Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Lab Animal Research

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

יסודות הרבייה והנגייה
 
Click here for the English version

יסודות הרבייה והנגייה

Overview

מקור: קיי סטיוארט, RVT, RLATG, CMAR; ואלרי א. שרודר, אר.די.ג'י, אר-אל-ג'י. אוניברסיטת נוטרדאם, IN

מיליוני עכברים וחולדות גדלים לשימוש במחקר ביו-רפואי מדי שנה. ברחבי העולם, ישנם מספר מתקני רבייה מסחריים גדולים המספקים עכברים למעבדות מחקר, אך מתקנים רבים בוחרים גם לגדל עכברים וחולדות בתוך הבית כדי להפחית עלויות ולהגדיל את אפשרויות המחקר. כאשר הרבייה במתקן בעלי החיים, החוקרים מסוגלים לתפעל את הגנטיקה של בעלי החיים, לתזמן את ההריונות כדי לענות על צרכי המחקר, ולעבוד עם עוברים ויילודים כנדרש.

עכברים וחולדות ניתן לגדל במגוון תוכניות ושיטות. נהלים טכניים, כגון שימוש בציטולוגיה וגינלית, הדמיה של אזור הנרתיק, ותצפית על תקעים מזדווגים, פותחו כדי לסייע בסנכרון הרבייה כדי להתאים לדרישות המחקר. כתב יד זה הוא סקירה של היסודות הבסיסיים של גידול עכברים וחולדות והליכים טכניים המשמשים. תיאורים מפורטים יותר של תוכניות הרבייה המורכבות, והתיאור המלא של השיטות לציטולוגיה וגינלית, זמינים ברשימת ההפניות.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

סוגים נפוצים של זנים ומלאי

עכברים וחולדות גדלים בדרך כלל כמלאי חוץ, זנים מלידה וזנים היברידיים. לבעלי חיים מלידה יש מאפיינים דומים, אך אינם זהים מבחינה גנטית. הם גדלים באופן אקראי כדי לשמור על הטרוזיגוסיות או שונות גנטית. לעומת זאת, בעלי חיים מלידה כבר crossbred עם לפחות 20 דורות של אח-אחות או צאצאי הורים והם הומוזיגוס גנטית. לבסוף, בעלי חיים היברידיים הם צאצאי ההזדווגות של שני זנים מלידה.

גורמים המשפיעים על התנהגות הרבייה

ישנם גורמים רבים שיכולים להשפיע על ביצועי הרבייה של עכברים וחולדות. המרץ של מגדלי נקבה תלוי במידה רבה ברמת הרבייה. בעלי חיים מלידה הם הרבה יותר קשים ונמרצים, ולכן הם מייצרים פסולת גדולה וחזקה יותר. כמה זנים נפוצים, כגון עכבר C57BL/6, להציג התנהגויות אגרסיביות שיכולות להפריע לרבייה. בעת גידול זן אגרסיבי, כל המלטה צריך להיות במדוקח. אין להשתמש בבעלי חיים מפסולת המכילה גורים אגרסיביים לרבייה. טמפרטורה, לחות ותנודות תאורה עלולות לגרום לירידה ביעילות הרבייה. רעש ותנודות בתוך חדרי הרבייה הוכחו גם כגורמים להשפעות מזיקות. שליטה במשתנים אלה בתוך מתקן הרבייה תמזער כמה השפעות. 1 בעלי חיים עם שינויים גנטיים נוטים להיות פחות קשוחים ופורים, וחלק מהמוטציות עלולות לגרום לקטלניות של הגורים לפני או זמן קצר לאחר הלידה.

ערכות רבייה

תוכניות רבייה דומות לעכברים וחולדות. מערכות נפוצות הן הזדווגות מונוגמית של נקבה אחת שגדלה להזדווגות זכרית או פוליגמית אחת של שתי נקבות או יותר שגדלו לזכר אחד. הן העכבר הנשי והן החולדה הם פוליאסטרוס ועוברים אסטרוס לאחר לידה כ 20-24 שעות לאחר parturition. במהלך estrus לאחר הלידה, הנקבה יכולה להרות המלטה. עבור זנים של עכברים או חולדות שיש להם תוחלת חיים פורייה קצרה עקב מוטציה גנטית, זה נפוץ להשאיר את הזכר בכלוב עם הנקבה, כך שהיא יכולה מיד להרות המלטה אחרת. תוכנית רבייה אינטנסיבית זו יכולה להיות מלחיצה את הנקבה, שכן היא מניקה ללא הרף וגסטטינג. תוכנית לא רגישה כרוכה בהפרדה של הנקבה ברגע שהיא בהריון גלוי; היא לא מוחזרת לכלוב של הזכר עד שהפסולת שלה ננגמה. מערכת זו היא הרבה פחות תובענית על הנקבה.

