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Cultivos de enriquecimiento: Cultivo de microbios aeróbicos y anaeróbicos en medios selectivos y diferenciales

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Las bacterias son capaces de habitar casi todos los ambientes de la Tierra, desde la tundra desértica hasta las selvas tropicales. Esta capacidad de colonizar nichos muy diferentes se debe a su adaptabilidad y gran diversidad metabólica, lo que les permite utilizar una amplia variedad de moléculas para la generación de energía. Es esta enorme variedad de diversidad lo que conduce al fenómeno que menos del 1% de las especies bacterianas en el planeta se consideran culturables y estas sólo son posibles debido a una comprensión de sus necesidades metabólicas y ambientales específicas.

Realizar manipulaciones de medios y medio ambiente en el laboratorio no sólo permite a los investigadores experimentar para encontrar las condiciones óptimas para el cultivo de una especie de interés, sino que también permite el enriquecimiento, el proceso de las condiciones cambiantes para seleccionar para especies específicas de un cultivo mixto. Algunas especies microbianas son generalistas y capaces de tolerar una amplia variedad de estados o ambientes. Estos organismos pueden crecer fácilmente en condiciones de laboratorio, pero también se les puede impedir que crezcan si se les da un hábitat extremo, lo que puede ayudar si el objetivo es enriquecer para los organismos de un cultivo mixto que son tolerantes a esta condición.

Los organismos fastidiosos pueden ser culturables, pero sólo cuando se cumplen condiciones específicas. Las especies de Neisseria o Haemophilus, por ejemplo, requieren medios que contengan glóbulos rojos parcialmente descompuestos y una alta concentración de dióxido de carbono, lo que también puede desalentar el crecimiento de otras especies. Los extremófilos son nombrados por su preferencia por condiciones extremas, tales como temperaturas muy bajas o altas, condiciones reducidas o ausentes de oxígeno, o en presencia de alta sal. Estas condiciones son probablemente intolerables para la mayoría de los otros microbios.

Para enriquecer aún más para un organismo de interés, algunos tipos de medios contienen indicadores que dan una idea del metabolismo del organismo. El agar sal de manitol inhibe el crecimiento de organismos sensibles a la sal alta. Las bacterias Gram negativas típicamente no pueden sobrevivir, pero el género Gram positivo Staphylococcus es capaz de prosperar. Además, el agar MSA indica cualquier colonia capaz de fermentar manitol porque los subproductos ácidos de fermentación convertirán el indicador rojo metilo en los medios de comunicación a un amarillo brillante. Esto puede permitir una selección más específica de una especie.

Otro medio de enriquecimiento común, Eosin Methylene Blue, contiene tintes azules de eosina y metileno, que son tóxicos para los organismos gram positivos. También contiene lactosa y bacterias en estas placas que pueden fermentar esto producirá ácidos que reducen el pH fomentando la absorción del tinte. Estas colonias toman grandes cantidades de pigmento y aparecen oscuras y metálicas. En este laboratorio, crecerá cuatro organismos de prueba diferentes a través de tres condiciones de medios diferentes y luego en condiciones aeróbicas versus anaeróbicas antes de observar su desarrollo.

Antes de comenzar el experimento, lávese bien las manos y séquelas, antes de ponerse guantes de laboratorio de tamaño adecuado. Luego, esterilizar la superficie de trabajo con 5% de lejía, limpiándola a fondo. A continuación, tome un lazo inoculante estéril y colóquelo en un matraz vacío de 125 mililitros para que no toque la superficie del banco. Luego, del refrigerador, recoge cuatro platos de Agar sal Mannitol, o MSA, cuatro placas de agar azul de eosina metileno, EMB y ocho placas de agar de soja tríptico, o TSA. El medio TSA es un medio de crecimiento no selectivo que se utilizará para las dos condiciones ambientales diferentes. Por último, reúna sus culturas de interés en un estante de tubo. Aquí, Se cultivará Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermisy Proteus vulgaris.

