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Transfert de cellules adoptives : Présentation de splenocytes de souris de donneur à une souris hôte et évaluation du succès par l'intermédiaire de FACS

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Le transfert de cellules adoptives est une méthode pour introduire des cellules d'intérêt dans un organisme. C'est une technique puissante pour étudier divers mécanismes biologiques, y compris l'action de classes spécifiques de cellules immunitaires. En outre, le transfert adoptif est un nouveau traitement prometteur pour de nombreuses affections, telles que celles nécessitant des greffes de moelle osseuse ou des traitements contre le cancer où les propres lymphocytes T d'un patient peuvent être extraits, modifiés pour reconnaître et détruire les cellules cancéreuses, et puis retourné au corps pour combattre des tumeurs.

En laboratoire, les modèles animaux sont souvent utilisés pour étudier le transfert adoptif. Par exemple, les souris Koilloutées CD45.1 Rag gamma-c n'ont pas de récepteurs fondamentaux pour de nombreuses cytokines, qui sont essentielles à la différenciation normale des cellules souches hématopoïétiques en lymphocytes. En conséquence, les souris knock-out ont un développement de lymphocytes compromis et n'ont pas de tueur naturel, ou NK, cellules, lymphocytes T, ou B-cellules.

Le transfert d'adoption peut être employé pour introduire les cellules immunitaires manquantes dans ces souris compromises, en récoltant d'abord le tissu de souris de distributeur contenant des concentrations élevées des cellules immunitaires, telles que la rate. Le tissu est ensuite dissocié et une variété de cellules de la rate, y compris les cellules immunitaires, sont isolées. Ensuite, les érythrocytes indésirables, ou globules rouges, peuvent être lysed par l'ajout de l'ammonium chlorure de potassium lysing tampon et les globules blancs restants, ou splenocytes, sont ensuite séparés des débris cellulaires en utilisant centrifugation.

Enfin, les splenocytes purifiés sont injectés dans les souris immunodéprimées, facilitant les études détaillées des fonctions de ces cellules. Plusieurs jours plus tard, le succès du transfert de cellules immunitaires adoptives peut être confirmé par l'isoler et la préparation des splenoncytes de l'hôte de la même manière que le tissu du donneur. Ensuite, ces cellules sont tachées à l'aide d'anticorps étiquetés contre les marqueurs des cellules immunitaires du donneur afin qu'ils puissent être vérifiés et triés à l'aide de FACS.

Pour commencer, mettez des gants de laboratoire et l'équipement de protection approprié. Ensuite, lavez une paire de forceps et disséquez les ciseaux d'abord avec un détergent, puis avec 70% d'éthanol, puis séchez-les avec un essuie-tout propre. Préparer 50 millilitres de Hank's Balanced Salt Solution, ou HBSS, avec 2% de sérum de veau fœtal, ou FCS, en combinant un millilitre de FCS avec 49 millilitres de HBSS dans un tube de 50 millilitres. Mélanger en pipeting doucement la solution vers le haut et vers le bas environ 10 fois.

Disséquez la souris euthanasiée et retirez sa rate comme démontré dans la technologie FACS de protocole vidéo de JoVE pour la séparation splénique de lymphocytes DeB. Pour isoler les cellules immunitaires, placez d'abord la rate sur une passoire à cellules de 40 micromètres dans un plat de pétri. Écraser la rate avec un piston pour la dissocier dans le plat. Récupérer les cellules adhérentes en rinçant le piston et la passoire avec 1 millilitre de HBSS 2% FCS. Ensuite, pipette la rate dissociée et le liquide de la boîte de Pétri dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Laver le plat de Petri avec 5 millilitres de HBSS 2% FCS et transférer le liquide dans le tube de 15 millilitres.

Centrifuger le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius, puis récupérer le tube avec soin afin de ne pas déranger la pastille. Maintenant, retirez le supernatant sans déranger la pastille et jetez le liquide dans un contenant de déchets approprié. Ensuite, ajoutez deux millilitres de chlorure d'ammonium de potassium tampon de lysation au tube de centrifugeuse et pipette de haut en bas pour resuspendre la pastille et lyser les érythrocytes. Attendez deux minutes, puis ajoutez HBSS 2% FCS à la pastille remise en suspension pour obtenir une valeur totale de 14 millilitres. Répétez la centrifugation. Récupérer le tube soigneusement et jeter le supernatant. Ensuite, resuspendre la pastille en 5 millilitres HBSS 2% FCS par pipetting de haut en bas. Ensuite, comptez les cellules en suspension. Ajouter cinq microlitres de trypan bleu à cinq microlitres de suspension cellulaire et bien mélanger par pipetting. Ensuite, déposez délicatement une goutte de cinq microlitres de suspension cellulaire diluée entre le verre de couverture et la glissière Malassez. Avec le microscope réglé à 40X grossissement, compter le nombre de cellules. Ajuster la concentration cellulaire à 10 aux sept cellules par millilitre en ajoutant le volume approprié de HBSS 2% FCS.

