Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Platzieren Sie einen transgenen Wurm, der GCaMP exezient-- ein Kalzium-Sensing-Protein -- in eine bildgebende Kammer zusammen mit bakteriellen Lebensmitteln für den Wurm. Dann versiegeln Sie die Schale mit dem Deckel und Laborfilm, um Verdunstung zu verhindern. Sehen Sie es unter einem zusammengesetzten Mikroskop für Weitfeldepifluoreszenz ausgestattet. Zeichnen Sie Zeitrafferbilder der Würmer, um ihr Verhalten zu verfolgen und Fluoreszenz mit Bildgebungssoftware zu erfassen.
Transgene Würmer drücken ein GCaMP-Sensorprotein unter der Kontrolle eines Promotors aus, der die GCaMP-Expression in einem bestimmten Neuron antreibt. Wenn dieses Neuron aktiviert wird, feuert es ein Aktionspotential aus, das die Plasmamembran depolarisiert. Bei der Depolarisation öffnen sich spannungsgebundene Kalziumkanäle in der Plasmamembran. Dies verursacht einen Zustrom von Kalziumionen in die Zelle, was zu einer neuronalen Erregung führt.
GCaMP im angeregten Neuron bindet die Calciumionen. Dies bewirkt, dass GCaMP fluoreszierend wird, wenn die Würmer mit einem fluoreszenzschwachen Fluoreszenz-Erregungslicht mit geringer Intensität abgebildet werden. Im Beispielprotokoll werden wir Die Calcium-Bildgebung verwenden, um die AVA-Interneuron-Aktivität in transgenen C. Eleganen in Agarose-Mikrokammern zu visualisieren.
- Die Calcium-Bildgebung wird auf einem zusammengesetzten Mikroskop durchgeführt, das für die Weitfeldepifluoreszenz ausgestattet ist. Um die Lichtexposition zu begrenzen, verwenden Sie ein Transistor-Transistor-Logiksignal, das eine LED auslöst, um die Probe gleichzeitig zu beleuchten, während die Kamera einen Rahmen aufzeichnet.
Führen Sie einen geplatzten Film für 24 Stunden, die jeden Wurm alle 15 bis 30 Minuten bilder. Zuerst nehmen Sie 20 Sekunden mit DIC, dann 20 Sekunden mit GFP Fluoreszenz, und schließlich, ein Bild des mKate2-Signals für Steuerausdruckspegel.
Verwenden Sie für die visuelle Dateninspektion eine falsche Farbkarte, um die Sichtbarkeit kleiner Änderungen der Fluoreszenzintensität zu verbessern.
