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噬菌体转导:将氨基青霉素耐药性从捐赠者转移到受体大肠杆菌的方法
 

噬菌体转导:将氨基青霉素耐药性从捐赠者转移到受体大肠杆菌的方法

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细菌可以通过交换遗传物质快速适应快速变化的环境,而它们能够做到这一点的一种方法是通过转导,即通过细菌病毒中介的遗传物质交换。噬菌体通常缩写为噬菌体,是一种病毒,它通过先附着在宿主表面,然后将其DNA注入细菌细胞来感染细菌。然后,它降解宿主细胞自身的DNA并复制其病毒基因组,同时劫持细胞的机械来合成其蛋白质的多个副本。这些噬菌体蛋白然后自我组装和包噬菌体基因组形成多个后代。然而,由于DNA包装机制的保真度低,偶尔,噬菌体将细菌DNA片段包裹到噬菌体囊中。诱导宿主的裂解后,噬菌体后代被释放,一旦这种噬菌体感染另一个宿主细胞,它转移其前宿主的DNA片段。然后,这可以重新组合,并永久地融入到新宿主的染色体中,从而调解两种细菌之间的基因转移。

在实验室中进行噬菌体转导需要含有感兴趣的基因的供体菌株、缺乏该基因的受体菌株、可同时感染该菌株的噬菌体以及选择转导细菌的方法。在大多数情况下,这将是一种选择性的固体生长介质,支持转导细菌的生长,但抑制非转导细菌的生长。首先,含有感兴趣的基因的供体菌株在液体生长培养基中培养。当所有细菌在其生长的日志阶段积极分裂时,培养菌被接种为目标噬菌体。经过三到四个小时的孵育,当几乎所有的细菌都解毒并释放噬菌体颗粒时,供体噬菌体解毒物被接种到刚生长的受体细菌菌株中。经过一个小时的短暂孵育后,培养物现在应包含转导和非转导细菌细胞的混合物,通过将悬浮液的一小部分扩散到适当的选择性固体生长介质上,对转导细胞进行筛选。进一步孵育后,转导细胞应生长和繁殖,以产生可见的菌落。然后,可以使用各种方法选择这些菌落进行进一步分析,以进一步确认成功的转导,如菌落 PCR、DNA 测序或定量 PCR。

在开始手术之前,请穿上任何适当的个人防护装备,包括实验室外套和手套。接下来,用 70% 乙醇对工作空间进行消毒,然后擦拭表面。

在此之后,准备三个一毫升的LB盐溶液等分。现在,通过在含有5毫升LB生长介质和500微克阿霉素的15毫升锥形小瓶中加入100微升大肠杆菌,制备供体菌株培养。然后,在 37 摄氏度的温度下一夜之间生长,在 220 rpm 下进行曝气和摇动。第二天,用70%乙醇擦拭台面,然后从摇动的培养箱中取出培养体。接下来,通过在990微升的新鲜LB中加入10微升的供体菌株,将过夜培养物稀释1至100升,并辅以盐溶液。

允许细菌稀释在37摄氏度下生长两小时,在220rpm下曝气和摇动。一旦细胞达到早期对数阶段,从培养箱中取出培养体,向培养中加入40微升的P1噬菌体,然后再次孵育。继续监测细胞一至三个小时,直到培养体被感染。接下来,在流合物中加入50至100微升氯仿,然后涡旋混合。然后,将液前液离心机以清除碎屑并将上清液转移到新管中。在上清液中加入几滴氯仿,并将其储存在摄氏四度,不超过一天。

要开始转导程序,获得一毫升培养的受体菌株。接下来,将100微升的供体噬菌体解结到1.5毫升微离心管中,在37摄氏度的温度下孵育,盖打开30分钟,使任何剩余的氯仿蒸发。当供体噬菌体孵育时,通过温和的离心颗粒受体应变细胞。丢弃上清液,将细胞颗粒重新悬浮在含有100毫摩尔硫酸镁和5毫摩尔氯化钙的300微升新鲜LB中。

接下来,在微离心管中结合100微升的受体菌株和100微升的供体噬菌体流解酶,建立转导反应。然后,将100微升的受体菌株和100微升的LB与硫酸镁和氯化钙结合,建立负控制。孵育后,在两根管中加入200微升的柠酸柠酸柠二酸柠子钠和一毫升LB,然后轻轻上下移液混合。然后,在管子孵育一小时后,通过离心轻轻颗粒细胞。

离心后,丢弃上清液,用100毫摩尔柠酸钠将颗粒细胞重新悬浮在100微升的LB中。将溶液和移液器整个转导样品移至带 1 倍氨基环比的 LB 琼脂板上。最后,将负控制细胞混合物的整个体积移至无阿霉素的LB琼脂板上。在37摄氏度的温度下孵育板后,使用无菌移液器尖端从转导板中挑选三到四个菌落,并将其条纹到含有1倍氨化素和100微升1摩尔柠子酸钠的新LB琼脂板上。重复这种电镀方法,在另一个LB琼脂板上进行负控制,其中仅含有100微升的一摩尔柠酸钠。然后,在37摄氏度的温度下孵育板,让无噬菌体的菌落生长。

第二天,用70%乙醇擦拭台面,然后再从培养箱中取出盘子。使用无菌移液器尖端,从转导板上挑选三个菌落,并把它们分别添加到包含五毫升LB介质的独立管中。然后,从负控制板中选择三个菌落,并将其添加到另一个含有五毫升LB介质的管中。在 37 摄氏度下生长,在 220 rpm 下曝气和摇动。按照先前演示的对台面进行消毒后,使用 DNA 微型试剂盒根据制造商的说明从每种培养物的 4.5 毫升中分离出 DNA。然后,用35微升无核酸酶水对DNA进行洗脱,并通过实验室分光光度计测量产生的浓度。最后,通过将剩余的0.5毫升两种细菌溶液加入0.5毫升100%甘油来制备甘油。

为了确认转导,首先为24 qPCR反应准备两个qPCR主混合物。对于第一个主混合物,将150微升的qPCR缓冲液混合加入微离心管中,将12微升分别加入用于扩增环素抗性基因的正向和反向引液。接下来,通过将 150 微升 qPCR 主混合物添加到微离心管中,然后加入 12 微升的正向引物和反向底漆,以放大内务基因,制备第二个 qPCR 主混合物。

对于每个qPCR反应,将每个反应的100微克实验DNA与14.5微升的qPCR主混合物混合。现在,准备之前演示的其余反应。将反应转移到预热的热循环器,温度升高至 94 摄氏度,然后启动程序。最后,使用qPCR生成的周期定量值(Cq)计算氨基林抗性基因的正化转导效率。

对每个阴性对照和转导样本的周期定量(Cq)值进行了表格。低 Cq 值(通常低于 29 个周期)(如本示例中的转导样本)表示目标序列的含量很高。

内务管理基因,也在这里表格,被用作负载控制,以标准化每个反应的DNA量,并作为一个积极的控制,以确保qPCR的工作。如果加载相同数量的内务基因,则在每个样本中,它以相对相同的速率被发现。

接下来,要计算每个样本的增量 Cq 值,从相应目标基因的 Cq 值中减去每个样本的内务管理基因的 Cq 值。例如,第一个负控制数的增量 Cq 为 13.54。然后,使用此值使用此处所示的公式计算每个样本的规范化转导效率。最后,计算了每个样本组的平均归一化转导效率。

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