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ELISPOTアッセイ:IFN-γ分泌脾細胞の検出

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酵素結合免疫スポット、またはELISPOTアッセイは、病原体または細胞損傷に対する免疫応答を分析する方法である。それは彼らが分泌する特定のタンパク質を検出することによって異なる免疫細胞の活性化の定量化を可能にする。例えば、ELISPOTは、分泌されたサイトカインを検出することにより、外来抗原に曝露した際のT細胞応答を測定するために一般的に使用される。

サイトカインベースのELISPOTアッセイの場合、プロセスは標的サイトカインに特異的である捕捉抗体を用いたELISPOTマイクロプレートのコーティングから始まります。抗体コーティング後、T細胞をウェルに添加し、例えば抗CD3抗体のような外部薬剤によって刺激される。細胞は、その後、捕捉抗体によって直ちに固定化される標的サイトカインを分泌する。タンパク質は生細胞からの分泌後即座に捕捉されるので、希釈や分解を行うことなく、このアッセイは高精度です。標的サイトカインが固定化されると、検出抗体が追加され、捕捉されたサイトカインにも結合する。

ELISPOT技術は、特定の抗体の産生を分析することにより、感染またはワクチン接種後の記憶B細胞を定量化するためにも使用することができる。抗体ベースのELISPOTでは、抗体の代わりに特定の抗原が使用され、抗原がプレートに結合するか、検出ステップで抗原が標的抗体ポストキャプチャを検出します。プロセスのすべてのバリエーションにおいて、T細胞またはB細胞に対して、検出抗体または抗原はビオチン化され、ワサビペペキシダーゼなどのストレプトアビジン結合検出酵素に結合することを可能にする。そして、ペルオキシダーゼの基質を添加すると、AEC、暗く、不溶性の沈殿物が生成される。この沈殿物は、捕捉されたタンパク質の位置をマークし、各分泌細胞は、ELISPOTリーダーまたは顕微鏡を使用して定量することができる目に見えるスポットをもたらします。スポットの大きさは、各細胞から分泌されるタンパク質の量の相対的な推定値です。このアッセイは、分泌細胞の比較的小さな亜集団においても、単一細胞からの免疫応答を検出することができ、細胞レベルでの免疫応答の研究に有用である。

このビデオでは、ELISPOT アッセイを実行し、分泌細胞を表すスポットを定量する方法を学習します。

実験を通して、層流フードで働き、手袋を着用することによって無菌状態を保障する。

このプロトコルのすべての計算は、1つの96ウェルプレートに必要なボリュームに基づいています。

まず、抗サイトカイン捕捉抗体を希釈する。これを行うには、無菌の15ミリリットルの円錐形チューブにバッファの10ミリリットルを転送します。次に、ピペットを使用してモノクローナル抗体1ミリリットル当たり10マイクロリットルをバッファーに追加し、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度の溶液を作成します。次に、捕捉抗体溶液を無菌貯留槽に注ぎ、マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルELISPOTプレートの各ウェルに100マイクロリットルを分配する。

プレートカバーでプレートを覆い、蒸発を防ぐためにシールし、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、層流フードにELISPOTプレートを発見。プレートを滅菌ワイプに素早く反転させ、各ウェルから捕捉抗体溶液を除去します。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに200マイクロリットルの細胞培養培地を追加します。このステップは、アッセイ中に非特異的結合をブロックします。プレートカバーを交換し、37°Cのインキュベーターで2時間インキュベートします。

プレートがインキュベートされている間、1マイクロリットルのPMAと20マイクロリットルのイオノマイシンを10ミリリットルの細胞培養培地に加えて2倍のマイトゲン溶液を調製し、1ミリリットルPMAあたり15ナノグラムの最終濃度と1マイクロモルイオノマイシンを達成する。

マウス脾細胞の細胞懸濁液も滅菌フードでこの時点で調製する必要があります。顕微鏡と血球計を用いて細胞の濃度を測定し、1ミリリットル当たり200万個の細胞のストック濃度に達するまで総体積を調整する。

インキュベーションが完了したら、プレートを無菌ワイプに素早く反転させ、各ウェルから細胞培養培地を除去する。次に、ELISPOTプレートの一番上の行のウェルに、準備されたセルラー懸濁液ストック溶液の200マイクロリットルを追加します。テストを三つ三つ三つ三つに設定し、テストした各セルタイプが3つのグループ化された列のセットにメッキされます。この下に、100マイクロリットルのプレーン細胞培地をプレートの次の5列に加え、細胞ストック溶液を含む行の下に加える。

