Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

ELISPOT-Test: Nachweis von IFN--Splenozyten

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Der enzymgebundene Immunospot, oder ELISPOT, Assay ist eine Methode, um die Immunantwort auf einen Erreger oder Zellschäden zu analysieren. Es ermöglicht die Quantifizierung der Aktivierung verschiedener Immunzellen durch den Nachweis bestimmter Proteine, die sie absondern. Beispielsweise wird ELISPOT häufig zur Messung von T-Zell-Antworten bei Exposition gegenüber einem fremden Antigen verwendet, indem sezernierte Zytokine erkannt werden.

Für einen auf Zytokin basierenden ELISPOT-Test beginnt der Prozess mit der Beschichtung einer ELISPOT-Mikroplatte mit einem Capture-Antikörper, der spezifisch für das Zielzytokin ist. Nach der Antikörperbeschichtung werden den Brunnen T-Zellen zugesetzt und durch einen externen Wirkstoff, wie z.B. Anti-CD3-Antikörper, stimuliert. Die Zellen sezernieren dann das Zielzytokin, das sofort durch den Capture-Antikörper immobilisiert wird. Da das Protein sofort nach der Sekretion aus lebenden Zellen ohne Verdünnung oder Abbau gefangen wird, hat dieser Test eine hohe Genauigkeit. Nachdem das Zielzytokin immobilisiert wurde, wird ein Detektionsantikörper hinzugefügt, der auch an das gefangene Zytokin bindet.

Die ELISPOT-Technik kann auch verwendet werden, um Gedächtnis-B-Zellen nach einer Infektion oder Impfung zu quantifizieren, indem ihre Produktion von spezifischen Antikörpern analysiert wird. In einem Antikörper-basierten ELISPOT wird ein spezifisches Antigen anstelle eines Antikörpers entweder für den Erfassungsschritt verwendet, bei dem das Antigen an die Platte gebunden wird, oder beim Detektionsschritt, bei dem das Antigen den Zielantikörper nach der Erfassung erkennt. In allen Variationen des Prozesses, bei T-Zellen oder B-Zellen, ist der Nachweisantikörper oder Antigen biotinyliert, was es ermöglicht, an ein Streptavidin-konjugiertes Detektionsenzym wie Meerrettichperoxidase zu binden. Dann wird nach Zugabe des Substrats der Peroxidase, AEC, ein dunkler, unlöslicher Niederschlag erzeugt. Dieser Niederschlag markiert die Position des gefangenen Proteins, und jede sekretorische Zelle ergibt einen sichtbaren Punkt, der mit einem ELISPOT-Reader oder einem Mikroskop quantifiziert werden kann. Die Größe der Flecken ist eine relative Schätzung der Menge an Protein, die von jeder Zelle abgesondert wird. Dieser Test kann Immunantworten von einzelnen Zellen erkennen, selbst in relativ kleinen Subpopulationen von sekretonischen Zellen, was es nützlich für die Untersuchung von Immunantworten auf zellulärer Ebene macht.

In diesem Video erfahren Sie, wie Sie einen ELISPOT-Test durchführen und dann die Flecken quantifizieren, die die Sekretorien darstellen.

Während des gesamten Experiments, sorgen Sie für sterile Bedingungen, indem Sie in einer laminaren Strömungshaube arbeiten und Handschuhe tragen.

Alle Berechnungen in diesem Protokoll basieren auf dem Volumen, das für eine 96-Well-Platte benötigt wird.

Verdünnen Sie zunächst den Antizytokin-Capture-Antikörper. Um dies zu tun, übertragen Sie 10 Milliliter Puffer in eine sterile 15 Milliliter konische Röhre. Verwenden Sie dann eine Pipette, um 10 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter monoklonalen Antikörper in den Puffer zu geben, um eine Lösung mit einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter zu erstellen. Als nächstes gießen Sie die Capture-Antikörperlösung in ein steriles Reservoir und verteilen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter in jeden Brunnen einer 96-Well-ELISPOT-Platte.

