Malpighian Tubule Dissectie van een Volwassen Vlieg: Het isoleren van een Osmoregulatory en Excretory Orgaan

- Begin met een verdoofde volwassen vlieg in een ontledende schotel. Houd de vlieg bij de thorax met een tang en open het achterste uiteinde van de buik met behulp van een tweede paar tangen. Aangezien volwassen vliegen twee paar malpighiaanse tubuli of MT's hebben die via gewone urineleiders op de darm convergeren, sleept u de achterste darm uit de vlieg om de MTs los te laten. Het achterste paar MT's wordt eerst bevrijd terwijl ze omcirkelen.

Om de tubuli te monteren, schuift u een glazen staaf onder de ureter en brengt u de MT's over naar een poly-L-lysine-gecoate glijbaan. Breng de ontlede organen aan door de ureter naar beneden te drukken en veeg de staaf vervolgens voorzichtig over de MT's. De poly-L-lysine op de dia zal de bevestiging bevorderen door het aantal positief geladen plaatsen te verhogen dat beschikbaar is voor de negatief geladen cellen van de tubuli om te binden.

- Om deze procedure te starten, plaatst u twee sets soldeer-helpende handenklemmen op het stadium van de beeldmicroscoir met één klem aan elke kant. Plaats vervolgens de respectievelijke gebogen glazen haarvaten in de instroomlijn en de vacuüm-verbonden uitstroomlijn. Monteer ze vervolgens in de helpende handen. Lijn ze vervolgens uit met de beeldvormingsfase van de microscoop.

Smeer vacuümvet op de plafondtape en druk de zelfklevende perfusieputverdeler op de tape om de bodem met vet te bedekken. Verwijder de zelfklevende perfusieputverdeler en plaats deze vetzijde naar beneden bovenop een poly-L-lysine-gecoate glijbaan. Verwijder daarna de perfusieputverdeler om individuele monsterputten in hydrofoob vet te laten traceren. Plaats daarna 200 microliters kamertemperatuur iPBS of Insect Fosfaat Gebufferde Zoutoplossing in het vet dat goed is omcirkeld op de poly-L-lysine-gecoate glijbaan. en breng er een enkele verdoofde vrouwelijke vlieg naar over.

Houd de vlieg bij de thorax met de set tangen en gebruik de andere om de achterste buik voorzichtig vast te pakken. Trek het achterste uiteinde van de vlieg open in korte, opzettelijke bewegingen. Zodra de achterste darm zichtbaar is, grijpt u het distale uiteinde vast en bevrijdt u de darm en MTs van de onderliggende luchtpijpen door de achterste darm van het lichaam weg te trekken door repetitieve, korte sleepboten.

Knijp vervolgens de binnenste MT's aan de ureter af met een fijne tang zodra de tweede set MT's vrij is van de buik. Pak de vrije voorste MT's op met de getrokken glazen staaf door de staaf onder de ureter te schuiven, zodat de tubuli naar beide kanten vallen. Til daarna de MT's recht omhoog uit de oplossing. Draai daarna de glazen staaf zodanig dat de MT's en ureter aan de onderkant van de staaf worden vastgekleefd.

Laat de ureter recht naar beneden zakken op de glijbaan. Bevestig vervolgens de volgorde en afdichting van de distale lens van de MT's door de ureter verder op de glazen glijbaan te drukken. Gebruik het fijne uiteinde van de glazen staaf om elke buis voorzichtig over het glijbaanoppervlak te vegen. Zet de staaf tegen de glijbaan om te voorkomen dat de buis wordt verbrijzeld en schuif de staaf over de bovenkant van de buis, van distaal naar proximaal om de volledige lengte van elke buis aan het oppervlak van de poly-L-ly te bevestigen.

- Het succes van deze techniek hangt volledig af van nauwkeurige identificatie en zorgvuldige behandeling van de voorste malpighian tubuli. Beschadigde tubuli zullen inconsistente resultaten opleveren.

- Plaats vervolgens de zelfklevende perfusieputverdeler terug op de glijbaan om een kleine met vloeistof gevulde put over de gemonteerde buis te vormen. Plaats daarna het monster op het microscoopstadium. Plaats de in- en uitstroomcapillairen respectievelijk over de inlaat- en uitlaatopening van de perfusieput.