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Transformación de células de E. coli mediante un procedimiento de cloruro de calcio adaptado
 

Transformación de células de E. coli mediante un procedimiento de cloruro de calcio adaptado

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Las bacterias son notablemente adaptables y un mecanismo que facilita esta adaptación es su capacidad para tomar moléculas externas de ADN. Un tipo de ADN que las bacterias pueden tomar se llama plásmido, una pieza circular de ADN que con frecuencia contiene información útil, como genes de resistencia a antibióticos. El proceso de modificación de bacterias por nueva información genética incorporada de una fuente externa se conoce como transformación. La transformación se puede realizar fácilmente en el laboratorio utilizando Escherichia coli, o E. coli.

Para ser transformados, las células de E. coli deben ser obligadas primero, lo que significa ser capaces de tomar moléculas de ADN de su entorno. El protocolo para lograr esto es sorprendentemente simple, una incubación corta de las células en una solución de cloruro de calcio. Esta incubación hace que las células se vuelvan permeables a las moléculas de ADN. Después de que las células son peletadas por centrifugación, se extrae el sobrenadante. El ADN plásmido ahora se añade a las células competentes. Después de incubar las células con ADN, la mezcla se calienta brevemente a 42 grados Celsius, seguido de un enfriamiento rápido en el hielo. Este choque térmico hace que el ADN se transfiera a través de la pared y las membranas de la célula. Las células se incuban en medios frescos. Luego, las bacterias se colocan a 37 grados para permitirles volver a sellar sus membranas y expresar proteínas resistentes.

Esas células que han tomado en los plásmidos copiarán fielmente el ADN y lo transmitirán a su progenie y expresarán cualquier proteína que pueda ser codificada por él, incluidos los mediadores de resistencia a los antibióticos. Esos genes de resistencia se pueden utilizar como marcadores seleccionables para identificar bacterias que se han transformado con éxito porque las células que no han tomado el plásmido no expresarán el producto del gen de resistencia. Esto significa que cuando las células están chapadas en un medio sólido que contiene el antibiótico apropiado, sólo las células que han tomado el plásmido crecerán. La transformación de las células en una colonia en crecimiento se puede confirmar aún más mediante el cultivo de esas células en medios líquidos durante la noche para aumentar el rendimiento antes de extraer el ADN de la muestra. Una vez que el ADN está aislado, se puede llevar a cabo una enzima de restricción diagnóstica. Debido a que las enzimas de restricción cortan el ADN en lugares predecibles, ejecutar estos digeridos en un gel debe mostrar un patrón predecible si el plásmido deseado se transformó con éxito. Por ejemplo, si pUC19 está preparado y cortado con la enzima de restricción HindIII, se debe ver una sola banda de 2686 nucleótidos en el gel.

En este laboratorio, transformará la cepa de E. coli DH-5 Alpha con pUC19, y luego confirmará la transformación exitosa por electroforesis de gel de ADN.

Antes de iniciar el procedimiento, ponte el equipo de protección personal adecuado, incluyendo una capa de laboratorio y guantes. A continuación, esterilizar el espacio de trabajo con 70% de etanol.

Ahora, prepare células químicamente competentes depositando un bucle lleno de bacterias en una placa de agar LB estéril y rayando las bacterias con un nuevo lazo. Luego, incubar la placa a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, esterilizar la parte superior del banco con 70% de etanol de nuevo, y retirar la placa de la incubadora.

Inocular una sola colonia bien aislada en 3 mililitros de caldo LB en un tubo con un lazo estéril. Luego, hacer crecer el cultivo a 37 grados centígrados durante la noche, con temblores a 210 RPM. Al día siguiente, medir la densidad óptica del cultivo nocturno con un espectrofotómetro. Luego, agregue 100 mililitros de caldo LB a un matraz de un litro, e inocularlo con el cultivo nocturno a una densidad óptica de 0. 01. Ahora, incubar la cultura a 37 grados centígrados con temblores, y comprobar el OD600 cada 15 a 20 minutos hasta que el cultivo alcance la fase de crecimiento medio exponencial.