Bedecken Sie die Platte mit einer Plattenabdeckung, versiegeln Sie sie, um Verdunstung zu verhindern, und bebrüten Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag entdecken Sie die ELISPOT-Platte in der laminaren Strömungshaube. Um die Platte schnell auf sterile Tücher umzukehren, um die Capture-Antikörperlösung aus jedem Brunnen zu entfernen. Als Nächstes verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um jedem Brunnen 200 Mikroliter Zellkulturmedium hinzuzufügen. Dieser Schritt blockiert die unspezifische Bindung während des Testes. Ersetzen Sie die Plattenabdeckung und inkubieren Sie in einem 37 Grad Celsius Inkubator für zwei Stunden.

Während die Platte inkubiert, bereiten Sie eine 2X Mitogenlösung vor, indem Sie einen Mikroliter PMA und 20 Mikroliter Ionomycin zu 10 Milliliter Zellkulturmedium hinzufügen, um eine Endkonzentration von 15 Nanogramm pro Milliliter PMA und ein Mikromolarionomycin zu erreichen.

Zelluläre Suspensionen von Maus-Splenozyten sollten zu diesem Zeitpunkt auch in einer sterilen Haube zubereitet werden. Mit Einem Mikroskop und Hämozytometer messen Sie die Konzentration der Zellen und passen Sie das Gesamtvolumen an, bis eine Bestandskonzentration von zwei Millionen Zellen pro Milliliter erreicht ist.

Nach der Inkubation ist die Platte schnell auf sterile Tücher umgedreht, um das Zellkulturmedium aus jedem Brunnen zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 200 Mikroliter der vorbereiteten zellulären Suspensionsstocklösung in die Brunnen in der oberen Reihe der ELISPOT-Platte ein. Richten Sie das Experiment in dreifacher Ausfertigung ein, sodass jeder getestete Zelltyp in einen Satz von drei gruppierten Spalten eingeteilt wird. Darunter fügen Sie 100 Mikroliter einfache Zellkultur Medium zu den nächsten fünf Reihen der Platte, unter den Reihen mit zellulären Stock Lösung.

Als nächstes führen Sie eine serielle Verdünnung durch, indem Sie 100 Mikroliter der Zellsuspension aus der oberen Reihe in die Reihe direkt darunter pipetieren und die Lösung sanft nach oben und unten pipetieren, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die verbleibenden Zeilen, indem Sie bei jedem Schritt 100 Mikroliter von der vorherigen Zeile in die darunter stehende Zeile verschieben und fortfahren, bis die fünfte Zeile seriell verdünnt wurde. Lassen Sie die sechste Zeile nur mit zellkulturellem Medium, um als Kontrolle zu dienen. Um die Zellen in den experimentellen Brunnen der Platte zu stimulieren, fügen Sie 100 Mikroliter der vorbereiteten Mitogenlösung zu den zellulären Suspensionen in jedem Brunnen der Reihen eins bis fünf hinzu. Achten Sie darauf, die sechste Reihe, die als Kontrolle dienen wird, unstimuliert zu verlassen. Ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 für 24 bis 48 Stunden.

Bereiten Sie den verdünnten biotinylierten Antizytokin-Detektionsantikörper vor. Bereiten Sie zunächst 50 Milliliter Assay-Verdünnungsmittel vor, indem Sie 5 Milliliter 10% fetales Rinderserum zu 45 Milliliter PBS hinzufügen. Als nächstes verdünnen Sie den nachweisbaren Antikörper auf eine Konzentration von 2 Mikrogramm pro Milliliter in Assay-Verdünnungsmittel. Bereiten Sie zu diesem Zeitpunkt außerdem 20 bis 25 Milliliter Waschpuffer vor, indem Sie 0,05 % Tween-20 und PBS mischen.