Pour commencer le transfert adoptif, transférer deux millilitres de la suspension cellulaire à un tube de collecte de cinq millilitres. Centrifuger le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius, puis jeter le supernatant. Ensuite, resuspendre la pastille en deux millilitres de phosphate tamponné saline et centrifuger le tube à 370 fois g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius. Jetez le supernatant. Ensuite, resuspendre la pastille dans 200 microlitres de phosphate tamponné saline. À l'aide d'une seringue de 0,5 millilitre avec une aiguille de calibre 29, injectez 200 microlitres de suspension cellulaire dans la souris expérimentale par voie intraveineuse dans le sinus sanguin rétro-orbital.

Quatre jours après le transfert d'adoption, euthanasiez les souris et enlevez les rates. Ensuite, récoltez les cellules immunitaires telles que décrites dans la section trois. Ensuite, transférer 100 microlitres de suspension cellulaire de chaque souris dans deux tubes FACS étiquetés contrôle et transféré. Centrifuger les tubes à 370 fois g pendant sept minutes à 10 degrés Celsius, puis jeter les supernatants. Maintenant, préparez un mélange contenant les quatre anticorps à la dilution indiquée dans le tableau un. Ajouter 100 microlitres du mélange à chaque tube, puis couver pendant 20 minutes sur la glace dans l'obscurité. Ensuite, ajoutez un millilitre de HBSS 2% FCS à chaque tube, puis centrifugez les tubes à 370 fois g pendant trois minutes à 10 degrés Celsius. Jetez les supernatants, puis resuspendre les granulés dans 200 microlitres de HBSS 2% FCS. Transférer les cellules suspendues dans de nouveaux tubes FACS étiquetés. Maintenant, utilisez la cytométrie de flux comme indiqué dans le protocole FACS pour évaluer la présence de CD45. 2 lymphocytes positifs.

Maintenant, nous allons déterminer la présence de lymphocytes CD45.2 qui ont été isolés du CD45. 1 rate hôte. Pour commencer, cliquez deux fois sur l'icône FlowJo et faites glisser les fichiers pour chaque tube dans la fenêtre de l'échantillon. Ensuite, double clic sur le fichier transféré pour afficher les cellules enregistrées à partir de cet échantillon sur une parcelle de point qui affiche la diffusion vers l'avant FSCA sur l'axe X et la diffusion latérale SSCA sur l'axe y. Cliquez sur le polygone pour faire le tour des populations de lymphocytes. Une nouvelle fenêtre d'identification du sous-population apparaît. Cliquez sur OK. Maintenant, fixez l'axe y à FSC-W et l'axe x à FSC-A. Sélectionnez la population de cellules individuelles avec l'outil de polygone comme précédemment démontré.

Ensuite, double clic sur la population encerclée pour créer une nouvelle fenêtre pour les cellules sélectionnées. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez CD45.2 sur le Y et le CD45.1 sur l'icône X. Cliquez sur l'icône T et personnalisez l'axe pour agrandir l'intrigue. Ensuite, cliquez sur le polygone pour encercler les cellules positives CD45.2. Dans la fenêtre d'identification de la sous-population, nommez vos cellules transférées par la population cellulaire et cliquez sur OK. Dans la même fenêtre, cliquez sur rectangle pour sélectionner les cellules négatives CD45.2. Dans la fenêtre d'identification de la sous-population, nommez les cellules hôtes de votre population cellulaire et cliquez sur OK. Ensuite, double clic sur la population encerclée CD45.2, population transférée, pour créer une nouvelle fenêtre pour les cellules sélectionnées. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez CD3 sur le Y et le CD4 sur le X.

Ensuite, cliquez sur le polygone pour encercler les cellules positives CD4 CD3. Dans cette fenêtre d'identification de sous-population, nommez votre population cellulaire transférée cellules CD4. Ensuite, répétez les étapes d'analyse précédentes avec le fichier de souris de contrôle. Enfin, pour visualiser vos populations cellulaires, cliquez sur Layout Editor. Faites glisser les cellules transférées et la population de cellules CD4 transférées des fichiers transférés et de contrôle dans l'onglet Rédacteur de mise en page. Une parcelle de point représentant les cellules positives CD45.2 et les lymphocytes CD4 apparaîtra. CD45. 2 cellules transférées ne doivent apparaître que dans la parcelle de point de souris transférée.

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