רבייה למטרות מניפולציה גנטית

בעלי חיים מהונדסים גנטית (GEAs) הם בעלי חיים נוקאאוט שהוסרו גנים מהגנום שלהם או בעלי חיים מהונדסים שנוספו לגנום שלהם. ה- GEAs גדלים אז כזן מלידה ולעתים קרובות גדלים עם GEAs אחרים כדי ליצור חיה מורכבת, מניפולציה גנטית עבור פרויקטי מחקר ספציפיים מאוד. תוכניות רבייה מורכבות משמשות ליצירת זנים עם כמה גנים הוסרו ואחרים הוסיף. מודלים של בעלי חיים להפרעות רבות הקשורות לגנים - כולל, אך לא מוגבל, מחלת אלצהיימר, סרטן, שבץ והפרעות דם אחרות, סוכרת, פיגמנטוס ברשתית - פותחו באמצעות הנדסה גנטית של בעלי חיים.

רוב תוכניות הרבייה יכולות להסתמך על גנטיקה מנדליאנית כדי לבצע תחזיות על יחסי גנוטיפ. כאשר עכבר סוג בר גדל עם עכבר עם גן אחד שונה (heterozygote), התוצאות הצפויות יהיו 50% חיות סוג בר ו 50% הטרוזיגוטים. עכבר סוג בר חצה עם עכבר עם שני גנים מותאמים (הומוזיגוטה) יגרום לכל הצאצאים להיות הטרוזיגוטים. כאשר שני בעלי חיים הטרוזיגוס נחצים, כל שלושת הגנוטיפים צריכים להיות נוכחים באחוזים הבאים: 25% סוג בר, 50% הטרוזיגוטים ו -25% הומוזיגוטים. מתוך ציפיות אלה ניתן לזהות גנים קטלניים עובריים (כלומר,אם לא מיוצרים צאצאים הומוזיגוטים).

Figure 1
איור 1. הזדווגויות ותוצאות אפשריות המבוססות על גנטיקה מנדליאנית. חיות סוג הבר אינן מהונדסות גנטית ומוגדרות כ-(+/+). לבעלי חיים הטרוזיגוס יש עותק אחד של גן שונה והם מוגדרים כ-(-/+); בעלי חיים הומוזיגוס יש שני עותקים של גן שונה והם מוגדרים כמו (-/-).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. המידע הדרוש בעת זיווג בעלי חיים כולל זן/מלאי של החיה המשתמשת במינוח תקין, תאריכי לידה עבור הזכר והנקבה המגדל, ותאריך ההתקנה. תיעוד מדויק הוא הכרחי עם מושבות רבייה.

2. קביעת מין של עכברים וחולדות נעשית על ידי השוואת המרחקים האנוגניטליים. אצל נקבות, המרחק בין פי הטבעת לבין איברי המין החיצוניים קצר יותר מאשר אצל גברים. נוכחותו של שק האשכים בבעלי חיים זכרים היא אינדיקטור מין נוסף.

3. בחירה והגדרת ערכת ההזדווגות

הערה: קיימות שתי ערכות הזדווגות שניתן להשתמש בהן.

  1. פרוטסטרוטס/estrus מתוזמן הזדווגות: שיטה זו מסתמכת על paring נקבות עם זכרים בנקודת פתיחות ופוריות מקסימלית.
    1. מחזור estrous חייב להיות במעקב אצל הנקבות או על ידי בדיקה חזותית של איברי המין החיצוניים עבור שינויים המעידים על בולטות ו estrous, או על ידי ציטולוגיה של הפרשות הנרתיק (ראה להלן).
    2. כאשר נקבה נקבעת להיות בבלט או אסטרוס, היא מזווגת עם זכר בסוף היום, כמו בעלי החיים בדרך כלל להזדווג בלילה.
    3. למחרת בבוקר נבדקת הנקבה לתקע מזדווג (ראה להלן). אם אין תקע, הנקבה יכולה להישאר עם הזכר במהלך היום ולבדוק תקע מזדווג בסוף היום. לחלופין, אם נקבע כי היא כבר לא בבלטות או estrus, היא מוסרת מכלוב הרבייה.
  2. הזדווגות מתוזמן אקראי: שיטה זו מבוססת על העובדה מחזור אסטרוס של מכרסמים הוא קצר מאוד, 4-5 ימים.
    1. עבור שיטה זו, ניתן להגדיר הזדווגות בכל עת, ולאחר מכן הנקבות נבדקות עבור תקעים הזדווגות בכל בוקר וערב עד תקע הוא ציין.
    2. נקבה מזווגת עם זכר בערב.
    3. היא נבדקת לתקע מזדווג בתחילתו ובסופו של כל יום עד לתצפית על תקע. בדרך כלל לוקח 3 ימים או יותר עד שניתן לראות תקע בעת שימוש בשיטה זו.