次に、セル懸濁液の100マイクロリットルを一番上の行から真下の行にピペッティングし、溶液を上下に優しく配管して細胞を均等に分配することによってシリアル希釈を行う。残りの行に対してこのプロセスを繰り返し、前の行から各ステップの下の行に 100 マイクロリットルを移動し、5 行目が連続的に希釈されるまで続けます。6列目を細胞培養培地のみで残し、コントロールとして機能させる。プレートの実験井戸内の細胞を刺激するために、準備されたマイトゲン溶液の100マイクロリットルを行1〜5の各ウェルの細胞懸濁液に加える。コントロールとして機能する6行目を刺激しないで残してください。蓋を交換し、プレートを摂氏37度、CO25%で24~48時間インキュベートします。

希釈されたビオチン化抗サイトカイン検出抗体を調製する。まず、PBSの45ミリリットルに10%のウシ血清の5ミリリットルを添加することにより、希釈アッセイの50ミリリットルを調製する。次に、検出抗体をアッセイ希釈剤で1ミリリットル当たり2マイクログラムの濃度に希釈する。また、このとき洗浄バッファーの20〜25ミリリットルを調製し、.05%のTween-20とPBSを混合して調製する。

インキュベーションが完了したら、プレートのキャップを外し、すぐに反転して井戸からすべての液体を除去します。各井戸に約200マイクロリットルの洗浄バッファーを追加してプレートを洗浄します。この液体を素早く反転させ、シンクの上にプレートをフリックして排出します。このプロセスをさらに 4 回繰り返し、合計 5 回の洗い流しを行います。次に、希釈検出抗体溶液の100マイクロリットルを各ウェルに加え、蓋を交換し、室温で2時間インキュベートする。インキュベーション後、プレートをシンク上に反転してフリックすることにより、プレートのウェルから検出抗体溶液を排出する。

前と同様に、洗浄バッファーでプレートを5回洗浄し、各洗浄の間に液体を排出する。最終洗浄後、製造元の指示に従って希釈してストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼ溶液を調製する。次に、プレートの井戸を空にして、希釈されたストレプトアビジン-ワサビ酸ペルオキシダーゼ溶液を各ウェルに100マイクロリットルを加える。蓋をプレートに戻し、室温で2時間インキュベートします。

インキュベーション後、使用の15分以内に、あらかじめ作られたAEC基板溶液を活性化する。井戸の中身を捨て、以前と同様に洗浄バッファーで5回洗浄します。次に、直ちに各ウェルに100マイクロリットルのAEC基板溶液を添加する。プレートを室温のままにし、スポットの発達を監視しながら約10~20分間開発します。これらのスポットは、井戸の表面に小さく暗い円として表示されます。その後、水でプレートをすすいで、シンクの上にそれをフリックすることによって、反応を停止します。ペーパータオルの上にプレートをブロットし、一晩または完全に乾燥するまで空気乾燥を可能にします。プレートの下のプラスチックトレイを取り外すと、乾燥が容易になります。乾燥後、スポットは自動プレートリーダーでカウントする準備ができています。

ここでは、CTL ImmunoSpotリーダーが使用されますが、このプロトコルは任意のリーダーに適合させることができます。次に、CTLプログラムを開き、スキャンカウントをクリックします。トレイのイジェクトを押して、マシンから伸ばします。次に、プラスチック製のアダプターを取り外し、ELISPOT プレートとアダプターの行 A を揃えます。ファイルを保存するファイル名と場所を選択し、プレートとアダプタをトレイにロードします。ソフトウェアのロードをクリックし、マシンの側面にあるドアを閉じます。次に、[カウント後に開始] を押します。ファイルが保存されていることを確認し、品質管理QCソフトウェアを開いてデータを分析し、スポットの数をカウントします。このデータを Excel ファイルとしてエクスポートします。解析が完了したら、[射出] をクリックしてプレートを取得します。

この実験では、野生型および腫瘍を有するマウスの細胞をめっきし、IFNガンマについて分析した。細胞濃度が低下するとスポット数が減少します。通常、ELISPOTデータは、めっきされたセル数あたりのスポット数として表示されます。この例では、スポットの数を棒グラフに表示し、それぞれの細胞濃度を X 軸に一覧表示しました。スポットの数は、特定の母集団内のセルの合計数あたりのアクティブ化されたセルの数を示していることに注意してください。

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