Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Placer un ver transgénique exprimant le GCaMP - une protéine de détection du calcium - dans une chambre d’imagerie avec des aliments bactériens pour le ver. Puis sceller le plat avec le couvercle et le film de laboratoire pour prévenir l’évaporation. Le voir sous un microscope composé équipé pour l’épifluorescence à large champ. Enregistrer les images en accéléré des vers pour suivre leur comportement et capturer la fluorescence à l’aide d’un logiciel d’imagerie.
Les vers transgéniques expriment une protéine de capteur GCaMP sous le contrôle d’un promoteur qui conduit l’expression du GCaMP dans un neurone spécifique. Lorsque ce neurone est activé, il déclenche un potentiel d’action, qui dépolarise la membrane plasmatique. Lors de la dé polarisation, des canaux calciques à barrière de tension s’ouvrent dans la membrane plasmatique. Cela provoque un afflux d’ions calcium dans la cellule, entraînant une excitation neuronale.
Le GCaMP dans le neurone excité lie les ions calcium. Cela provoque la fluoration du GCaMP lorsque les vers sont photographiés avec une lumière d’excitation de fluorescence de faible intensité. Dans le protocole d’exemple, nous utiliserons l’imagerie calcique pour visualiser l’activité interneurone d’AVA chez les C. elegans transgéniques dans les microchambres agarose.
- L’imagerie calcique est effectuée sur un microscope composé équipé pour l’épifluorescence à large champ. Pour limiter l’exposition à la lumière, utilisez un signal logique transistor-transistor qui déclenche une LED pour éclairer l’échantillon en même temps que la caméra enregistre un cadre.
Exécutez un film éclaté pendant 24 heures qui images chaque ver toutes les 15 à 30 minutes. Tout d’abord, enregistrer 20 secondes avec DIC, puis 20 secondes avec la fluorescence GFP, et enfin, une image du signal mKate2 pour les niveaux d’expression de contrôle.
Pour l’inspection visuelle des données, utilisez une fausse carte des couleurs pour améliorer la visibilité des petits changements dans l’intensité de la fluorescence. Enfin, effectuez une analyse des données calciques à l’aide de procédures normalisées.