4. חיזוי הריון

מאז מישוש של גורים קשה עד מאוחר יותר במהלך ההריון, סביב היום 10-12, מערכות אולטרסאונד מסחרי עבור מכרסמים פותחו; עם זאת, מעט מתקני מחקר לבעלי חיים יש טכנולוגיה זו. לכן, הדמיה של תקעים מזדווגים, התבוננות בשינויים בנרתיק, או ציטולוגיה בנרתיק משמשים בדרך כלל כדי לסייע בחיזוי של כאשר נקבה הרתה המלטה (ראה להלן). עם זאת, אף אחת מהשיטות האלה לא מסוגלת לאשר הריון. ברגע תקע מזדווג הוא ציין, הנקבה צריכה להיות במעקב אחר סימנים של הריון, כגון עלייה במשקל.

5. קביעת שלב המחזור האסטרוס

  1. בדיקה חזותית
    הערה: עבור הזדווגות מתוזמנת של עכברים וחולדות, התבוננות חזותית של הנרתיק לשינויים המעידים על בולטות ואסטרוס היא השיטה המהירה ביותר לקביעת שלב המחזור האסטרוס, והיא אינה דורשת ציוד מיוחד.
    1. בעת הערכת מחזור estrous באמצעות השיטה החזותית, חשוב לבצע את הבדיקה החזותית באותו אזור ביחס לתאורת החדר, כמו מקור האור יכול לשנות את הצבע הנתפס של רקמות הנרתיק ולהקשות על ההערכה. לדוגמה, הגוון הסגול שמטיל נורות LED מקשה על זיהוי חזותי.
    2. כדי להעריך את השלב של מחזור estrous על ידי התבוננות חזותית, כל עכבר חייב להיות מרוסן באופן ידני על ידי הזנב, עם forepaws נח על מכסה כלוב.
    3. הפתיחה הנרתיקית של כל נקבה מוערכת על סמך מצב הרקמה המקיפה את אזור הנרתיק וגודל פתח הנרתיק. 2
      1. במהלך הבלטים, פתח הנרתיק רחב ומאופיין בנפיחות של הרקמה שמסביב. הרקמה ורודה בצבעה ומאוד לחה. לעתים קרובות יש קמטים או פסים לאורך הקצוות גב וגחון של הפתח.
      2. במהלך אסטרוס, הנפיחות של הרקמות המקיפות את פתח הנרתיק מופחתת, והרקמות אינן לחות וורודות.
      3. במהלך metestrus פתח הנרתיק הוא מינימלי ויש נפיחות זניחה.
      4. במהלך diestrus, אין נפיחות של הרקמות סביב אזור הנרתיק, ואת פתח הנרתיק הוא קטן וסגור.
  2. ציטולוגיה וגינלית
    כמו עכברים וחולדות הם polyestrous, אורך מחזור אסטרוס הוא קצר מאוד, החל 4-5 ימים. לפעמים יש צורך לזהות את כל ארבעת השלבים של אסטרוס: בולטות, אסטרוס, מטסטרו, ו diestrus. ציטולוגיה בנרתיק היא שיטה מדויקת מאוד כדי לקבוע את השלבים האלה. ישנן גם שתי שיטות של איסוף דגימות: השיטה הלא פולשנית של שטיפת נרתיק, ואת השיטה הפולשנית של תעלת הנרתיק.
    1. שטיפה בנרתיק
      1. החומרים הדרושים הם טיפים סטריליים 200 μl pipettes, נורות לטקס, מים מזוקקים כפולים סטריליים (ddH20), ומגלשות זכוכית נקיות.
      2. מניחים נורת לטקס בקצה קצה סטרילי של 200 מיקרול. צייר כ 100 μl של סטרילי ddH2O לתוך הפיפטה.
      3. הרם את העכבר מהכלוב, והצב אותה על ראש כלוב מוט התיל עם זנבה לעברך.
      4. תפוס בחוזקה את הזנב והרם את אחורי העכבר. לעכבר יהיו עכשיו רק כפות הרגליים הקדמיות אוחזות במכסה.
      5. אם העכבר משתין, המתן עד שהשתנה תיפסק. אם נשאר שתן בכניסה לתעלת הנרתיק, ניתן לשטוף את הפתח עם התזה קטנה של ddH2O. לשנות את הקצה ששימש לשטיפה.
      6. מניחים את קצה הקצה של ddH2O מלא קצה בפתיחת תעלת הנרתיק מבלי לחדור את הפתח.
      7. לדכא בעדינות את הנורה כדי לגרש רבע עד מחצית מנפח המים (~ 25-50 μl) בפתיחת תעלת הנרתיק. הנוזל ישאף באופן ספונטני לתעלה ללא החדרת קצה. שחררו לאט את הלחץ המופעל על הנורה. הנוזל ייסוג בחזרה לקצה.
      8. הימנע שחרור לחץ מהר מדי כדי למנוע שאיפה של נוזל לתוך הנורה. עצה מסוננת עשויה להיות שימושית למטרה זו.
      9. חזור על השלב הקודם 4-5 פעמים באמצעות אותו קצה, נורה ונוזל כדי להשיג מספר מספיק של תאים במדגם יחיד.
      10. מניחים את הנוזל על מגלשת זכוכית, ומאפשרים למרוח להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר.
      11. השתמש בצינור חדש עבור כל עכבר.
      12. לאחר יבש, כתמים אסטרוס אלה ניתן להכתים מיד או מאוחסן ומוכתם במועד מאוחר יותר. כתמי רייט-גימסה משמשים בדרך כלל להכתמת השקופיות. כתם זה זמין מסחרית ככתם של שלב אחד שאינו דורש קיבוע של השקופית כדי למנוע תאים לשטוף במהלך תהליך הכתמים. השקופית ממוקמת בכתם למשך 45-60 שניות, בהתאם להוראות היצרן.
      13. השקופיות נבדקות לאחר מכן תחת מיקרוסקופ, והתאים הנראים תואמים לשלב המחזור: 1) אם הנקבה נמצאת בבלטה, התאים נתפסים כאשכולות של תאי אפיתל עגולים ומצורמים היטב עם גרעין הכתים כהה יותר מהציטופלסמה; 2) אם הנקבה נמצאת באסטרו, רוב התאים הם תאי אפיתל קשקש קורנים חסרי גרעין, הם זוויתיים במראה, ומתרחשים באשכולות צפופים; 3) אם הנקבה נמצאת במטסטרוס, התאים הם בדרך כלל תאי דם לבנים (במיוחד נויטרופילים עם כמה תאי אפיתל קשקש מקורניים נוכחים) עם גרעינים מוכתמים כהה בצורת שתי נקניקיות המחוברות זו לזו; 4) במהלך diestrus, התאים הנוכחים הם בדרך כלל תאי דם לבנים עם המופע של כמה תאי אפיתל גרעין..
    2. גינה בנרתיק
      1. החומרים הדרושים הם אפליקטורים סטריליים עם קצה בקוטר 2 מ"מ, מגלשות מיקרוסקופ זכוכית נקיות ותחכוכי מלח פיזיולוגיים סטריליים.
      2. הרטוב אפליקטור עם קצה כותנה עם תמיסת מלח.
      3. הכנס את קצה המוליך לתוך הנרתיק של העכבר המאופק.
      4. תסתובב בעדינות ותגלגל את הקצה על דופן הנרתיק. הסר בזהירות את הספוגית.
      5. תאים מועברים למגלשת זכוכית יבשה על-ידי הזזת הספוגית על פני השקופית.
      6. ברגע שהמגלשה יבשה, ניתן להכתים אותה בכתם רייט-גימסה.
        ספוגית נחשבת להליך מלחיץ, וכאשר עכברים לחוצים יכולים לשבש מחזורי estrous. גירוי בנרתיק וב צוואר הרחם הנגרמת על ידי ספוגיות יכול לגרום פסאודו-פרופגניות. דגימות חוזרות ונשנות של רירית הנרתיק יכולות לגרום נזק אם לא מבוצעות בעדינות, עם איפוק נכון, ועם צמר גפן בגודל הנכון. 3,4