Nachdem die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte und kehren Sie sie schnell um, um alle Flüssigkeit aus den Brunnen zu entfernen. Waschen Sie die Platte, indem Sie jedem Brunnen etwa 200 Mikroliter Waschpuffer hinzufügen. Vertreiben Sie diese Flüssigkeit, indem Sie die Platte schnell umkehren und über eine Spüle flicken. Wiederholen Sie diesen Vorgang vier weitere Male für insgesamt fünf Wähbe. Als nächstes fügen Sie 100 Mikroliter der verdünnten Detektions-Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu, ersetzen Sie den Deckel und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Nach der Inkubation die Detektions-Antikörperlösung aus den Plattenbrunnen vertreiben, indem Sie die Platte umkehren und über das Waschbecken flicken.

Waschen Sie die Platte wie bisher fünfmal mit Waschpuffer und vertreiben Sie die Flüssigkeit zwischen den einzelnen Waschanlagen. Nach der letzten Wäsche die Streptavidin- Meerrettich-Peroxidase-Lösung vorbereiten, indem Sie sie gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen. Als nächstes, mit den Brunnen der Platte leer, fügen Sie 100 Mikroliter verdünnt Streptavidin- Meerrettich Peroxidase Lösung zu jedem Brunnen. Legen Sie den Deckel wieder auf die Platte und brüten Sie bei Raumtemperatur für zwei Stunden.

Aktivieren Sie nach der Inkubation nicht mehr als 15 Minuten vor Gebrauch die vorgefertigte AEC-Substratlösung. Entsorgen Sie den Inhalt der Brunnen und waschen Sie den Teller fünfmal mit Waschpuffer, wie zuvor. Dann sofort 100 Mikroliter vorbereitete AEC Substratlösung in jeden Brunnen geben. Lassen Sie die Platte bei Raumtemperatur für etwa 10 bis 20 Minuten entwickeln, während die Spot-Entwicklung zu überwachen. Diese Flecken erscheinen als kleine, abgedunkelte Kreise auf der Oberfläche der Brunnen. Stoppen Sie dann die Reaktion, indem Sie die Platte mit Wasser abspülen und über das Waschbecken streicheln. Die Platte auf Papiertücher naugen und über Nacht oder bis zum Trocknen trocknen lassen. Das Entfernen der Kunststoffschale unter der Platte erleichtert das Trocknen. Nach dem Trocknen können die Spots mit einem automatisierten Plattenleser gezählt werden.

Hier wird der CTL ImmunoSpot Reader verwendet, aber dieses Protokoll kann für jeden Leser angepasst werden. Öffnen Sie dann das CTL-Programm und klicken Sie auf Scan Count. Drücken Sie den Auswurf für das Fach, um sich von der Maschine zu erstrecken. Entfernen Sie dann den Kunststoffadapter, und richten Sie Zeile A auf der ELISPOT-Platte und dem ADAPTER aus. Wählen Sie einen Dateinamen und Speicherort für die zu speichernde Datei aus, und laden Sie die Platte und den Adapter auf das Fach. Klicken Sie auf die Software laden und schließen Sie die Tür auf der Seite der Maschine. Drücken Sie dann Start after Counting. Stellen Sie sicher, dass die Datei gespeichert ist, und öffnen Sie dann die QC-Software Qualitätskontrolle, um die Daten zu analysieren und die Anzahl der Spots zu zählen. Exportieren Sie diese Daten als Excel-Datei. Sobald die Analyse abgeschlossen ist, klicken Sie auf Auswerfen, um die Platte abzurufen.

In diesem Experiment wurden Zellen von Wildtyp und tumortragenden Mäusen plattiert und auf IFN-Gamma analysiert. Beachten Sie, dass die Anzahl der Flecken mit abnehmender Zellkonzentration abnimmt. In der Regel werden ELISPOT-Daten als Anzahl der Spotzahlen pro Anzahl der plattierten Zellen dargestellt. In diesem Beispiel wurde die Anzahl der Spots in einem Balkendiagramm angezeigt, wobei die jeweilige Zellkonzentration auf der x-Achse aufgeführt ist. Beachten Sie, dass die Anzahl der Spots die Anzahl der aktivierten Zellen pro Gesamtzahl der Zellen in einer bestimmten Grundgesamtheit angibt.

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter