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斑块测定:确定病毒性皮石为斑块形成单位(PFU)的方法
 

斑块测定:确定病毒性皮石为斑块形成单位(PFU)的方法

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噬菌体,也称为噬菌体,是专门感染细菌的病毒,我们可以确认它们的存在,并使用一种称为斑块测定的工具对其进行量化。噬菌体首先附着在细菌细胞壁上并注射其遗传物质,从而感染其易感宿主。然后,他们劫持细胞的生物合成机械来复制他们的DNA并产生许多后代噬菌体颗粒,然后通过解说和杀死宿主细胞释放这些粒子。

这种溶性活性是广泛使用的噬菌体枚举技术的基础,称为斑块测定或双琼脂层测定。在这里,噬菌体混合物首先在含有低浓度琼脂的熔融营养汤中制备。混合物中使用的所有细菌都应在生长的日志阶段保持活力并积极分裂,这将确保大部分细菌是活的,并能够在斑块周围形成密集的草坪。接下来,这种熔融细菌-噬菌体琼脂混合物分布在更固体,浓缩的琼脂营养介质,已经凝固在培养皿。在室温下孵育时,低浓度的琼脂-噬菌体汤也会凝固成柔软的琼脂覆盖物。

在这里,细菌细胞可以从底层获得额外的营养,并应迅速繁殖,产生细菌的汇流草坪。然而,由于噬菌体颗粒也存在于软层中,这些颗粒会感染和复制细菌内的遗传物质,最终导致细胞变热,从而释放多个后代。这些噬菌体后代然后感染邻近的细胞,因为细菌-噬菌层的半固态限制其运动到距离较远的宿主细胞。这种感染和莱沙循环持续多轮,在局部地区杀死大量细菌。邻近细胞被破坏的效果是产生一个圆形的透明区域,称为斑块,肉眼可以看到,有效地放大噬菌体的细菌溶酶活性,并使其枚举。

培养皿上的斑块数量称为斑块形成单位,或PFUs,如果初始噬菌体浓度足够稀释,应直接对应于原始样品中感染性噬菌体颗粒的数量。该技术还可用于表斑块形态的表征,帮助识别噬菌体类型,或分离噬菌体突变体。在本实验中,您将学习如何以大肠杆菌的T7噬菌体为例,为枚举噬菌体执行斑块测定。

首先,确定适合培养宿主细菌细胞和噬菌体的介质。在这里,乳原肉,或LB培养,用于培养大肠杆菌和T7噬菌体。接下来,取三个干净的玻璃瓶,并标记他们与媒体,名称,然后第一个作为LB-Broth,第二个作为LB-底部阿加,第三作为LB-Top阿加。现在,在三组中称量四克预配方的 LB 粉末,然后将一套称重干燥介质转移到每个瓶子中。将200毫升水加入第一瓶。使用磁性搅拌棒混合内容物。

然后,使用pH计和不断搅拌,通过添加氢氧化钠或盐酸,使最终pH达到7.4。对其余两个瓶子也重复加水和pH调整。现在,称量三克的琼脂粉,并添加到第二瓶,使一个1.5%的底部琼脂。最后,称量1。2 克琼脂,并添加到第三瓶,使 0.6% LB 顶部琼脂。瓶中的汤条件不需要添加琼脂。将瓶子半紧封盖,然后通过在121摄氏度的高压灭菌器对介质进行消毒20分钟。完成后,从高压灭菌器中取出介质瓶,并立即拧紧瓶盖以将其完全关闭,以防止污染。将 LB-Broth 和 LB-Top Agar 介质放在长凳上,以便日后使用。将 LB-底部 Agar 放在预设约 45 摄氏度的水浴中冷却。

当 LB-底部琼脂达到约 45 摄氏度时,将其转移到工作台上。接下来,使用 70 % 异醇对工作区进行消毒。接下来,在熔融底部琼脂中加入450微升无菌一摩尔氯化钙,最终浓度为2.25毫摩尔。轻轻旋转瓶子混合。然后,设置七个干净的培养皿。将每道菜的底部贴上介质名称和准备日期的标签。然后,将 15 毫升的底部琼脂倒入七个培养皿中。让板在室温下设置几个小时或过夜。一旦设置,培养板可以存储在四摄氏度,如果需要几天,倒置,以尽量减少冷凝。在测定前一小时将培养皿从4摄氏度的冰箱转移到37摄氏度的培养箱。