Figure 2
איור 2. ציטולוגיה בנרתיק - שלבים שונים של מחזור אסטרו מכרסמים

6. לדמיין תקע מזדווג

תקע זה מורכב נוזל נרתיקי וזרע, ונמשך בנרתיק במשך 12-24 שעות לאחר copulation. נוכחות התקע מאשרת הזדווגות, אך אינה מבטיחה שהנקבה בהריון. אם הנקבה המחוברת בהריון, היום הראשון של ההריון נחשב ליום לאחר שנמצא התקע.

  1. הרם את העכבר מתוך הכלוב והניח אותה על ראש כלוב מוט התיל עם זנבה לעברך.
  2. מקם את העכבר על ידי הפעלת לחץ ממש מעל הזנב כדי לקשת את הגב כדי לאפשר הצגה טובה יותר של פתח הנרתיק.
  3. שימו לב לפתיחה הנרתיקית שלה למסה לבנבנית. תקע ההזדווגות לא יכול להיות ברור מבחינה ויזואלית אבל ניתן לאשר עם השימוש של בדיקה קהה.
  4. באמצעות קצה הגשוש, הכנס אותו בעדינות לתוך פתח הנרתיק. נוכחות של תקע מזדווג תעכב את התקדמות הגשוש בטווח של 0.5 ס"מ מפתיחת הנרתיק.
  5. הבדיקה חייבת להיות מחוטאת באלכוהול ומיובשת לחלוטין לפני כל שימוש.

כמו הנקבה יש המלטה, תאריך הלידה, גודל המלטה, המספר שנולד, המספר נמות, היחס בין גברים: נקבות גורים, ואת היחס של הגנוטיפים צריך להיות מתועד כל. אם הגנוטיפים בתוך המלטה אינם תואמים את הגנוטיפים של ההורים, יש לבצע בדיקה חוזרת כדי לאמת את הגנוטיפ האמיתי.