Después de aproximadamente tres horas, transfiera 50 mililitros del cultivo a dos botellas de polipropileno heladas. Luego, vuelva a colocar las botellas en hielo durante 20 minutos para enfriarlas. A continuación, recupere las células a través de la centrifugación. Deseche los supernatantes y coloque las botellas boca abajo sobre una toalla de papel. A continuación, resuspenda el pellet bacteriano en cinco mililitros de solución de cloruro de magnesio de cloruro de calcio en frío y gire cuidadosamente hasta que el pellet se haya disuelto por completo. A continuación, agregue otros 25 mililitros de la solución al pellet bacteriano disuelto. Resuspenda el otro pellet bacteriano como se ha demostrado anteriormente. Después de esto, repita la centrifugación y retire los sobrenatantes.

Si las células competentes van a ser transformadas directamente, resuspenda cada pellet bacteriano en dos mililitros de una solución de cloruro de calcio de 0,1 molar es 0,1 hielo girando los tubos cuidadosamente. Para comenzar el procedimiento de transformación, transfiera 50 microlitros de células competentes a dos tubos de polipropileno de 1,5 mililitros etiquetados. Luego, agregue un microlitro de ADN plásmido pUC19 a uno de los tubos. Mezclar suavemente, evitando la formación de burbujas, e incubar ambos tubos durante 30 minutos sobre hielo. Después de la incubación, transfiera los tubos a un bloque de calor e incubar a 42 grados centígrados durante 45 segundos. Transfiera inmediatamente los tubos al hielo e incubar durante dos minutos. Ahora, agregue 950 microlitros de medios SOC a cada tubo e incubarlos durante una hora a 37 grados Celsius para permitir que las bacterias se recuperen, y exprese el marcador resistente a los antibióticos codificado en el plásmido.

Para hacer una dilución de 1 a 100, agregue 990 microlitros de medios SOC y 10 microlitros de suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros. Luego, hacer una dilución de 1 a 10 mediante la adición de 900 microlitros de medios SOC y 100 microlitros de suspensión celular a un tubo de 1.5 mililitros. A continuación, placa 100 microlitros de las suspensiones celulares diluidas y 100 microlitros del control negativo, en placas selectivas separadas que contienen ampicilina utilizando un esparcidor e incubar las placas a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas. Después de la incubación, cuente las unidades formadoras de colonias, o UFC, por placa, obtenidas a través de la transformación, y registre estos datos. Para verificar que los transformadores tienen el plásmido pUC19, elija una sola colonia bien aislada de una placa con un lazo estéril, e introdúzcalo en un tubo que contenga 3 mililitros de caldo LB. Luego, incubar la cultura a 37 grados centígrados con temblores, de la noche a la mañana. Al día siguiente, utilice un mini kit de preparación de ADN para aislar el ADN de 3 mililitros del cultivo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de completar la mini preparación del ADN, digiere el 1 microgramo de pUC19 purificado con una enzima de restricción a 37 grados Celsius durante 1 hora. Ahora, cargue 20 microlitros de una escalera de peso molecular, 1 microgramo de ADN de plásmido digerido y 1 microgramo de ADN plásmido no digerido en pozos consecutivos de un gel de agarosa del 1% que contiene 1 bromuro de etidio de microgramo por mililitro. A continuación, ejecute el gel durante 1 hora a 95 voltios. Por último, visualice el gel con un iluminador UV.

En este experimento, E. coli DH5 Alpha se prepararon células químicamente competentes utilizando una adaptación del procedimiento de cloruro de calcio, y luego se transformaron con el plásmido pUC19 para determinar la eficiencia de transformación. Para calcular la eficiencia de transformación, utilice los recuentos de UFC registrados para las diluciones 1 de cada 100 y 1 en 10, y cualquier otra dilución con CFU cuenta entre 30 y 300. En primer lugar, el recuento de UFC registrado, 246 en este ejemplo, se divide por la cantidad de ADN, .0001 microgramos aquí, que fue chapado. A continuación, este número se divide por el factor de dilución utilizado para dar la eficiencia de transformación en UFC por microgramo. En este ejemplo, se utilizó una dilución de 1 a 10 y se chaparon 100 microlitros de una solución de 1 mililitro, lo que le da un factor de dilución final de 0,01. En el carril plásmido no digerido, el ADN circular puede aparecer como dos o tres bandas diferentes de brillo variable. Esto se debe a que el ADN circular sin cortar puede existir en varios estados de conformación diferentes, como supercoiled, círculo abierto, o más lineal, y cada uno de estos se mueve nalto a través del gel a diferentes velocidades. El análisis de la digestión del ADN plásmido recuperado indicó que el plásmido utilizado tiene un tamaño esperado de ADN pUC19, 2.686 pares de bases.

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