Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- התחל עם טיפה של פתרון חיץ על שקופית מיקרוסקופ ולהעביר תולעים שלמות לטיפת.
לאחר שהאתנול התאדה לאחר השטיפה הסופית, הוסף פתרון המכיל את צבע חומצת הגרעין, DAPI, לדגימה. DAPI נקשר באופן מועדף לבסיסי אדנין ותימין בחריץ הקטין של ה- DNA. כאשר הוא מאוגד, קומפלקס ה- DAPI-DNA סופג אור UV ופולט אור כחול נראה.
לאחר מכן הוסיפו חומר משמר נגד עמעום כדי להאריך את חיי המדף של הדגימה. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנן כחול כדי לדמיין גופי DAPI, אשר, בהתאם לתא ומצב המחזור שלו, יכול לייצג כרומוזומים בודדים, זוגות כרומטידים אחות, או גרעינים שלמים. בניסוי זה, נספור DAPI מוכתם אחות זוגות כרומטיד ביציות, כדי לזהות זנים tetraploid של caenorhabditis elegans.
- זני Tetraploid יש 12 זוגות כרומוזום, אשר ניתן לאמת על ידי ספירת גופים מוכתמים DAPI ביציות לא מופרות.
ואז טיפה 10 microliters של 90% אתנול על התולעים ולראות אתנול להתאדות לחלוטין. ברגע האידוי מסתיים, לחזור על התהליך של הוספת אתנול ולצפות בו להתאדות. בסך הכל, להוסיף 10 microliters בארבעה יישומים. לאחר הטיפה האחרונה מתאדה, להוסיף שישה מיקרוליטרים של DAPI בשני ננוגרם לכל microliter, או כתם דומה.
לאחסון ארוך טווח של השקופיות, הר את התולעים במיקרוסקופ פלואורסצנטי זמין מסחרית או תוצרת בית.
ראשית, למצוא את ביצית לא מופרית הבוגרת ביותר, אשר מיד בסמוך spermatheca, ועדיין לא נכנס גם spermatheca או הרחם. גופי DAPI כאן הם ככל הנראה זוגות כרומוזום יחיד. הבא, להתמקד בגרעין של ביצית ולהשתמש המיקוד העדין של המיקרוסקופ כדי לסרוק אותו לאט, מלמעלה למטה, תוך ספירת גופי DAPI.
ביציות מסוג בר יש שישה גופי DAPI בממוצע. נוכחותם של 12 גופי DAPI מצביעה על כך שבעלי החיים בזן זה הם טטרפלואידים חלקיים או מלאים.