7. גחם

ההיריון לעכברים וחולדות הוא כ-21 יום. הצעירים ננגמים בגיל 21-28 ימים. עכברים וחולדות כאחד יכולים להתרבות כבר בגיל 8 שבועות, ולכן זה הכרחי כי הגורים מופרדים על ידי מין בגיל צעיר. רבייה אינטנסיבית דורשת כי הגורים של כל המלטה להינגח ביום 20 כדי למנוע את הגורים המבוגרים מלהיות נוכחים כאשר המלטה הבאה נולדת. עבור רבייה לא מכוונת, הגורים ניתן להשאיר עם האם אחרי 20 ימים של גיל, לעתים קרובות עד 28 ימים של גיל. זה יכול להיות מועיל מאוד עבור זנים מהונדסים גנטית רבים, כמו הגורים לא יכול להיות נמרץ כמו חיות שאינן ngineered או סוג בר.

גורים זכרים ונקבות מופרדים בגניחה. במידת האפשר, גורים שננגמו לאחרונה לא צריכים להיות שוכנים בסינגל. אם המלטה מכילה רק גור אחד של מין נתון, יש לנסות לשכן את הגור הזה עם אחרים מאותו המין. אפשרויות דיור אפשריות הן: 1) גור יחיד יכול להישאר עם האם אם לא בכלוב רבייה אינטנסיבי; 2) גור יחיד נקבה או זכר עשוי להיות ממוקם עם גורים מאותו המין מפסולת אחרת באותו גיל; 3) אם ההורים הם זוג מונוגמי, ניתן להוציא את הנקבה מהכלוב כדי לאפשר גור זכר יחיד להיות מאוכסן עם האב; ו-4) גור זכר יחיד יכול להיות מאוכסן עם אחים נקבות עד גיל 5 שבועות. יש לאמת את מין הגורים שבוע לאחר ההפרדה כדי למנוע מהמלטות לא רצויות גורים מופרדים שלא כהלכה.

עכברים וחולדות גוממים צריכים להיבדק מדי יום כדי להבטיח שהם משגשגים. למרות המדריך לטיפול ושימוש של חיות מעבדה5 קובע כי מזון חייב להיות מוצג לבעלי החיים באופן כזה כדי למנוע ממנו להיות מלוכלך על ידי צואה ושתן, עכברים נמות לאחרונה צריך להיות מסופק כמות קטנה שלמזון (גלולה אחת לעכבר) להציב צלחת זכוכית (צלחת פטרי) על רצפת הכלוב. זה יעודד את בעלי החיים לעבור לאכול מכרסמים כמקור המזון היחיד שלהם. אפילו עבור בעלי חיים השוכנים על מתלים המספקים מים לכלובים באמצעות מערכת השקיה אוטומטית, ניתן להוסיף בקבוק מים לכלוב אם העכברים נראים מיובשים.

שם סוג מושבה תיאור
ICR מלידה לבקן
סוויס-וובסטר מלידה לבקן
Balb/c מלידה לבקן
FVB מלידה לבקן
C57BL/6 מלידה צבע מעיל שחור
C3H מלידה צבע מעיל חום
DBA/2 מלידה צבע מעיל חום/אפור
עירום אתימי (נו/נו) מלידה חסר שיער
SCID מלידה שילוב חמור של עכברים לקויי מערכת החיסון- צבעי מעיל שונים

טבלה 1. כתמי עכבר ומניות נפוצים.

שם סוג מושבה תיאור
ספראג-דולי מלידה לבקן
ויסטאר מלידה לבקן
פישר 344 מלידה לבקן
לואיס מלידה לבקן
לונג אוונס מלידה ברדס, שחור ולבן

טבלה 2. זנים ומניות חולדות נפוצים.

מיליוני עכברים וחולדות גדלים לשימוש במחקר ביו-רפואי מדי שנה, ומוסדות רבים בוחרים בכך כדי להפחית עלויות ולהגדיל את אפשרויות המחקר. היתרונות של הרבייה בתוך הבית הם, 1) חוקרים מסוגלים לתפעל את הגנטיקה של בעלי החיים באמצעות רבייה סלקטיבית 2) הם יכולים לתזמן הריונות כדי לענות על צרכי המחקר, ו -3) הם יכולים לעבוד עם עוברים ויילודים לפי הצורך. עם זאת, כדי להגדיר תוכנית רבייה מוצלחת, יש להבין את מחזור אסטרוס מכרסמים. בנוסף, הם צריכים להיות ידע על תוכניות ההזדווגות השונות, הגורמים המשפיעים על התנהגות גידול מכרסמים ושיקולי הגיגה... כל אלה יידונו במצגת וידאו זו.

בואו נתחיל עם סקירה של מחזור אסטרוס מכרסמים. הן חולדות נקבה ועכברים הם פוליאסטרוס, כלומר יש להם יותר ממחזור אסטרוס אחד בשנה או עונת רבייה. כל מחזור נמשך 4-5 ימים וניתן לחלקו ל -4 שלבים: מטסטרו, diestrus, בולט, ו estrus. Estrus הוא שלב הביוץ, כלומר, אם הנקבה נמצאת בשלב הבלטות או האנסטרו, היא מוכנה להרות.

