Plaque-Assay: Eine Methode zur Bestimmung des Virustiters als Plaque bildende Einheiten (PFU)

Bakteriophagen, auch Phagen genannt, sind Viren, die gezielt Bakterien infizieren, und wir können ihre Anwesenheit bestätigen und sie mit einem Werkzeug namens Plaque-Assay quantifizieren. Bakteriophagen infizieren ihre anfälligen Wirte, indem sie sich zuerst an der bakteriellen Zellwand anheften und ihr genetisches Material injizieren. Dann entführen sie die biosynthetische nalytokische Maschinerie der Zelle, um ihre DNA zu replizieren und zahlreiche Nachkommen-Phagenpartikel zu produzieren, die sie dann durch Lysing und Tötung der Wirtszelle freisetzen.

Diese lytische Aktivität ist die Grundlage einer weit verbreiteten Phagen-Enumerierungstechnik, die als Plaque-Assay oder Doppel-Agar-Schicht-Assay bekannt ist. Hierbei wird zunächst eine Bakteriophagenmischung in einer geschmolzenen Nährwertbrühe mit niedrigkonzentriertem Agar hergestellt. Alle Bakterien, die in der Mischung verwendet werden, sollten lebendig sein und aktiv in der Protokollphase ihres Wachstums teilen, was sicherstellt, dass ein großer Prozentsatz der Bakterien lebensfähig ist und in der Lage ist, einen dichten Rasen um die Plaques herum zu bilden. Als nächstes wird diese geschmolzene bakterielle Agarmischung über ein festeres, konzentrierteres Agar-Nährstoffmedium verteilt, das bereits auf einer Petrischale verfestigt ist. Bei inkubationstemperatur verfestigt sich auch die niedrigkonzentrierte Agar-Phagen-Bakterienbrühe zu einem weichen Agar-Overlay.

Hier können die Bakterienzellen zusätzliche Nährstoffe aus der unteren Schicht ableiten und sollten sich schnell vermehren, um einen konfluenten Rasen von Bakterien zu produzieren. Da jedoch phagenpartikel auch in der weichen Schicht vorhanden sind, werden diese ihr genetisches Material innerhalb der Bakterien infizieren und replizieren, was in einer Zelllyse gipfelt, die mehrere Nachkommen freisetzt. Diese Phagennachkommen infizieren dann die benachbarten Zellen, da der halbfeste Zustand der Bakterien-Phagenschicht ihre Bewegung auf weiter entfernt eitel gelegene Wirtszellen beschränkt. Dieser Zyklus von Infektion und Lyse setzt sich über mehrere Runden fort und tötet eine große Anzahl von Bakterien in einem lokalisierten Gebiet. Die Wirkung der benachbarten Zellen zerstört werden, ist es, eine einzige kreisförmige klare Zone zu produzieren, genannt eine Plaque, die mit dem bloßen Auge gesehen werden kann, effektiv verstärken die bakterielle lytische Aktivität des Phagens und ermöglicht ihre Aufzählung.

Die Anzahl der Plaques auf einer Petrischale wird als Plaque-Forming Units oder PFUs bezeichnet und sollte, sofern die anfängliche Bakteriophagenkonzentration ausreichend verdünnt war, direkt der Anzahl der infektiösen Phagenpartikel in der ursprünglichen Probe entsprechen. Diese Technik kann auch zur Charakterisierung der Plaquemorphologie, zur Identifizierung von Phagentypen oder zur Isolierung von Phagenmutanten verwendet werden. In diesem Labor erfahren Sie, wie Sie den Plaque-Test zur Aufzählung von Phagen durchführen, indem Sie als Beispiel den T7-Phagen von E. coli verwenden.

Identifizieren Sie zunächst ein geeignetes Medium für die Kultivierung der Wirtsbakterienzellen und des Bakteriophagens. Hier wurde Lysogeny Brühe, oder LB Medium, verwendet, um E. coli und den T7 Phagen zu kultur. Als nächstes nehmen Sie drei saubere Glasflaschen und beschriften sie mit Medien, Namen, und dann die erste als LB-Broth, die zweite als LB-Bottom Agar, und die dritte als LB-Top Agar. Jetzt wägen Sie vier Gramm vorformuliertes LB-Pulver in drei Sätzen ab und übertragen Sie dann einen Satz gewogener getrockneter Medien in jede Flasche. Fügen Sie 200 Milliliter Wasser in die erste Flasche. Mischen Sie den Inhalt mit einem magnetischen Rührbalken.

