India Ink Inflation: un metodo di colorazione per visualizzare i noduli tumorali

Inizia posizionando un lato ventrale del topo eutanasiato su un letto chirurgico e fissando gli arti dell'animale. Usando le forbici, tagliare lungo la linea mediana attraverso la gabbia toracica fino alle ghiandole salivari. Posizionare una punta di pipetta sotto la trachea per elevarla e isolarla. Ruotare il letto chirurgico di 180 gradi. Inserire un ago della siringa contenente una macchia d'inchiostro dell'India nella trachea e iniettare l'inchiostro nei polmoni fino a quando non si sente resistenza.

Le cellule tumorali secernono una grande quantità di acido lattico che genera una forte carica negativa sulla superficie cellulare. Quando queste cellule sono macchiate di inchiostro indiano, una macchia acida, la superficie cellulare respinge la macchia e rimane non macchiata.

Usa le forbici per tagliare la trachea e far scivolare un paio di pinzette sotto i polmoni. Estrarre delicatamente i polmoni dal corpo dell'animale. Risciacquare i polmoni in acqua e trasferirli in una fiala contenente la soluzione di Fekete per rimuovere la macchia in eccesso e fissare il tessuto in una cappa aspirante. I noduli tumorali appaiono bianchi sullo sfondo scuro.

Nel seguente protocollo, eseguiremo la tecnica di inflazione dell'inchiostro indiano per convalidare la metastasi polmonare.

Per convalidare la metastasi del tumore primario al polmone, posizionare prima il topo in posizione supina su una tavola di polistirolo e fissare le gambe per garantire un accesso senza ostacoli alla trachea. Spruzzare il topo con il 70% di etanolo. Quindi, usa un paio di forbici per fare un'incisione lungo la linea mediana dell'addome medio del topo attraverso la gabbia toracica e verso le ghiandole salivari. Identificare la trachea. Quindi, utilizzare le forcelle per rimuovere i tessuti circostanti.

Successivamente, tenendo una punta di pipetta in una mano, infilare la punta sotto la trachea e sollevare delicatamente il tessuto su e lontano dal corpo. Mantenendo la trachea elevata, ruotare la piattaforma di sezionatura di 180 gradi. Quindi, inserire una siringa tubercorina di mezzo cc calibro 27 nella trachea e gonfiare completamente i polmoni con inchiostro indiano fino a quando non si sente una forte resistenza.

Quindi, usando un paio di forbici, tagliare la trachea. Tenendo il mouse in posizione con una forza, inserire un'altra forza sotto i polmoni ed estrarre i lobi polmonari dal mouse. Risciacquare brevemente i polmoni in un bicchiere d'acqua e trasferire il tessuto in una cappa aspirante. Quindi, posizionare i polmoni in una fiala a scintillazione di vetro contenente 3 millilitri della soluzione di Fekete, tappando il flaconcino per evitare che la soluzione evapori. Dopo alcuni minuti, trasferire i polmoni in una piastra di Petri e contare il numero di noduli tumorali singoli, bianchi e metastatici.