אחת הדרך לקבוע את שלב המחזור האסטרוס היא על ידי בדיקה חזותית. לרסן את החיה באופן ידני על ידי הזנב ועם forepaws נח על מכסה כלוב בזהירות לבדוק את גודל פתח הנרתיק ואת הרקמה שמסביב. במהלך שלב הבלטים, פתח הנרתיק רחב ומאופיין בנפיחות של הרקמה שמסביב, שהיא ורודה בצבע לחה מאוד. לעתים קרובות יש קמטים או פסים לאורך הקצוות גב וגחון של הפתח. במהלך estrus, הנפיחות סביב פתח הנרתיק מופחתת ואת הרקמות אינן לחות וורודות. במהלך metestrus, פתח הנרתיק הוא מינימלי ויש נפיחות זניחה. במהלך diestrus, אין נפיחות של הרקמות סביב אזור הנרתיק ואת הפתח הוא קטן או סגור.

גישה נוספת, מדויקת יותר לקביעת שלב מחזור estrous היא ציטולוגיה בנרתיק שעבורה דגימות תאים נאספים על ידי שטיפה או ספוגה. עבור שטיפה, מניחים נורת לטקס בקצה קצה סטרילי של 200 מיקרוליטר ומציירים כ -100 מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים סטריליים לתוך הפיפטה. לאחר מכן, הרם את העכבר מתוך הכלוב והצב אותה על ראש כלוב מוט התיל עם זנבה לעברך. תפוס בחוזקה את הזנב והרים את אחורי העכבר כך שרק כפות הרגליים הקדמיות תופסות את המכסה. מניחים את קצה הקצה המלא בפתיחת תעלת הנרתיק מבלי לחדור את הפתח. לדכא בעדינות את הנורה כדי לגרש כ 25-50 microliters של מים בפתח הנרתיק. הנוזל ישאף באופן ספונטני לתעלה ללא החדרת קצה. שחררו לאט את הלחץ המופעל על הנורה והנוזל ייסוג בחזרה לקצה. חזור על הפעולה 4-5 פעמים באמצעות אותו קצה, נורה ונוזל כדי להשיג מספר מספיק של תאים במדגם יחיד. מניחים את הנוזל על מגלשת זכוכית, ומאפשרים למרוח להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר. לאחר יבש, כתמים אסטרוס אלה ניתן לאחסן לשימוש מאוחר יותר, או שהם יכולים להיות מוכתמים מיד באמצעות כתם רייט-Giemsa, שהוא כתם צעד אחד ואינו דורש קיבעון. השקופית ממוקמת בכתם למשך 45 עד 60 שניות.

מצד שני, עבור ספוגית, רטוב אפליקטור 2 מ"מ כותנה עם תמיסת מלח. הכנס את קצה המוליך לתוך הנרתיק של העכבר המרוסן וסובב בעדינות וגלגל את הקצה על דופן הנרתיק. לאחר מכן הסר את הספוגית בזהירות והעביר את התאים למגלשת זכוכית יבשה על-ידי גלגול הספוגית על פני השקופית. הליך זה נחשב מלחיץ ויכול לגרום נזק אם לא מבוצע בעדינות, עם איפוק נכון, ועם צמר גפן בגודל הנכון. כמו שטיפה, ברגע שהמגלשה יבשה, היא יכולה להיות מוכתמת בכתם רייט-ג'ימסה. לאחר הכתמים, ניתן לבדוק את השקופיות תחת מיקרוסקופ.

אם הנקבה נמצאת בבלטה, התאים נתפסים כאשכולות של תאי אפיתל עגולים, מעוצבים היטב, עם גרעין שמכתים כהה יותר מהציטופלסמה. אם היא נמצאת בשלב estrus, רוב התאים הם תאי אפיתל קשקש מקורניים שאין להם גרעין. הם זוויתיים במראה והם באשכולות צפופים. אם הנקבה נמצאת במטסטרוס, התאים הם בדרך כלל תאי דם לבנים, במיוחד נויטרופילים, עם כמה תאי אפיתל קשקש מקורניים נוכחים. במהלך diestrus, התאים הנוכחיים הם בדרך כלל תאי דם לבנים עם המופע של כמה תאי אפיתל גרעין.