Dann, mit einem pH-Meter und ständigem Rühren, bringen Sie den endgültigen pH-Wert auf 7,4 durch Zugabe von Natriumhydroxid oder Salzsäure. Wiederholen Sie die Wasserzugabe und pH-Einstellung für die anderen beiden verbleibenden Flaschen. Jetzt wiegen Sie drei Gramm Agarpulver und fügen Sie es der zweiten Flasche hinzu, um einen 1,5 % unteren Agar zu machen. Schließlich wiegen 1. 2 Gramm Agar und fügen Sie es auf die dritte Flasche, um die .6 % LB Top Agar zu machen. Der Brühezustand in der Flasche eins braucht keine Agarzugabe. Die Flasche halbfest verschließen und dann die Medien sterilisieren, indem Sie 20 Minuten lang bei 121 Grad Celsius autoklavieren. Nach dem Abschluss die Medienflaschen aus dem Autoklaven entfernen und die Flaschenverschlüsse sofort verdrehen, um sie vollständig zu schließen, um eine Kontamination zu verhindern. Halten Sie die LB-Broth und LB-Top Agar Medien für den späteren Gebrauch auf der Bank. Legen Sie den LB-Bottom Agar in einem Auflagenbad von ca. 45 Grad Celsius abkühlen.

Wenn der LB-Bottom Agar etwa 45 Grad Celsius erreicht, überträgt er ihn auf die Arbeitsbank. Als Nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethenol. Als nächstes fügen Sie 450 Mikroliter steriles ein molares Calciumchlorid in den geschmolzenen Bodenagar, um eine endgültige Konzentration von 2,25 Millimolar zu machen. Mischen Sie die Flasche vorsichtig zum Mischen. Dann legen Sie sieben saubere Petri-Gerichte. Beschriften Sie jedes Gericht auf der Unterseite mit dem Mediennamen und dem Zubereitungsdatum. Dann gießen Sie 15 Milliliter des unteren Agars in jedes der sieben Petri-Gerichte. Lassen Sie die Platten für ein paar Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur einstellen. Einmal gesetzt, können die Kulturplatten bei Bedarf mehrere Tage bei vier Grad Celsius gelagert werden, um die Kondensation auf den Kopf zu stellen. Übertragen Sie die Petri-Gerichte vom Vier-Grad-Kühlschrank auf einen 37 Grad Celsius-Brutkasten eine Stunde vor dem Assay.

Am Tag vor dem Assay sollte der E. coli kultiviert werden. Hier wurden 10 Mikroliter E. coli-Kultur in 10 Milliliter LB-Broth geimpft. Platzieren Sie die Bakterien, um über Nacht in einem schütteren Inkubator zu wachsen, der auf 37 Grad Celsius bei 160 RPM eingestellt ist. Dann, am Tag des Assays, entfernen Sie die Bakterienkultur aus dem Brutkasten. Samen Sie eine frische 10 Milliliter frische LB Brühe mit 0,5 Milliliter der Übernachtungskultur. Platzieren Sie diese Zellen, um zu einem schüttelnden Inkubator zu wachsen, der bei 160 RPM auf 37 Grad Celsius eingestellt ist. Als Nächstes verwenden Sie ein Spektralphotometer, um zu überprüfen, wann diese Kultur das Wachstum der Logphase erreicht, was durch eine optische Dichte von 0,5 bis 0,7 angezeigt wird. Sobald die OD diese Ebene erreicht hat, stoppen Sie die Inkubation, indem Sie die Zellkultur auf die Bank übertragen. Sie sind nun bereit, für Phagen-Overlay-Assay verwendet zu werden.

Phage-Titers können exponentiell zwischen verschiedenen Phagentypen und -proben variieren. Um sie effektiv zu zählen, sollten sie verdünnt werden, um eine breite Palette von Phagenkonzentrationen zu erzeugen. Am Tag des Assays, erzeugen Eine Reihe von Phagen verdünnungen von einem Zehntel bis ein Millionstel Konzentrationen, nach einer 10-fachen Verdünnungstechnik. Um statistisch signifikante und genaue Daten zu erhalten, führen Sie die serielle Verdünnung in Dreifacharbeit durch.

Als nächstes schmelzen Sie den erstarrten LB-Top-Agar mit einer Mikrowelle. Dann legen Sie es in ein Wasserbad, das bei 45 Grad Celsius für eine Stunde voreingestellt ist. Nach einer Stunde die Petri-Gerichte mit der unteren Agarschicht aus dem Brutkasten sammeln. Beschriften Sie die Platten mit Phagenkonzentration und Assay-Datum. Legen Sie dann sieben saubere Reagenzgläser auf. Beschriften Sie jedes Reagenzglas mit der serienmäßigen Phagenverdünnungsnummer und benennen Sie eines als Steuerung.

