벨을 지정합니다. 이로 인해 mL당 10-1~10-5그램의 토양이 연속 희석됩니다.
세균성 식민지를 성장시키기 위하여는, 3 미리 준비된 펩톤 효모 한천 판을 취하고 각 접시에 상응하는 견본 및 파이펫 0.1 mL를 C, D 및 E. 소용돌이로 레이블을 붙입니다. CfU는 mL당 보고되기 때문에 0.1 mL을 사용하면 희석을 10배 증가시킵니다.
다음으로 유리 스프레더를 에탄올에 담급드세요. 스프레더를 화염에 몇 초 동안 놓고 에탄올을 점화하고 태워버린다. 이렇게 하면 스프레더가 소독됩니다.
불꽃이 꺼질 때까지 스프레더를 첫 번째 접시 위에 놓습니다. 뚜껑을 닫고 접시를 빠르게 엽니다. 스프레더를 접종자에서 멀리 떨어진 천지에 터치하여 식힌 다음 자유 액체의 흔적이 사라질 때까지 표면 주위에 접종을 퍼뜨립니다. 플레이트 뚜껑을 교체합니다.
스프레더를 다시 불태우고 다음 플레이트로 프로세스를 반복하여 공기 중 유기체로 접시를 오염시키지 않도록 신속하게 작업합니다. 접시를 뒤집어 서 수분 방울이 한천에 떨어지는 것을 방지하고 1 주일 동안 실온에서 플레이트를 배양하십시오.
액티노마이세테를 성장시키기 위해 미리 준비된 글리세롤 카제인 플레이트 3개를 가지고 B, C 및 D. 이전에 도시된 기술을 사용하여 서스펜션 B, C 및 D에서 0.1 mL를 확산시니다. 더 낮은 희석제는 actinomycetes가 일반적으로 세균성 인구의 1/10으로 나타나기 때문에 이용됩니다.
마지막으로, 이 접시를 반전하고 2 주 동안 실온에서 저장합니다.
인큐베이션 후 모든 박테리아 플레이트를 주의 깊게 살펴보고 식민지 크기와 모양의 차이를 주의하십시오. 한천에서 재배할 때 박테리아는 무색에서 밝은 오렌지, 노란색 또는 분홍색에 이르는 끈적끈적한 식민지를 생성합니다. 대조적으로, actinomycete 식민지는 백악질, 단단한, 가죽, 그리고 압력에서 중단됩니다, 그밖 세균성 식민지는 얼룩질 것입니다. 이를 통해 식민지는 멸균 루프와 접촉하여 구별할 수 있습니다.
계산 하 고 세균성 식민지의 수를 기록, 어떤 actinomycetes를 포함 하 여. 플레이트당 30-200개의 콜로니가 있는 플레이트만 계산합니다.
특정 개별 박테리아의 문화를 성장하려면, 잘 이웃 식민지에서 분리 된 식민지를 선택, 접시중 하나에서 개별 식민지를 선택합니다. 확산 루프를 살균한 다음 접시를 열고 루프를 빈 지점으로 터치하여 식힙니다. 다음으로, 루프에 관심의 식민지의 작은 금액을 선택합니다.
신선한 펩톤 효모 접시를 가지고, 한쪽에 몇 센티미터 길이의 줄무늬를 합니다. 살균하고 다시 식힌 다음 첫 번째 패스에서만 초기 연승을 가로지르는 연승을 만듭니다. 이 프로세스를 동일한 방식으로 두 번 더 반복합니다. 이 줄무늬 "희석"은 루프의 셀이 서로 분리되는 결과를 낳습니다. 2 주 동안 실온에서 배양하는 어두운 영역에 접시를 배치합니다.
세균성 및 액티노미세테 식민지 수에서 토양 1그램당 콜로니 포밍 유닛을 결정할 수 있습니다. 토양의 그램 당 식민지의 수는 접시에 계산 된 식민지의 수와 동일, 희석 도금의 상호에 의해 곱. 예를 들어, 46개의 식민지가 0.1mL 무분별한10-5의 희석 판에 계산되는 경우 토양 1그램당 CFU는 토양 그램당10-6 x 46 또는 4600만 CFUs와 같습니다.
세균성 수와 배양을 수행하는 것은 많은 과학적 조사 또는 프로토콜의 중요한 첫 번째 단계입니다.