עכשיו שיש לך הבנה של מחזור אסטרוס מכרסמים, בואו לדון כיצד להגדיר הזדווגות. הצעד הראשון הוא קביעת המין, אשר נעשה על ידי השוואת המרחקים anogenital. אצל נקבות, המרחק בין פי הטבעת לאיבר המין החיצוני קצר יותר מאשר אצל הזכרים. בהתבסס על צרכי המחקר ויעילות הרבייה של הזן, תוכנית ההזדווגות יכולה להיות מונוגמית -- שבה נקבה אחת גדלה לזכר אחד או פוליגמית --

במונחים של תזמון, בהתחשב בכך מחזור אסטרוס מכרסם הוא קצר רק 4-5 ימים ארוך אחד יכול להגדיר הזדווגות אקראית. או שהם יכולים להגדיר "הזדווגות מתוזמן", אשר כרוך בהצגת הנקבה לכלוב ההזדווגות כאשר היא נמצאת בנקודת פתיחות ופוריות מקסימלית - כלומר במהלך שלב הבליטה או האנסטרו. בכל מקרה, יש להגדיר את ההזדווגות בסוף היום, שכן מכרסמים הם ליליים ונוטים להזדווג בלילה. למחרת בבוקר, הנקבה נבדקת לתקע הזדווגות - מסה לבנבנית המורכבת מנוזל נרתיקי וזרע הנמשך 12-24 שעות לאחר ההזדווגות. אם תקע ההזדווגות אינו ברור מבחינה ויזואלית, הכנס בעדינות את קצה הבדיקה הבוטה לתוך פתח הנרתיק. נוכחות של תקע מזדווג תעכב את התקדמות הגשוש בטווח של 0.5 ס"מ מפתיחת הנרתיק. במקרה של הזדווגות אקראית, מראה תקע הזדווגות בדרך כלל לוקח שלושה ימים. נוכחות של תקע מאשר הזדווגות אינה מבטיחה כי הנקבה בהריון.

ברגע תקע מזדווג הוא ציין, הנקבה צריכה להיות במעקב עבור סימנים של הריון כגון עלייה במשקל. אם הנקבה המחוברת בהריון, אז היום שבו נמצא התקע הוא יום עוברי אפס או E0 ולמחרת נחשב ליום הראשון של ההריון, או E1, וכן הלאה ממש עד ללידה - שהיא בין 19 ל -21 ימים. כ 20-24 שעות לאחר הנפרד, הן חולדות ועכברים עוברים אסתר ויכולים להרות שוב.

בתכנית רבייה אינטנסיבית, אשר משמש בדרך כלל עבור בעלי חיים עם תוחלת חיים פורייה קצרה עקב מוטציה גנטית, בעלי החיים הזכרים נשארים בכלוב עם הנקבה והגורים, כך הנקבה יכולה להרות המלטה אחרת מיד. תוכנית זו יכולה להיות מלחיצה את הנקבה כפי שהיא ללא הרף מניקה gestating. להיפך, תוכנית הרבייה הלא אינטנסיבית, כוללת הפרדת הנקבה ברגע שהיא בהריון גלוי להפליא, ולא להחזיר אותה לכלוב של הזכר עד שהפסולת שלה ננגמה, מה שהופך את זה לתוכנית רבייה פחות תובענית.

ישנם גורמים רבים שיכולים להשפיע על ביצועי הרבייה של עכברים וחולדות. בואו נסקור כמה מהם, אשר עולים בתדירות גבוהה יותר. המרץ של מגדלי נקבה תלוי במידה רבה ברמת הרבייה. בעלי חיים מלידה הם הרבה יותר קשוחים ונמרצים, ולכן הם מייצרים פסולת גדולה וחזקה יותר. גורם נוסף שיכול להשפיע על ביצועי הרבייה הוא התנהגות אגרסיבית. כמה זנים נפוצים, כגון עכברי C57BL/6, יש נטייה להפגין תוקפנות, אשר יכול להפריע הרבייה. בעת גידול זן אגרסיבי, כל המלטה צריך להיות במדוקח. אין להשתמש בבעלי חיים מפסולת המכילה גורים אגרסיביים לרבייה. טמפרטורה, לחות ותנודות תאורה עלולות לגרום לירידה ביעילות הרבייה. רעש ותנודות בתוך חדרי הרבייה הוכחו גם כגורמים להשפעות מזיקות. בעלי חיים עם שינויים גנטיים נוטים להיות פחות קשוחים ופורים, וחלק מהמוטציות עלולות לגרום לקטלניות של הגורים לפני או זמן קצר לאחר הלידה.

עכשיו בואו נסקור בקצרה איך להקיא גורים של חיות המעבדה האלה. הזמן להתחיל לגנום שונה עם תוכנית הרבייה. במקרה של רבייה לא אינטנסיבית, הצעירים עשויים להינגח בגיל 21-28 ימים. אבל במקרה של רבייה אינטנסיבית, הגורים של כל המלטה נמות ביום 20 כדי למנוע מהגורים המבוגרים יותר להיות נוכחים כאשר המלטה הבאה נולדת. מאז מכרסמים יכולים להתחיל להזדווג צעיר כמו 8 שבועות, גורים זכר ונקבה מופרדים בגניחה. במידת האפשר, גורים שננגמו לאחרונה לא צריכים להיות שוכנים בסינגל.