Para empezar, encienda un quemador Bunsen, que se utilizará para esterilizar las herramientas. A continuación, coloque una placa MSA, una placa EMB y dos placas TSA cerca de la mano. A continuación, seleccione uno de los cultivos bacterianos. Inoculará las cuatro placas con la primera cultura. Con la mano libre, coge el bucle inoculante y luego esteriliza en la llama del quemador hasta que brille de color naranja durante un par de segundos. Deje que el bucle se enfríe en el aire. A continuación, abra el tubo de cultivo de caldo y flamee rápidamente la abertura. Sumerja el lazo en el cultivo y luego raye el organismo en el primer cuadrante de la primera placa. A continuación, la llama esterilizar el bucle de nuevo y rayar el segundo cuadrante. Repite esta acción de esterilización de llamas y luego raya para completar el tercer y cuarto cuadrante. El rayado de esta manera debe dar colonias aisladas y también permitir la confirmación de que el cultivo no está contaminado.

Ahora, reemplace la tapa y etiquete la parte inferior de la placa con el nombre de la bacteria, el tipo de medio, la fecha y sus iniciales. A continuación, repita el revestimiento de rayas utilizando el mismo cultivo bacteriano para cada una de las tres placas restantes teniendo cuidado de etiquetarlas cada vez. Ahora que el primer cultivo ha sido rayado, repita estos pasos para que las otras bacterias obtengan una placa MSA inoculada, una placa EMB y dos placas TSA para cada especie. Una vez que todos los organismos han sido transferidos, llama el bucle una última vez.

Para determinar qué organismos pueden crecer en un entorno de oxígeno reducido, abra un sistema de cámara de gas sellado y coloque un conjunto de cuatro placas de bacterias DelaT en su interior. A continuación, coloque un sobre de condición anaeróbica en la cámara y séllelo firmemente. Finalmente, coloque todas las placas, incluidas las que están dentro del sistema de cámara de gas sellado, en una incubadora de 37 grados Celsius durante la noche. En el futuro, comprobar las placas cada 24 a 48 horas para dar a las colonias tiempo para crecer y metabolizar cualquier indicador reactivos.

Para evaluar qué tan bien respondieron las diferentes especies bacterianas a cada condición de crecimiento, primero examine las placas para el crecimiento y registre qué especies fueron capaces de producir colonias en cada tipo de medio y en la condición anaeróbica versus aeróbica. Tenga en cuenta el color de los organismos que crecen, así como los tamaños y la forma de las colonias.

El medio de agar sal de manitol es selectivo para organismos gram positivos que son capaces de sobrevivir en 6. 5% de cloruro de sodio. En este experimento, esto significó que el gramo negativo E. coli y P. vulgaris no crecieron debido a las altas concentraciones de sal. S. epidermis y S. aureus fueron capaces de crecer, sin embargo, confirmando que son gram positivos. Además, hay una clara diferencia entre las dos especies porque el S. aureus es capaz de fermentar manitol convirtiendo el indicador rojo metilo en los medios a un amarillo brillante debido a los subproductos ácidos de la fermentación. Esto no se vio en el caso de S. epidermis.

El medio EMB, por otro lado, es selectivo para los organismos gram negativos porque los tintes azules de eosina y metileno son tóxicos para las células gram positivas. La membrana externa de bacterias gram negativas evita que estos dedos tóxicos entren en las células, lo que significa que son capaces de crecer. Además, este medio indica si la especie bacteriana presente es capaz de fermentar la lactosa. Aquí, las colonias de E. coli se tornan de color púrpura oscuro, a veces con un brillo metálico verde que indica la fermentación. P. vulgaris crece en este medio pero no fermenta lactosa y así aparece un ligero rosado a púrpura por estar en presencia del tinte. En la condición anaeróbica, las especies bacterianas en los medios de la TSA todavía deben crecer, pero pueden hacerlo muy mal en comparación con aquellos con amplio oxígeno. Esto se debe a que ninguna de las especies de ensayo son anaerobios obligatorios.

Experimentos como este para enriquecer el entorno de crecimiento pueden ayudar a favorecer y aislar una especie específica de una muestra mixta. También pueden ayudar a determinar las condiciones óptimas de crecimiento para diferentes especies bacterianas en un entorno de laboratorio, ayudando así a la investigación adicional.

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