Wenn der LB-Top-Agar 45 Grad Celsius erreicht, überträgt er ihn auf die Arbeitsbank. Fügen Sie nun 450 Mikroliter eines Molaren-Calciumchlorids in den 200-Milliliter-Agar ein, um eine Endkonzentration von 2,25 Millimolar zu erreichen. Mischen Sie die Flasche vorsichtig zum Mischen. Als nächstes fügen Sie 35 Milliliter LB-Top-Agar und vier Milliliter bakterielle Suspension zu einem sterilen konischen Rohr hinzu. Wirbeln Sie sanft, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, aber vermeiden Sie Schütteln, um Schaumbildung zu verhindern.

Nun, aliquot fünf Milliliter dieser Bakterien-Top-Agar-Mischung zu jedem der sieben Reagenzgläser. Dann übertragen Sie 100 Mikroliter der seriell verdünnten Bakteriophagenproben und Kontrollmedien, die einfach Medien ohne Bakteriophagen sein sollten, auf die respektvoll beschrifteten Reagenzgläser. Wirbeln Sie die Mischung vorsichtig, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Fünf Milliliter Bakteriophage-Mischung vorsichtig auf die jeweilige Petriplatte geben. Gleichmäßig die Mischung über die gesamte Oberfläche verteilen, indem sie sanft die Petriplatte wirbeln.

Sobald alle Petriplatten mit der Mischung geschichtet sind, erlauben Sie eine Erstarrung der obersten Schicht, indem Sie bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren. Nach Abschluss dieser Schritte wiederholen Sie den Prozess für den zweiten und dann den dritten Satz der Petrischalen mit den verbleibenden zwei Sätzen von Phagen verdünnungen. Versiegeln Sie jede Schale mit Parafilm und brüten Bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Stellen Sie die Kulturplatte 24 Stunden lang bei einer geeigneten Temperatur auf den Kopf oder bis sich Plaques entwickeln. Hier wurden Platten für einen Tag in einem 37 Grad Celsius Inkubator platziert, eine stimulierende Wachstumsbedingung für E. coli und den T7-Phagen.

Plaques erscheinen nach ein bis fünf Tagen Inkubation, abhängig von der Bakterienart, Inkubationsbedingungen und der Wahl des Mediums. Hier waren Plaques nach einem Tag der Inkubation bei 37 Grad Celsius sichtbar. Beginnen Sie, indem Sie die gekennzeichneten Platten kontrollieren und sicherstellen, dass keine Plaques in diesen Platten gebildet wurden, da dies auf eine Viruskontamination hinweisen würde. Um den Phagen-Titer in der Originalprobe zu bestimmen, beginnen Sie zuerst mit den Platten, die die am meisten verdünnte Phagenprobe enthalten, und zählen Sie die Plaques, ohne die Deckel zu entfernen, und markieren Sie sie, um anzugeben, welche bereits gezählt wurden. Wiederholen Sie die Zählung für jede Platte in jedem Satz. Einige Platten haben möglicherweise zu viele oder zu wenige Plaketten, um gezählt zu werden. Betrachten Sie 10 bis 150 als ideale Plaquezahl.

Generieren Sie als Nächstes eine Tabelle mit den Plaquenummernwerten für die verschiedenen Verdünnungen und Replikationen. Berechnen Sie dann die mittleren Plaquezahlenwerte für die Verdünnungsplatten, die die ideale Anzahl von Plaqueanzahlen enthielten. In diesem Beispiel handelte es sich um die durchschnittliche Anzahl der Plaques, die in der 10 bis minus drei und 10 zu den minus vier Verdünnungsplatten gebildet wurden. Passen Sie nun den Phagenverdünnungsfaktor an, indem Sie die erhaltenen mittleren Plaquewerte durch die jeweiligen Phagenverdünnungsfaktoren dividieren. Hier bei, die durchschnittliche Anzahl der Plaques, die zu den 10 bis minus drei und 10 zu den minus vier Verdünnungsplatten gebildet wurden, wurden durch ihre jeweiligen Verdünnungsfaktoren geteilt, um die Anzahl der Plaquebildenden Einheiten oder PFUs in 100 Mikroliter Phagengemisch zu erhalten. Um den Wert in PFU pro Milliliter umzuwandeln, multiplizieren Sie die erzeugten Werte mit 10, da während des Bakteriophagen-Overlay-Vorbereitungsschritts nur 100 Mikroliter Phagenverdünnungsmischung verwendet wurden, wodurch ein zusätzlicher Verdünnungsfaktor von 10 erzeugt wurde. Berechnen Sie schließlich den Durchschnitt der Werte, die aus den verschiedenen Verdünnungsplatten ermittelt werden. Dadurch wird die durchschnittliche Anzahl der PFUs pro Milliliter angibt. Die Anzahl der PFUs entspricht der Anzahl der infektiösen Phagenpartikel in der Originalprobe.