在预成型前一天,应培养大肠杆菌。在这里,10微升大肠杆菌培养被接种成10毫升的LB-Broth。将细菌放在160RPM下设置为37摄氏度的摇动培养箱中过夜。然后,在测定当天,从培养箱中取出细菌培养物。播种新鲜10毫升的新鲜LB汤与0.5毫升的过夜文化。将这些细胞置于160RPM下,生长成37摄氏度的摇动培养箱。接下来,使用分光光度计检查此培养体何时达到对数相增长,光学密度为 0.5 到 0.7。一旦OD达到这个水平,通过将细胞培养转移到工作台来停止孵育。它们现在可用于噬菌体覆盖测定。

噬菌体在不同噬菌体类型和样品之间可能呈指数变化。因此,为了有效地计数它们,它们应该被稀释,以产生广泛的噬菌体浓度。在测定当天,采用10倍稀释技术,产生一系列从十分之一到百万分之一浓度不等的噬菌体稀释剂。为了获得统计显著性和准确性的数据,在三元化中执行连续稀释。

接下来,使用微波熔化凝固的 LB-top 琼脂。然后,将其放入预设在 45 摄氏度的水浴中一小时。一小时后,从孵化器收集含有底部琼脂层的培养皿。用噬菌体浓度和测定日期标记盘子。然后,设置七个干净的试管。用串行噬菌体稀释编号标记每个试管,并指定一个作为控制。

当 LB 顶琼脂达到 45 摄氏度时,将其转移到工作台。现在,在200毫升的琼脂中加入450微升的一个摩尔氯化钙,最终浓度为2.25毫摩尔。轻轻旋转瓶子混合。接下来,在无菌锥形管中加入35毫升的LB顶琼脂和4毫升的细菌悬浮液。轻轻旋转以均匀分布细胞,但避免晃动,以防止发泡。

现在,将五毫升的这种细菌顶琼脂混合到七个试管中。然后,将100微升的连续稀释噬菌体样品和控制介质(应为无噬菌体)转移到贴有尊重标签的试管中。轻轻旋转混合物,以确保正确混合。轻轻地将五毫升噬菌体混合物转移到各自的Petri板上。通过轻轻旋转 Petri 板,均匀地将混合物均匀地铺过整个表面。

一旦所有 Petri 板都与混合层分层,通过在室温下孵育 15 分钟,使顶层凝固。完成这些步骤后,使用剩余的两组噬菌体稀释法重复第二套和第三套培养皿的过程。用副膜密封每道菜,并在室温下孵育15分钟。将培养板倒置在适当的温度下 24 小时或直到斑块形成。在这里,板被放置在37摄氏度的培养箱一天,一个刺激生长条件的大肠杆菌和T7噬菌体。

根据细菌种类、孵育条件和介质的选择,在孵育一至五天后会出现斑块。在这里,在37摄氏度的孵育一天后,斑块就可见了。首先检查标有控制的板,并确保这些板块中未形成斑块,因为这将表示病毒污染。要确定原始样品中的噬菌体,请首先从包含最稀释的噬菌体样本的板开始,在不取下盖子的情况下对斑块进行计数,并标记它们以指示哪些已经计数。对每组每个板重复计数。有些盘子的斑块可能太多或太少,无法计数。将 10 到 150 视为理想的斑块计数。

接下来,生成一个表,列出不同稀释和复制的斑块数值。然后,计算包含理想斑块计数数的稀释板的平均斑块数值。在此示例中,这些是 10 到负 3 和 10 到负 4 稀释板中形成的斑块的平均数量。现在,通过将获得的均值斑块值除以相应的噬菌体稀释因子来调整噬菌体稀释系数。在这里,形成到10到负3和10到负4稀释板的平均斑块数,被它们各自的稀释因子除以,以获得100微升噬菌体混合物中的斑块形成单位(PFUs)的数量。要将该值转换为每毫升的 PFU,请将生成的值乘以 10,因为噬菌体覆盖制备步骤中仅使用了 100 微升的噬菌体稀释混合,从而产生 10 的额外稀释系数。最后,计算从不同稀释板中获得的值的平均值。这将给出每毫升 PFUS 的平均数量。PFUs 的数量对应于原始样本中感染性噬菌体颗粒的数量。

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