건강한 토양은 그램 당 106과 108 박테리아 사이에 포함되어 있습니다. 토양의 세균 열거량은 관심있는 토양의 건강을 결정하는 데 사용할 수 있으며, 그램 당 106 및 108 박테리아의 수는 건강에 해롭거나 가난한 토양을 나타냅니다. 이것은 영양분 또는 유기물의 부족, 극단적인 토양 pH 때문에 abiotic 응력, 또는 토양 오염에 기인할 수 있습니다.
오늘날 의학에서 사용되는 많은 유형의 항생제는 토양 주거 박테리아 또는 곰팡이에서 처음 확인되었습니다. 토양 배양에서 순수한 긴장을 격리하는 것은 잠재적으로 과학자가 새로운 항생제 화합물을 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서, 관심의 시험 박테리아 또는 고립 된 화합물은 세균성 잔디로 재배 된 접시에 추가 될 수 있습니다., 그리고 기록 된 잔디 성장에 미치는 영향. 성장 테스트 박테리아 또는 화합물에 의해 억제 되었다 세균성 잔디에 명확한 패치 항생제 활동을 나타낼 수 있습니다.
완두콩과 콩을 포함한 콩 식물은 질소 고정 박테리아와의 공생 관계에 의존합니다. 이 박테리아는 토양 또는 루트 시스템의 목절 내에서 자유롭게 살고, 식물에 의해 활용 되는 질소 화합물을 생산. 가난한 토양에서, 토양에서 배양 질소 고정 박테리아와 콩 구 균 작물을 보충 식물의 성장과 건강을 높일 수 있습니다. 이것은 더 크고 단단한 식물을 초래할 수 있으며, 이는 더 큰 작물 수율을 제공합니다.
당신은 박테리아 열거에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이제 토양 샘플의 희석을 수행하는 방법, 식민지 계산 및 식민지 격리를 위해 플레이트하는 방법, 토양 샘플에서 박테리아수를 계산하는 방법을 이해해야합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
건조 중량 기준으로 수분 함량이 20%인 토양 10g 샘플은 희석 및 도금 기술을 통해 가능한 컬처 성 박테리아에 대해 분석됩니다. 희석은 표 1에표시된 대로 만들어졌습니다. 용액 의 1 mL은 적절한 배지에 도금되어 200 개의 박테리아 식민지를 초래합니다.
그러나, 습한 토양 10 g의 경우,
그러므로
| 걸음 | 희석 | |
| 토양 10g(중량/부피) | 95mL 식염수(용액 A) | 10-1 |
| 1 mL 솔루션 A(볼륨/볼륨) | 9mL 식염수(용액 B) | 10-2 |
| 1 mL 솔루션 B (볼륨 /볼륨) | 9 mL 식염수 (용액 C) | 10-3 |
| 1 mL 솔루션 C (볼륨 /볼륨) | 9mL 식염수(용액 D) | 10-4 |
| 1 mL 솔루션 D(볼륨/볼륨) | 9 mL 식염수 (솔루션 E) | 10-5 |
표 1: 샘플의 희석 및 도금.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
토양 박테리아의 희석 및 도금의 두 가지 기본 응용 프로그램이 있습니다. 첫 번째 응용 프로그램은 특정 토양 내에서 컬터 박테리아의 열거입니다. 토양 박테리아의 수의 정량화는 토양 건강의 표시를 제공합니다. 예를 들어, 토양 의 그램 당 존재하는 106 받는 사람은 108 culturable 박테리아가있는 경우, 이것은 건강한 숫자로 간주 될 것이다. 그램당106 미만의 숫자는 낮은 유기물 토양에서 발견되는 영양소부족으로 인한 토양 건강이 좋지 않은 것을 나타냅니다. 극단적 인 토양 pH 값 (pH < 5 또는 > 8)에 의해 부과 된 생물학적 스트레스; 또는 유기 또는 무기 인위적 오염 물질에 의해 부과 독성.
두 번째 주요 응용 프로그램은 박테리아의 순수한 문화의 시각화 및 격리입니다. 순수한 배양은 의료 또는 환경 응용 분야에서 유용할 수 있는 특정 특성에 대해 이후에 특성화되고 평가될 수 있다. 예는 다음과 같습니다: 항생제 생산; 독성 유기물의 생분해; 또는 완두콩이나 콩과 같은 콩 질 작물에 의한 질소 고정에 유용한 특정 뿌리 균.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