אם המלטה מכילה רק גור אחד של מין נתון, יש לנסות לשכן את הגור הזה עם גורים מאותו המין מהמלטה אחרת. אפשרויות הדיור האפשריות לגיהם הניגמות מפורטות בכתב היד שלהלן. עכברים וחולדות גוממים צריכים להיבדק מדי יום כדי להבטיח שהם משגשגים. עבור אספקת מזון, כמות קטנה של מזון, גלולה אחת לעכבר, צריך להיות ממוקם על רצפת הכלוב במשך 7-10 הימים הראשונים, עם מזון נוסף בחלק העליון של הכלוב. זה יעודד את בעלי החיים לעבור לאכול מכרסמים כמקור המזון היחיד שלהם. לאספקת מים, יש להוסיף בקבוק גם אם בעלי החיים שוכנים על מתלים עם מערכת השקיה אוטומטית. זה כדי למנוע התייבשות.

לבסוף, בואו נראה כיצד מדענים משתמשים בגישת הרבייה הפנימית לטובתם. אחד היישומים הנפוצים ביותר של הגדרת הזדווגות הוא לפתח עכברים עם גנוטיפ שונה. כדי לחקור את תפקודו של גן, חוקרים לעתים קרובות לשבש את הקוד הגנטי שלה. עם זאת, בעלי חיים אלה כמו בני אדם הם diploid ולכן יש שני עותקים של אותו גן. לכן, על מנת לשבש את הגן לחלוטין, העכברים שהשתנו צריכים להיות bred כדי לייצר חיה עם שני העותקים מתפקדים, במילים אחרות הומוזיגוס נוקאאוט. עכברים עם עותק אחד לא מתפקד נקראים הטרוזיגוס או hets.

היתרון הנוסף בהקמת ההזדווגות הפנימית הוא בדיקת ההשפעה של חשיפה טרום הילודים לתרכובות בדיקה. לדוגמה, כאן החוקרים סיפקו לנקבה בהריון דיאטה נוזלית המכילה אלכוהול מ- E7 עד E13. ואז ב- E13, הם ניתחו את הנקבה ההרה, השיגו מוח עוברי, וחתכו אותם לחלקים דקים. לבסוף, כתמים של השקופיות גילו כי חשיפה לאלכוהול טרום לידתי הגדילה את המוות של התא ברקמה העצבית.

לבסוף, הרבייה הפנימית מאפשרת גם לחקור הפרעות לאחר ההריון כמו דיכאון לאחר לידה. במחקר זה, מדענים הרחיכו לראשונה את המלטה מהסכר במהלך תקופת ההנקה. ואז, 60 דקות מאוחר יותר, הציג מחדש את הגורים לסכר. כדי לגרום ללחץ אצל הנקבה, הוסיף פולש זכר חדשני לכלוב. לאחר מכן, החוקרים הבחינו בסכר לתוקפנות אימהית, הכוללת תקיפת ונשיכה של הזכר הפולש, כמו גם עבור התנהגויות טיפול אימהיות שונות כמו טיפוח גורים, והנקה. הנתונים שהתקבלו גילו כי ללחץ יש השפעה משמעותית הן על התוקפנות האימהית לאחר הלידה והן על הטיפול.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על יסודות הרבייה וגימוי עכברים וחולדות במעבדה. עכשיו אתה צריך להבין טוב יותר של מחזור estrus מכרסמים וגם יודע איך לקבוע את שלב המחזור וכיצד להשתמש בו כדי להגדיר תוכניות הזדווגות מוצלחות. סקרנו גם את הגורמים שיכולים להשפיע על התנהגות הרבייה, והסברנו כיצד ומתי להקיא עכברים וגורים חולדות. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מושבות הרבייה הפנימיות מציעות גמישות למחקר, במיוחד עם פרויקטים המשתמשים בעוברים או ביילודים. באמצעות טכניקות כגון הזדווגות מתוזמנת עם תקעים מזדווגים וציטולוגיה בנרתיק, ניתן לחזות בצורה מדויקת יותר את תאריך ההתעברות וההיריון. זה מאפשר לחוקרים לתכנן בקפידה רבה יותר את הניסויים שלהם. שליטה בגורמים סביבתיים כגון מחזורי אור, טמפרטורה, לחות ותנודות תייעל את תוצאות הרבייה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

References

  1. Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice. A Jackson Laboratory Resource Manual. http://ko.cwru.edu/info/breeding_strategies_manual.pdf.
  2. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., and Taft, R. A. 2012. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS One. 7, 1-5.
  3. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. 2012. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J. Vis. Exp. 67, e4389. doi:10.3791/4389.
  4. Mamrot, J., Pangestu, M., Walker, D., Gardner, D. K., and Dickerson, H. 2015. Confirmed dioestrus in pseudopregnant mice using vaginal exfoliative cytology improves embryo transfer implantation rate. Reproductive BioMedicine Online. 31. 538-543.
  5. Institute for the Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. Washington (DC): National Academies Press.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter