Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Start med en dråbe bufferopløsning på et mikroskopsjebane og overfør intakte orme til dråben. Når ormene er på plads, skal du bruge et fnugfrit væv til at opsuge og fjerne bufferen.
Når ethanolen er fordampet efter den endelige skylning, tilsættes en opløsning, der indeholder nukleinsyrefarvet DAPI, til prøven. DAPI binder sig fortrinsvis til adenin- og thyminbaser i den mindre rille af DNA. Når det er bundet, absorberer DAPI-DNA-komplekset UV-lys og udsender synligt blåt lys.
Derefter tilsættes et anti-fade konserveringsmiddel for at forlænge prøvens holdbarhed. Påfør et dækslet slip og forsegle det til diaset. Brug derefter et fluorescerende mikroskop med et blåt filter til at visualisere DAPI-kroppe, som afhængigt af cellen og dens cyklusstatus kan repræsentere enkelte kromosomer, søsterkromatiske par eller hele kerner. I dette eksperiment tæller vi DAPI farvede søsterkromatiske par i oocytter for at identificere tetraploid stammer af Caenorhabditis elegans.
- Tetraploid stammer har 12 kromosompar, som kan valideres ved at tælle DAPI farvede kroppe i ubefrugtede oocytter. For at gøre det, drop fem til ti mikroliter af M9 buffer på et dias og overføre seks til 10 formodede tetraploider i drop. Under et dissekerende mikroskop, omhyggeligt opsuge det meste af M9 i en fnugfri rengøring væv.
Så drop 10 mikroliter af 90% ethanol på ormene og se ethanol fordampe helt. Så snart fordampningen er færdig, gentag processen med at tilføje ethanol og se det fordampe. I alt tilsættes 10 mikroliter i fire applikationer. Efter den sidste dråbe fordamper, tilsæt seks mikroliter AF DAPI på to nanogram pr mikroliter, eller en lignende plet.
Til langtidsopbevaring af rutsjebanerne skal ormene monteres i en kommercielt tilgængelig eller hjemmelavet anti-fade. Tilsæt derefter en coverlip og forsegl kanterne med neglelak. Efter neglelakken er tørret, kan diasene scores. Brug et fluorescerende mikroskop og 100 x forstørrelse.
Først skal du finde den mest modne ubefrugtede oocyt, som er umiddelbart ved siden af spermatheca, og har endnu ikke indtastet hverken spermatheca eller livmoderen. DAPI organer her er formentlig enkelt kromosom par. Næste, fokusere på kernen i oocyt og bruge mikroskop fine fokus til langsomt at scanne det, fra top til bund, mens tælle DAPI organer. Derefter fortælle DAPI organer i samme kerne ved at flytte fokus fra bund til top.
Vilde type oocytter har seks DAPI-kroppe i gennemsnit. Tilstedeværelsen af 12 DAPI-kroppe indikerer, at dyrene i denne stamme enten er delvise eller komplette tetraploider. Analyser mindst 10 dyr pr. Stamme. Ofte vil kromosompar være meget tæt eller rørende, så antallet af DAPI-kroppe ofte er mindre end det faktiske antal kromosompar.
