Ablation ciblée du foie : Induire la mort des hépatocytes avec le métronidazole chez les larves transgéniques de poisson zèbre

- Dissoudre le métronidazole dans l’eau des œufs contenant du DMSO, un solvant, et ajouter la phénylthiourea, qui empêche la formation de pigments chez les embryons. Transférer quelques larves de l’âge approprié aux plaques de traitement et de contrôle. Ensuite, ajoutez la concentration désirée de la solution métronidazole à la plaque d’essai et à l’eau des œufs contenant du DMSO à la plaque de contrôle.

Laissez les larves dans les deux plaques croître à 28 degrés Celsius. Les larves transgéniques ne produisent de la nitroréductase que dans les hépatocytes, ce qui convertit le métronidazole en un médicament cytotoxique, entraînant la mort des hépatocytes ciblés. Après le traitement, retirez la solution de métronidazole de la plaque de traitement et lavez les embryons avec de l’eau d’œuf.

Ajoutez de la tricaine pour anesthésier les larves et examinez-les au microscope d’épifluorescence pour l’ablation sévère des hépatocytes - la destruction des cellules hépatiques. Vous observerez un foie beaucoup plus petit chez les individus traités que chez les individus du groupe témoin. Dans le protocole de l’exemple, nous utiliserons le métronidazole pour l’ablation des hépatocytes chez les larves transgéniques de poisson zèbre pour étudier la régénération hépatique.

- Transférer jusqu’à 100 embryons dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 25 millilitres d’eau d’œuf et placer le plat à 28 degrés Celsius. Pour inhiber la pigmentation, ajouter de la PTU à la culture jusqu’à 10 heures après la fécondation. À 80 heures après la fécondation, anesthésier les larves avec de la tricaine et utiliser un microscope à épifluorescence pour recueillir les larves positives de la PCP, en ne gardant que les animaux ayant des foies de taille similaire.

Remplacez ensuite l’eau des œufs de tricaine par de l’eau d’œuf frais complétée par la PTU et retournez les larves positives de poisson zèbre de la PCP à l’incubateur de 28 degrés Celsius. Pour traiter les larves de poisson zèbre avec du MTZ, divisez d’abord le nombre approprié de larves en deux récipients de culture différents. Gardez le groupe expérimental de larves dans une solution de MTZ fraîchement préparé et le groupe témoin dans l’eau d’oeuf complétée par DMSO.

couvrir le expérimental groupe avec aluminium fleuret À empêcher photo Inactivation de le MTZ (en) et couver les deux groupe de poisson zèbre larve à 28 Degrés Celsius. à le fin de le ablation période enlever le MTZ (en) solution De le Plaques et laver le Traité par MTZ lave Deux À Trois fois avec 25 Millilitres de eau d’oeuf et tourbillonnant Jeter le oeuf Eau après chaque laver. après le dernier laver immobiliser le larve avec moitié le concentration de tricaine (tricaine) auparavant utilisé À éviter cœur œdème et mort dans le Traité par MTZ larve. alors utiliser le Cfp filtre sur un épifluorescence microscope À évaluer le hépatocyte ablation Niveaux Basé sur le parent foie taille de le Traité par MTZ lave. considérer le poisson zèbre avec grand Foies Représentant 0% À 5% de le larve À Bve non ablated, ces avec Douleur moyenne Taille Foies Représentant 10% À 20% de le larve À Bve partiellement ablated, et ces avec très petit Foies Représentant 80% À 90% de le larve À Bve complètement ablated.